基于比較轉(zhuǎn)錄組的水稻苗期耐冷相關(guān)基因BGIOSGA032296 TALEN基因組編輯技術(shù)構(gòu)建

沈春修

( 宜春學(xué)院 生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西 宜春 336000)

基于比較轉(zhuǎn)錄組的水稻苗期耐冷相關(guān)基因BGIOSGA032296 TALEN基因組編輯技術(shù)構(gòu)建

沈春修

( 宜春學(xué)院 生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西 宜春 336000)

為了挖掘水稻苗期耐冷基因，基于比較轉(zhuǎn)錄組分析，參考公共數(shù)據(jù)庫中的基因序列信息設(shè)計靶位點，對冷脅迫條件下東鄉(xiāng)野生稻苗期下調(diào)表達耐冷相關(guān)基因BGIOSGA032296 進行TALEN基因組編輯技術(shù)構(gòu)建，克隆酶切鑒定和序列比對結(jié)果表明，BGIOSGA032296 TALEN敲除植物表達載體1301TALEN-032296構(gòu)建成功，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將TALEN敲除植物表達載體1301TALEN-032296轉(zhuǎn)入水稻受體品種TP309，獲得了17株轉(zhuǎn)基因水稻植株，經(jīng)潮霉素抗性標記基因和FokI基因特異引物PCR檢測，表明獲得的轉(zhuǎn)基因植株皆為攜帶1301TALEN-032296的陽性植株。該研究為水稻BGIOSGA032296基因后續(xù)耐冷表型鑒定奠定了前期基礎(chǔ)。

比較轉(zhuǎn)錄組；東鄉(xiāng)野生稻；TALEN基因組編輯技術(shù)

水稻發(fā)源于熱帶和亞熱帶氣候地區(qū)，對低溫冷害特別敏感，在我國不同的水稻種植區(qū)，水稻的生長發(fā)育階段經(jīng)常會受到低溫冷害的不利影響，低溫冷害已經(jīng)成為制約水稻產(chǎn)量和種植面積最主要的環(huán)境因素，轉(zhuǎn)基因技術(shù)被認為是改善水稻耐冷性的重要途徑，然而，對于轉(zhuǎn)基因策略而言，一個重要的前提是要克隆和鑒定出大量能夠提高水稻耐冷性的耐冷基因。

基因的過表達分析和基因沉默(RNAi)是目前進行未知基因功能鑒定的2種最主要的方法，通過構(gòu)建基因的過表達載體已經(jīng)從水稻中鑒定了OsMYB3R-2[1]、Osmyb4[2]、OsTPS1[3]、microRNA319[4]和OsDREB1F[5]等一些水稻耐冷基因，而傳統(tǒng)的基因沉默(RNAi)技術(shù)由于存在脫靶效應(yīng)以及對基因的表達干擾不徹底等缺陷，在很大程度上限制了其在基因功能鑒定方面的應(yīng)用，因此，迫切需要具有更高?；院透兔摪蓄l率的新基因組編輯技術(shù)來彌補這一不足，TALENs(Transcription activator-like(TAL)effector nu-cleases)基因組編輯技術(shù)正好迎合人們的這一期望，TALENs 基因組編輯技術(shù)是近年來發(fā)展的一種嶄新的靶向基因敲除技術(shù)，該技術(shù)2012年12月被 Science 雜志評為年度十大科學(xué)進展之一[6]，TALENs技術(shù)的設(shè)計和構(gòu)建是基于植物病原體黃單胞菌(Xanthomonas)分泌的一種轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)因子對DNA序列能夠進行特異性識別的原理[7-9]。TALEN蛋白的核酸結(jié)合域的氨基酸序列與其結(jié)合的靶位點的核苷酸序列有恒定的對應(yīng)關(guān)系，由34個氨基酸重復(fù)序列組成一個單元，識別一個特定的核苷酸[10-11]，因此，利用TAL的序列模塊可以組裝成能夠特異結(jié)合任意DNA序列的模塊蛋白。TALEN是由TALEN蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與FokⅠ內(nèi)切酶的切割結(jié)構(gòu)域連接而成的嵌合酶，能夠在DNA鏈特定位點造成雙鏈斷裂(DSB)[12]，而DSB能夠激活細胞內(nèi)固有的非同源末端連接(Non-homologous end joining，NHEJ)或同源重組(Homologous recombination，HR)機制，對損傷的DNA進行修復(fù)[13-15]。其中NHEJ 是一種相對較為簡單的修復(fù)方式，保真度不高，很容易造成DNA斷裂處修復(fù)之后的序列發(fā)生改變，導(dǎo)致DNA的小片段插入或缺失(Indel)，從而造成基因突變。TALENs基因組編輯技術(shù)因不受任何基因序列、細胞以及物種的限制，且試驗操作相對簡單、成本消耗低，近年來，TALENs靶向基因敲除技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于動物(人類、家畜、鼠、斑馬魚、爪蟾、家蠶)[16-21]、植物(煙草、水稻、短柄草、擬南芥)[9，22-23]以及微生物(酵母、病毒)[13，24]等的功能基因研究。并取得了一定的成效。

基于前期比較轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果[25]，本研究利用TALENs基因組編輯技術(shù)，對在冷敏感水稻93-11中冷處理前后無差異表達，而在耐冷東鄉(xiāng)野生稻中表達量顯著下調(diào)的耐冷相關(guān)基因BGIOSGA032296于同樣具有較強耐冷性的水稻受體品種TP309中實施TALEN靶向基因敲除，旨在為水稻苗期耐冷相關(guān)基因BGIOSGA032296后續(xù)的突變體植株篩選及其耐冷表型鑒定奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 水稻轉(zhuǎn)基因受體材料為粳稻(OryzasativaL.japonica)品種TP309，以其幼胚作為外植體。

1.1.2 載體與菌株 TALEN左右臂骨架載體(L20和R16)(圖1，2)、植物雙元表達載體1301-nos由上海斯丹塞公司提供，大腸桿菌感受態(tài)細胞Trans5α購自全式金生物公司，農(nóng)桿菌菌株EHA105由江西省作物生長發(fā)育調(diào)控實驗室保存。

圖1 TALEN左臂骨架載體L20示意圖

圖2 TALEN 右臂骨架載體R16示意圖

1.1.3 主要試劑 植物TALEN試劑盒購自上海斯丹塞公司(溶液1、溶液2、溶液3、溶液4、溶液5、TALEN模塊、SOC、感受態(tài)細胞、TALEN左右臂骨架載體L20和R16)；KOD高保真DNA聚合酶購自TOYOBO公司；分子量標記DL15000、DL2000購自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶購自Fermentas公司；T4DNA連接酶、質(zhì)粒提取試劑盒Easypure?Hipure Plasmid Miniprep Kit，購自全式金生物公司；引物由深圳華大基因技術(shù)有限公司合成；其余組織培養(yǎng)試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 TALEN左、右臂識別序列設(shè)計 按照上海斯丹塞公司的植物TALEN試劑盒說明中的TALENs設(shè)計原則，在BGIOSGA032296的第2個外顯子內(nèi)設(shè)計1對TALEN左、右臂識別序列(表1)。

1.2.2 TALEN模塊與左、右臂骨架載體分別連接 將左、右臂識別序列的最后一位堿基T去除，以1個或2個堿基組合為1個模塊，把首個堿基標記為1，最后一個堿基標記為9，依次類推進行標記。按標記方式于試劑盒的模塊中選擇相對應(yīng)編號的模塊，具體操作按上海斯丹塞TALEN試劑盒使用說明書進行。

表1 BGIOSGA032296 TALEN左、右臂設(shè)計

1.2.3 TALEN敲除表達載體轉(zhuǎn)化水稻受體品種 使用電穿孔法將過敲除載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞中，借助農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化水稻受體品種TP309，培養(yǎng)基配方及具體操作參照李丁[26]的方法進行。

1.2.4 引物設(shè)計 參照載體上潮霉素基因和FokⅠ基因序列，利用軟件PrimerPremier5.0設(shè)計特異引物，序列見表2。

表2 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR陽性鑒定引物

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫誘導(dǎo)條件下BGIOSGA032296基因的表達

基于冷敏感水稻品種93-11和耐冷東鄉(xiāng)野生稻在冷處理條件下(4 ℃處理3 d)的轉(zhuǎn)錄組比較分析結(jié)果，本研究獲得了冷處理前后在冷敏感水稻93-11無表達差異(∣log2Ratio∣≥1符合差異表達)，而在東鄉(xiāng)野生稻中表達量下調(diào)倍數(shù)較高的基因BGIOSGA032296(表3)，為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，分別從93-11和耐冷東鄉(xiāng)野生稻幼苗葉片提取總RNA，取4 μg總RNA進行反轉(zhuǎn)錄，以水稻Actin肌動蛋白基因為內(nèi)標，利用半定量RT-PCR方法對BGIOSGA032296在冷脅迫條件下(4 ℃處理3 d)的表達進行了分析，結(jié)果顯示試驗結(jié)果與測序分析結(jié)果一致(圖3)，BGIOSGA032296在冷敏感水稻93-11冷處理前后表達豐度相當，而在耐冷東鄉(xiāng)野生稻中冷處理后表達豐度下調(diào)。

表3 冷處理前后BGIOSGA032296在93-11和東鄉(xiāng)野生稻中的表達情況

注：讀段1、讀段2.冷處理前、后在BGIOSGA032296 位點表達譜測序檢測到的讀段數(shù)目；RPKM1、RPKM2.冷處理前、后的表達量；Ratio.同一基因處理組與對照組的RPKM 的比值。

Note：Read 1 and Read 2 are the read number ofBGIOSGA032296 detected in RNA-seq before and after cold treatment；RPKM1 and RPKM2 are the expression before and after cold treatment；Ratio.Ratio of RPKM of exposure group compared with RPKM of control group．

9311-1.冷處理前在93-11中的表達量；9311-2.冷處理后在93-11中的表達量；DX-1.冷處理前在東鄉(xiāng)野生稻中的表達量；DX-2.冷處理后在東鄉(xiāng)野生稻中的表達量。9311-1.Expression in 93-11 before cold treatment；9311-2.Expression in 93-11 after cold treatment；DX-1.Expression in Dongxiang wild rice before cold treatment；DX-2.Expression in Dongxiang wild rice after cold treatment.

圖3 冷處理前后BGIOSGA032296的表達模式

Fig.3 Expression ofBGIOSGA032296 gene before and after cold treatments

2.2BGIOSGA032296敲除靶位點左、右臂TALEN載體構(gòu)建

2.2.1 重組左、右臂質(zhì)粒載體酶切鑒定 將左臂識別序列5′-CGACCAACTTCCCT-3′的3′端去除最后一個T，其余堿基標記為C1、G2、A3、C4、C5、AA6、CT7、TC8、CC9，根據(jù)選擇的標記方式在試劑盒的模塊中選擇對應(yīng)編號的模塊與試劑盒中已處理好的線性左臂TALEN骨架載體L20進行9個片段的同時連接(TALEN蛋白模塊插入位點為L20的BamHⅠ和SpeⅠ的2個酶切位點之間)，熱激轉(zhuǎn)化后挑取單克隆菌落，重組左臂質(zhì)粒載體使用BamH Ⅰ和SpeⅠ進行雙酶切鑒定，左臂TALEN識別序列為13個堿基，酶切之后正確的陽性克隆應(yīng)出現(xiàn)2條帶，分別為4 850 bp(5 670-820)和2 146 bp(102×13+820)(102 bp為每個堿基對應(yīng)的TALEN蛋白模塊大小，820 bp為同時酶切下來的左臂TALEN骨架載體中BamH Ⅰ和SpeⅠ位點之間的序列)，雙酶切結(jié)果顯示已鑒定到片段大小正確的重組左臂TALEN載體L20-032296(圖4)。右臂識別序列5′-GTGTGTTTCCTTGAT-3′，將3′端最后一個T去除，其余堿基標記為G1、T2、G3、T4、GT5、TT6、CC7、TT8、GA9，根據(jù)選擇的標記方式在試劑盒的模塊中選擇對應(yīng)編號的模塊與試劑盒中已處理好的線性右臂TALEN骨架載體R16進行9個片段的同時連接(TALEN蛋白模塊插入位點為R16的BamH Ⅰ和PstⅠ的2個酶切位點之間)，然后熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取單克隆菌落，重組右臂質(zhì)粒載體使用BamH Ⅰ和PstⅠ進行雙酶切鑒定，右臂TALEN中連接的識別序列為14個堿基，則酶切后正確的陽性克隆應(yīng)該出現(xiàn)2條帶分別為3 782 bp(4 313-531)和1 959 bp(102×14+531)(531 bp為同時酶切下來的右臂TALEN骨架載體中BamH Ⅰ和PstⅠ位點之間的一段序列)，重組質(zhì)粒酶切后電泳結(jié)果顯示已鑒定到片段大小正確的重組右臂TALEN載體R16-032296(圖4)。

2.2.2 左臂TALEN重組克隆測序及序列比對 將酶切鑒定結(jié)果正確的重組質(zhì)粒送測序，并與設(shè)計的標準序列進行比對，根據(jù)每個堿基對應(yīng)的TALEN蛋

白模塊包含102個核苷酸序列(34個氨基酸)，左臂TALEN模塊拼接后對應(yīng)的標準核苷酸序列總長為102×13=1 326 bp，在NCBI中選擇tBlastX，將拼接好的標準核苷酸序列與測序序列輸入到對應(yīng)的框中，正向測序序列(Sbjct)與標準序列(Query)的比對(氨基酸比對)結(jié)果表明，左臂TALEN模塊的1-729 bp為100%正確(圖5)，反向測序序列(Sbjct)與標準序列(Query)的比對結(jié)果表明左臂TALEN模塊的388-1 326 bp區(qū)段為100%正確(圖6)。因此，本研究成功構(gòu)建了正確的左臂TALEN載體。得到了正確的重組質(zhì)粒L20-032296。

M.DNA Ladder；1.重組左臂TALEN L20-032296的BamH Ⅰ和SpeⅠ酶切鑒定；2.重組右臂TALEN R16-032296的BamH Ⅰ和PstⅠ酶切鑒定。

M.DNA Ladder；1.Double digestion of recombinant left arm TALEN byBamH Ⅰ andSpeⅠ；2.Double digestion of recombinant right arm TALEN byBamH Ⅰ andPstⅠ.

圖4 L20-032296和R16-032296酶切鑒定

Fig.4 Digestion identification of L20-032296 and R16-032296

圖5 重組質(zhì)粒L20-032296正向測序序列與標準氨基酸序列的比對

圖6 重組質(zhì)粒L20-032296反向測序序列與標準氨基酸序列的比對

2.2.3 右臂TALEN重組克隆測序及序列比對 同樣，對右臂識別序列所對應(yīng)的TALEN蛋白模塊的核苷酸序列進行拼接，右臂TALEN模塊拼接后總長為102×14=1 428 bp，正向測序序列(Sbjct)與標準序列(Query)的比對結(jié)果表明右臂TALEN模塊的1-600 bp為100%正確(圖7)，反向測序反應(yīng)序列(Sbjct)與標準序列(Query)的比對結(jié)果表明右臂TALEN模塊的487-1 428 bp區(qū)段為100%正確(圖8)。表明右臂TALEN載體構(gòu)建成功，得到了正確的重組質(zhì)粒R16-032296。

圖7 重組質(zhì)粒R16-032296正向測序序列與標準氨基酸序列的比對

圖8 重組質(zhì)粒R16-032296反向測序序列與標準氨基酸序列的比對

2.3BGIOSGA032296 TALEN敲除植物表達載體構(gòu)建

TALEN敲除植物表達載體構(gòu)建流程如圖9所示，將測序正確的重組左臂載體(L20重組質(zhì)粒)用Hind Ⅲ和AscⅠ進行酶切，然后電泳回收含有TALEN序列的約5 kb大片段(即3 725 bp+TALEN左臂識別模塊序列)。同時，使用SacⅠ和AscⅠ雙酶切，從構(gòu)建正確的重組右臂載體(R16重組質(zhì)粒)切下含有TALEN序列的約4 kb的大片段(即2 238 bp+TALEN右臂識別模塊序列)，回收。將膠回收得到的TALEN左、右臂DNA片段與經(jīng)Hind Ⅲ和SacⅠ雙酶切后約8 kb的植物表達載體1301-nos的大片段進行三片斷連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞后挑取單菌落，使用Hind Ⅲ和SacⅠ進行雙酶切驗證，酶切電泳后顯示出現(xiàn)了8，5，4 kb的3個條帶，表明BGIOSGA032296的TALEN敲除植物表達載體1301TALEN-032296已經(jīng)構(gòu)建成功(圖10)，質(zhì)粒測序結(jié)果也證實TALEN植物表達載體構(gòu)建正確。

2.4 遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株的PCR陽性檢測

將TALEN敲除植物表達載體1301TALEN-032296的農(nóng)桿菌克隆侵染受體水稻品種TP309的胚性愈傷組織，經(jīng)共培養(yǎng)后、將愈傷組織接入到50 mg/L潮霉素篩選培養(yǎng)基上，進行3～4次篩選獲得抗性愈傷(15 d更換一次篩選培養(yǎng)基)、經(jīng)分化培養(yǎng)和生根培養(yǎng)等試驗過程，TALEN敲除植物表達載體1301TALEN-032296共獲得17株獨立轉(zhuǎn)基因植株，水稻遺傳轉(zhuǎn)化過程如圖11所示。潮霉素抗性標記基因和FokⅠ基因特異引物分子檢測結(jié)果表明，2對引物在所有轉(zhuǎn)基因植株中都擴增出了相應(yīng)的目的條帶，而陰性對照中沒有擴增出對應(yīng)條帶，說明17株轉(zhuǎn)基因植株都為陽性，圖12，13為部分轉(zhuǎn)基因植株的檢測結(jié)果。

3 討論

Agarwal等[27]發(fā)現(xiàn)MYB15轉(zhuǎn)錄因子通過與ICE1基因相互作用負調(diào)控水稻耐冷基因CBF2的表達；Vogel等[28]研究表明鋅指蛋白類轉(zhuǎn)錄因子ZAT12同樣負調(diào)控CBF2基因的表達；Liu等[29]研究也證實水稻耐冷基因OsbZIP52作為一個負調(diào)控因子在冷脅迫條件下起作用?？梢姡苏{(diào)控，水稻在冷脅迫過程中可能通過一些基因的下調(diào)表達(負調(diào)控)增強自身的耐冷性，在本研究中，基于轉(zhuǎn)錄組測序和半定量分析證實BGIOSGA032296冷處理前后在冷敏感水稻93-11中無差異表達，而在耐冷東鄉(xiāng)野生稻中表達量下調(diào)較高，筆者推測在冷脅迫條件下，該基因可能通過負調(diào)控增強東鄉(xiāng)野生稻的耐冷性。因此，本研究通過對BGIOSGA032296于同樣具有較強耐冷性的粳稻品種臺北309中實施TALEN靶向基因敲除，以期為后續(xù)的靶基因突變體耐冷表型鑒定奠定基礎(chǔ)。

圖9 植物表達載體1301TALEN的構(gòu)建流程圖

M.DNA Ladder；1.假陽性 2.重組質(zhì)粒

A.愈傷組織預(yù)培養(yǎng)；B.愈傷組織與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)；C.篩選培養(yǎng)基上長出的抗性愈傷組織；D.抗性愈傷組織的再分化；E.轉(zhuǎn)化植株的生根壯苗。A.Callus preculture；B.Coculture of calli with agrobacterium；C.The resistant callus；D.Resistant calli redifferentiation；E.Rooting of transgenic seedling.

圖11 水稻遺傳轉(zhuǎn)化過程實物圖

Fig.11 The map of rice genetic transformation process

M.DNA Ladder；1.野生型陰性對照；2.1301TALEN-032296質(zhì)粒陽性對照；3～17.轉(zhuǎn)基因植株。

M.DNA Ladder；1.野生型陰性對照；2.1301TALEN-032296質(zhì)粒陽性對照；3～17.轉(zhuǎn)基因植株。

據(jù)蛋白功能注釋(http：//rise2.genomics.org.cn)，BGIOSGA032296編碼一種單加氧酶類化合物，單加氧酶能夠催化有機分子直接加氧，催化反應(yīng)時一個氧原子生成底物，另外一個氧原子則被還原成水，據(jù)報道，植物P450單加氧酶的生物學(xué)功能具有雙重效應(yīng)，一方面起解毒作用，即P450單加氧酶參與物質(zhì)代謝過程中可以將殺蟲劑、除草劑等有毒化合物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無毒害化合物，另一方面起毒性活化作用，即為了抵御外界的侵害而將植物體內(nèi)自身無毒害化合物轉(zhuǎn)化為有毒化合物[30]，這一特性使得單加氧酶在植物的次生代謝方面具有非常廣泛且復(fù)雜的功能。目前，有關(guān)單加氧酶在水稻冷脅迫條件下的作用仍鮮有報道，有待進一步深入研究。

本研究成功構(gòu)建了BGIOSGA032296基因的一個靶位點TALEN敲除載體，然而，在BGIOSGA032296的TALEN敲除植物表達載體的轉(zhuǎn)基因過程中遇到了困難，就是TALEN敲除植物表達載體的農(nóng)桿菌克隆浸染愈傷組織后較難獲得生長良好的抗性愈傷組織(除BGIOSGA032296之外，筆者構(gòu)建的其他一些基因的TALEN敲除植物表達載體也同樣存在這個問題)。由于TALEN技術(shù)是最近幾年才發(fā)展起來的新技術(shù)，尤其在植物中的應(yīng)用較晚，所以這一問題在過去的研究中還未見報道。目前，在植物中，TALEN敲除載體的構(gòu)建，通常是把敲除靶位點的左、右臂TALEN蛋白和Fok核酸剪切酶一起構(gòu)建到一個植物表達載體上，然后通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)導(dǎo)入受體細胞中，所以當TALEN敲除載體導(dǎo)入受體細胞后，TALEN蛋白和Fok核酸剪切酶會持續(xù)起作用對靶位點進行剪切，這樣一來，只要植物細胞沒來得急修復(fù)受損DNA，可能就會出現(xiàn)死亡，所以TALEN敲除植物表達載體在轉(zhuǎn)化過程中可能會對受體細胞表現(xiàn)出較強“致死性”，這有可能是構(gòu)建的TALEN敲除植物表達載體都較難獲得生長良好的抗性愈傷組織的原因，也最終導(dǎo)致獲得的轉(zhuǎn)基因植株較少，沒有檢測到成功實現(xiàn)敲除的突變體植株；而且，由于TALEN蛋白和Fok核酸剪切酶的持續(xù)起作用，即便是靶位點在剪切受損后成功修復(fù)發(fā)生了突變，這種突變也很難穩(wěn)定下來，所以，認為在TALEN植物表達載體的構(gòu)建過程中，可以嘗試使用誘導(dǎo)啟動子系統(tǒng)，誘導(dǎo)啟動子系統(tǒng)優(yōu)點在于可以迅速地表達與否，特別是當外源基因可能對植物產(chǎn)生毒性或其他不良影響時，這一點就顯得尤為重要。對于誘導(dǎo)啟動子系統(tǒng)來說，只有當存在時才能啟動，而去除誘導(dǎo)物后，基因的表達很快可以被關(guān)閉，這樣就可以實現(xiàn)人為地精確、快速控制特定基因的表達，把左、右臂TALEN蛋白基因的其中一個啟動子替換成誘導(dǎo)型啟動子，在轉(zhuǎn)基因過程中，可以在篩選培養(yǎng)基上先添加誘導(dǎo)啟動子表達的誘導(dǎo)劑，待TALEN敲除植物表達載體發(fā)揮作用對靶位點實現(xiàn)剪切后，更換篩選培養(yǎng)基并將篩選培養(yǎng)基上誘導(dǎo)劑撤除，這樣受損部位在修復(fù)后，由于沒有了TALEN蛋白和Fok核酸剪切酶的持續(xù)起作用就可以穩(wěn)定下來，而且，原先TALEN敲除植物表達載體在轉(zhuǎn)化過程中對受體細胞所表現(xiàn)出的持續(xù)剪切容易導(dǎo)致細胞致死的缺陷也將得以改善。

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Construction of TALEN Genome-editing Technique forBGIOSGA032296 Related to Cold Tolerance in Rice Seedling Based on Comparative Transcriptome

SHEN Chunxiu

( College of Life Sciences，Resources and Environment Sciences，Yichun University，Yichun 336000，China)

To dig cold tolerance genes at seedling stage of rice，based on the analysis of comparative transcriptome，TALEN genome-editing technique was constructed forBGIOSGA032296 which was down-regulated in Dongxiang wild rice seedling under cold stress.The analysis of enzyme identification and sequence alignment showed that TALEN knockout plant expression vector 1301TALEN-032296 was constructed successfully.By the agrobacterium-mediated method，the recombination clone 1301TALEN-032296 was transformed into the receptor rice variety TP309.17 transgenic rice plants were obtained.After PCR detection of hygromycin resistance gene andFokIgene，they were found to be positive transgenic plants carrying 1301TALEN-032296.This research laid some basis for subsequent cold resistant phenotype identification.

Comparative transcriptome；Dongxiang wild rice；TALEN genome-editing technique

2016-04-20

國家自然科學(xué)基金項目(31660379)；江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目 (GJJ151039)

沈春修(1979-)，男，湖南溆浦人，講師，博士，主要從事水稻抗逆性研究。

Q78；S513.08

A

1000-7091(2017)03-0013-08

10.7668/hbnxb.2017.03.003