己烯雌酚人工抗原的合成及抗血清的制備

楊興東++胡驍飛+王方雨++曾憲垠

摘要：由己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES）經(jīng)過(guò)一系列化學(xué)反應(yīng)，合成含有1個(gè)羥基活性基團(tuán)的半抗原己烯雌酚-單羧基丙基醚（DES-MCPE）；應(yīng)用活潑酯法，使DES-MCPE與牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)，合成人工免疫抗原DES-BSA和包被抗原DES-OVA，采用紫外分光光度法（UV）和聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進(jìn)行鑒定，初步判定偶聯(lián)成功。用DES-BSA以60 μg/只的劑量免疫3只BALB/c小鼠，4次免疫后，采集血清，使用間接ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA分別測(cè)定抗血清的效價(jià)與抑制，3只小鼠的效價(jià)均可達(dá)到1×104以上，其中2號(hào)小鼠的半抑制率（IC50）為18.221 μg/L，表明已獲得靈敏、特異、高效價(jià)的抗血清。

關(guān)鍵詞：己烯雌酚；完全抗原；人工合成；抗血清；ELISA；高效價(jià)；靈敏

中圖分類(lèi)號(hào)： S852.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）08-0149-03

己烯雌酚（diethylstilbestrol，DES）是一種人工合成的非甾體雌激素，具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高瘦肉率的作用，曾經(jīng)作為促生長(zhǎng)劑在畜禽生產(chǎn)中得到普遍應(yīng)用。但DES對(duì)人類(lèi)有很強(qiáng)的致畸、致癌等毒副作用[1-3]，我國(guó)及大多數(shù)國(guó)家均明確規(guī)定禁止在畜牧養(yǎng)殖中使用DES。為降低動(dòng)物生產(chǎn)成本，不規(guī)范使用己烯雌酚的現(xiàn)象仍然存在。傳統(tǒng)的理化檢測(cè)技術(shù)雖然能夠監(jiān)測(cè)動(dòng)物源性食品中的DES殘留，但其存在用時(shí)長(zhǎng)、費(fèi)用多、程序繁瑣等缺陷，因此急需發(fā)展一種迅速、簡(jiǎn)便、敏感、精確、價(jià)廉的分析方法[4]。本試驗(yàn)旨在合成DES人工抗原和制備抗DES抗血清，為DES殘留血清學(xué)檢測(cè)的建立打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試劑和溶液

DES、4-溴丁酸乙酯，Sigma產(chǎn)品；羥琥珀亞酰胺（NHS）和N，N-二環(huán)己基碳二亞胺（DCC），F(xiàn)luka公司；牛血清白蛋白（BSA）、雞卵清蛋白（OVA），弗氏完全佐劑（FCA）、弗氏不完全佐劑（FIA），Pierce產(chǎn)品；羊抗鼠酶標(biāo)二抗（GaMIgG-HRP），華美生物工程有限公司；二甲基亞砜、乙酸乙酯、二甲基甲酰胺均為AR級(jí)。

ELISA相關(guān)試劑配制：（1）洗液（PBST）：含0.05%的Tween-20的磷酸鹽緩沖液（PBS，0.01 mol/L，pH值為7.4）；（2）間接ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA所用的稀釋液、封閉液均為含50 mL/L豬血清的PBST；（3）包被液（CBS）為 0.05 mol/L pH值9.6的碳酸鹽緩沖液；（4）顯色液為四甲基聯(lián)苯胺（TMB）的醋酸-檸檬酸緩沖液；（5）終止液為2 mol/L的H2SO4溶液。

1.2主要儀器設(shè)備

U-3000紫外掃描儀（UV），日本島津公司；凝膠成像系統(tǒng)及分析軟件，Syngene公司；JM-250電泳儀，大連捷邁科貿(mào)有限公司；Bio-Rad 550型酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Rad公司；超凈工作臺(tái)，美國(guó)Forma Scientific公司；93-3定時(shí)恒溫雙向磁力攪拌器，上海亞榮生化儀器廠；3K-18高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)SIGMA公司；HI9321酸度計(jì)，美國(guó)HANNA公司；Jouan-RC1010z真空濃縮儀，法國(guó)Jouan公司；AE260電子天平，德國(guó)METTLER公司。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)6～8周齡的雌性BALB/c小白鼠，購(gòu)自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。

1.4方法

1.4.1DES人工抗原的合成

1.4.1.1己烯雌酚-單羧基丙基醚（DES-MCPE）的合成（1）精確稱(chēng)量54 mg DES溶于2 mL無(wú)水二甲基亞砜（DMSO），加入27.5 mg無(wú)水K2CO3，在避光條件下，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)1.5 h；（2）加入4-溴丁酸乙酯（C6H11BrO2）17 mg，室溫，避光，攪拌反應(yīng)8 h；（3）反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到10 mL預(yù)冷pH值 2.0 的稀鹽酸溶液中，加入醋酸乙酯（C4H8O2）進(jìn)行萃取，雙蒸水沖洗、放入真空濃縮儀中，抽提有機(jī)溶劑；（4）抽提后的產(chǎn)物加入適量的甲醇（CH3OH）溶液進(jìn)行溶解，再加入 2 mol/L 氫氧化鈉溶液，全部溶解后后，逐滴加入適量的HCl溶液，使溶液pH值在2～4之間，重復(fù)上述分離步驟，C4H8O2萃取，雙蒸水沖洗、真空干燥，得到目標(biāo)產(chǎn)物（DES-MCPE）[5]。

1.4.1.2DES-BSA免疫原、DES-OVA包被原的制備（1）稱(chēng)取DE-MCPE 42 mg溶于2 mL二甲基亞砜（DMSO），將25 mg DCC溶解在0.6 mL無(wú)水二甲基甲酰胺，加入15 mg NHS，暗處、室溫下攪拌反應(yīng)4 h。（2）2 900 r/min離心 5 min，棄去沉淀，收集上清。（3）精確稱(chēng)量BSA 60 mg溶于 2 mL 的pH值8.0的PBS中，冰浴，逐滴加入1 mL無(wú)水二甲基甲酰胺。（4）將上清液緩慢逐滴滴加到BSA溶液中，4 ℃攪拌8 h。（5）將反應(yīng)產(chǎn)物加入透析袋中，透析袋放入盛有 1 000 mL PBS緩沖液的燒杯中，將燒杯轉(zhuǎn)移到4 ℃冷凍室開(kāi)始透析，透析液需每天更換3次，持續(xù)透析3 d。（6）透析完成后，透析袋內(nèi)溶液移入離心管，離心5 min，收集上清液，用1 mL PE管分裝，-20 ℃存放待用。包被原DES-OVA的制備過(guò)程與DES-BSA相同，OVA的劑量為70 mg[6]。

1.4.2DES人工抗原的鑒定

1.4.2.1UV鑒定使用核酸蛋白檢測(cè)儀DES-BSA溶液的質(zhì)量濃度，用PBS配制BSA溶液使其濃度與DES-BSA溶液的濃度相同，用二甲基甲酰胺（DMF）與PBS體積比為4 ∶6的混液配制DES標(biāo)準(zhǔn)溶液，在波長(zhǎng)220～350 nm之間，用紫外吸收法分別測(cè)定上述溶液的特征峰，通過(guò)觀察吸收峰的特征變動(dòng)，判定偶聯(lián)成功與否，依據(jù)Yang等報(bào)道的方法[7]，推算出DES-MCPE分別與BSA、OVA的分子偶聯(lián)比率。

1.4.2.2SDS-PAGE凝膠電泳鑒定電泳溶液的配制依照Guo等的報(bào)道[8]來(lái)進(jìn)行：（1）濃縮膠ω=5%；分離膠ω=12%；濃縮膠電壓65 V；分離膠電壓100 V；（2）加入樣品 20 μL，其中含免疫原3 μg；（3）考馬斯亮藍(lán)染色7～8 h；（4）在脫色液中脫色6～7 h；（5）可以通過(guò)測(cè)定物的分子質(zhì)量的大小、條帶位點(diǎn)的變化能夠判定結(jié)合與否；（6）利用紫外凝膠成像系統(tǒng)分析軟件，推算DES-MCPE與BSA的分子偶聯(lián)比[9]。

1.4.3DES多抗血清的制備（1）用人工免疫原DES-BSA以60 μg/只的劑量，背部多點(diǎn)皮下注射的免疫方式來(lái)免疫3只實(shí)驗(yàn)小鼠；（2）第1次免疫，450 μL FCA和450 μL DES-BSA的無(wú)菌PBS溶液進(jìn)行混合，利用勻漿機(jī)乳化5～10 min；（3）28 d后加強(qiáng)免疫，用450 μL DES-BSA的無(wú)菌PBS溶液與450 μL FIA混合并乳化，注射劑量與第1次免疫劑量相同，總共免疫4次，每次間隔時(shí)間為21 d；（4）第4免10 d后剪斷免疫小鼠的尾稍，吸取10 μL血液放入裝有990 μL無(wú)菌PBS的1 mL PE管中，在振蕩器上振蕩使之充分混合均勻，離心5 min，收集上清液，于4℃存放待用。

1.4.4DES多抗血清的鑒定

1.4.4.1效價(jià)測(cè)定采用間接ELISA測(cè)定DES抗血清效價(jià)[10]，其步驟如下：第1步，以DES-OVA為包被抗原（2 μg/L），50 μL/孔，進(jìn)行包板，37 ℃溫育2 h，PBST洗板4次（每次間隔3 min），下同；第2步，37 ℃，5%的豬血清以 220 μL/孔 的劑量封閉60 min，洗板；第3步：稀釋100倍的DES抗血清以50 μL/孔的劑量加入第1孔，然后利用5%的豬血清進(jìn)行倍比稀釋?zhuān)瑫r(shí)設(shè)陰性對(duì)照（negative control，NC）和空白對(duì)照（blank control，BC），37 ℃溫育15 min，洗板；第4步：加入GaMIgG-HRP[V（GaMIgG-HRP） ∶V（封閉液）=1 ∶1 000]，50 μL/孔，37 ℃溫育30 min，洗板；第5步：各孔加入TMB（四甲基聯(lián)苯胺）的CH3COOH-C6H8O7緩沖液 50 μL，室溫條件下靜置2～6 min；第6步：各孔加入2 mol/L硫酸溶液50 μL，使反應(yīng)結(jié)束，利用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定；第7步，結(jié)果判斷，以待測(cè)孔D450 nm≥NC D450 nm的2.1倍（P/N≥2.1），判為陽(yáng)性。

1.4.4.2敏感性鑒定間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA（ci-ELISA）方法[11]測(cè)定抗血清對(duì)DES的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度（IC50），以IC50判定敏感度，操作步驟與間接ELISA類(lèi)似，區(qū)別在于第3步分別添加D450 nm值為1.0的3只小鼠血清50 μL和不同質(zhì)量濃度的抑制劑（DES溶液）50 μL。

1.4.4.3特異性測(cè)定交叉反應(yīng)（CR）試驗(yàn)鑒定其特異性。選用己烯雌酚（DES）、己烷雌酚（HEX）、雙烯雌酚（DIEN）和雌二醇（E2）等作為競(jìng)爭(zhēng)物，用ci-ELISA測(cè)定各競(jìng)爭(zhēng)物的IC50，交叉反應(yīng)率（CR%）是以抗血清對(duì)DES的IC50與各競(jìng)爭(zhēng)物的IC50之比的百分?jǐn)?shù)。

2結(jié)果與分析

2.1人工抗原鑒定結(jié)果

2.1.1UV鑒定結(jié)果DES-BSA的吸收峰向右稍有偏移，DES的吸收峰在240～245 nm處，BSA的吸收峰在278～280 nm 處（圖1），證明DES和BSA已發(fā)生偶聯(lián)。推算出 DES-MCPE與BSA、OVA的分子偶聯(lián)比分別為1 ∶12.8、1 ∶11.5。

2.1.2SDS-PAGE鑒定結(jié)果人工合成的DES-BSA的顯色條帶位于偶聯(lián)物之后，其泳動(dòng)速度小于DES（圖2），DES分子質(zhì)量的大小與樣品在SDS-PAGE中遷移距離成反比，結(jié)果分析表明，DES-BSA的分子量比BSA的大，證明BSA與DES成功偶聯(lián)；應(yīng)用紫外凝膠成像系統(tǒng)分析軟件推算出 DES-BSA的分子量為7.039×104，BSA的分子量為6.62×104，BSA與DES的分子結(jié)合比約為1 ∶12.8，與UV鑒定結(jié)果基本一致。

2.2DES pAb的鑒定結(jié)果

2.2.1間接ELISA檢測(cè)結(jié)果表1顯示，免疫的3只 BALB/c 小鼠的多抗血清的效價(jià)均達(dá)到1.0×104以上，證明DES多克隆抗體（pAb）滴度高，DES-BSA免疫原性良好。

2.2.2敏感性鑒定結(jié)果3只免疫小鼠的抗血清都有抑制生成（表2），其中抗血清抑制效果最優(yōu)的是2號(hào)小鼠（圖3），以2號(hào)小鼠抗血清的抑制濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，其對(duì)應(yīng)的B/B0值為縱坐標(biāo)進(jìn)行繪圖，曲線回歸分析顯示兩者存在良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為y=-0.397 5x+1.001 2，r2=0.977 3。據(jù)此回歸方程能夠計(jì)算出對(duì)DES抗血清的IC50為18.221 μg/L，證明所獲得的DES抗血清的敏感性較高。

2.2.3特異性鑒定結(jié)果DES抗血清與己烷雌酚、雙烯雌酚的交叉反應(yīng)率分別為8.09%、3.63%，與其類(lèi)似物無(wú)交叉反應(yīng)（表3）。證明DES多抗血清擁有較好的選擇性。

3討論

3.1DES人工抗原的制備

依據(jù)DES免疫學(xué)測(cè)定技術(shù)的報(bào)道，歸納活化DES重要的手段有2種：一種是改造己烯雌酚中的酚羥基產(chǎn)生醚鍵；另一種是改造DES中的酚羥基形成酯鍵，對(duì)DES分子含有2個(gè)對(duì)稱(chēng)結(jié)構(gòu)的酚羥基進(jìn)行衍生反應(yīng)，對(duì)其可直接與琥珀酸酐衍生使之生成具有交聯(lián)功能基團(tuán)的化合物，然后再與載體交聯(lián)。要對(duì)其中一個(gè)酚羥基進(jìn)行化學(xué)改造，必須從反應(yīng)物的量上加以嚴(yán)格控制，按一定比例反應(yīng)后，保證生成的產(chǎn)物是DES-HS。我們按照此法對(duì)DES進(jìn)行多次改造，但結(jié)果沒(méi)有新的產(chǎn)物產(chǎn)生。Liu等報(bào)道動(dòng)物體內(nèi)酯酶使機(jī)體內(nèi)的酯鍵處于不穩(wěn)定狀態(tài)，而且免疫原性不理想[12]。本研究為了避免這一現(xiàn)象的產(chǎn)生，選取后一種連接方式。

3.2DES人工抗原的鑒定

核磁共振碳譜、IR、標(biāo)記抗原示蹤法[13]、UV[14]、聚丙烯酰胺凝膠電泳等是檢測(cè)小分子抗原經(jīng)常使用的方法，前2種方法能夠很好地測(cè)出被檢物質(zhì)的化學(xué)式，但是操作者需要擁有辨析圖譜的能力和相當(dāng)程度的實(shí)際動(dòng)手經(jīng)歷，而且檢測(cè)成本高昂，第3種方法要求對(duì)小分子作標(biāo)記，還要求檢測(cè)合成抗原的放射強(qiáng)弱，操作過(guò)程步驟繁瑣、所需時(shí)間長(zhǎng)。使用后2種方法鑒定本試驗(yàn)合成的抗原，結(jié)果顯示，DES與BSA已經(jīng)發(fā)生偶聯(lián)，斷定兩者是否發(fā)生偶聯(lián)的關(guān)鍵是合成的DES-BSA抗原免疫BALB/c小鼠后，是不是生成了針對(duì)DES的抗體[15]。本試驗(yàn)測(cè)定的3只BALB/c小鼠的多克隆抗體的效價(jià)都在 1×104以上，都對(duì)DES有抑制，最佳的IC50為 18.221 μg/L，結(jié)果表明，本研究合成的抗原可以激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生高親和力的特異性抗體，充分證明該合成物是有效的。

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