ABT1處理對(duì)降香黃檀硬枝扦插生根及其關(guān)聯(lián)酶活性的影響

王宏信+李向林++王楠++冷凝

摘要：為揭示降香黃檀（Dalbergia odorifera T.Chen）硬枝扦插苗的生根機(jī)制，取降香黃檀4年生母樹(shù)上當(dāng)年生硬枝制穗，比較50、100、200 mg/L ABT1生根劑處理的插穗，觀測(cè)降香黃檀硬枝扦插苗的生根特性，研究扦插生根過(guò)程中過(guò)氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）、吲哚乙酸氧化酶（IAAO）等生根關(guān)聯(lián)酶的活性變化。結(jié)果表明，降香黃檀屬于愈傷組織生根類型，用100 mg/L的ABT1處理插穗，明顯提高生根率和生根質(zhì)量。在降香黃檀硬枝扦插生根過(guò)程中，相關(guān)聯(lián)氧化酶活性均成規(guī)律性變化，其中PPO、SOD、IAAO的活性在扦插后逐漸升高，在根系形成期達(dá)到高峰，然后逐漸下降。而POD的活性在扦插后逐漸升高，在根系形成期達(dá)到高峰，然后逐漸下降，接著又逐漸升高，在根系伸長(zhǎng)期達(dá)到另一個(gè)峰值，最后又逐漸下降，呈現(xiàn)雙峰趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞：ABT1生根劑；降香黃檀；硬枝扦插苗；關(guān)聯(lián)酶；生根特性

中圖分類號(hào)： S792.280.5文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）08-0138-04

降香黃檀（Dalbergia odorifera T.Chen）別稱黃花梨，蝶形花科（Papilionaceae）黃檀屬（Dalbergia）喬木，是海南省特有的珍稀瀕危樹(shù)種，國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物[1]，木質(zhì)結(jié)構(gòu)細(xì)致、質(zhì)地重、極耐腐、花紋美麗、芳香氣味長(zhǎng)留，是制造高檔家具和精美工藝品的材料。降香黃檀具有極高的藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，且耐干旱瘠薄，適應(yīng)性強(qiáng)，是值得推廣種植的珍貴樹(shù)種[2]。降香黃檀一般采用播種、扦插的方式繁殖，但播種繁殖較慢，技術(shù)不成熟、不穩(wěn)定，實(shí)生苗總量較少且優(yōu)劣混雜，極大地限制了優(yōu)質(zhì)降香黃檀人工林規(guī)?；l(fā)展。因此，探索降香黃檀的無(wú)性繁殖技術(shù)尤為重要。目前研究多局限于多種因素影響下的降香黃檀扦插繁育技術(shù)體系，如前人研究的扦插基質(zhì)、插條類型、激素類型、激素濃度、浸泡時(shí)間5個(gè)因素對(duì)降香黃檀插條生長(zhǎng)指標(biāo)的影響[3]，而對(duì)生根機(jī)制的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究探討不同濃度的ABT1處理對(duì)降香黃檀硬枝扦插苗生根的影響，分析扦插生根過(guò)程中過(guò)氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）、吲哚乙酸氧化酶（IAAO）等生根關(guān)聯(lián)酶活性變化，旨在為確定建立高效的降香黃檀扦插體系，加快降香黃檀樹(shù)種推廣提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1試驗(yàn)地概況

在三亞學(xué)院園林教學(xué)試驗(yàn)苗圃進(jìn)行試驗(yàn)。該地位于海南省三亞市吉陽(yáng)區(qū)，地處109°53′92″E，18°32′72″N，海拔200 m。年平均氣溫25.4 ℃，7月平均最高氣溫28.3 ℃，1月平均最低氣溫20.7 ℃，紫外線強(qiáng)，光照充足，全年日照時(shí)間約 2 563 h。干、濕季節(jié)分明，7—11月為雨季，降水量占全年的85%。

2材料與方法

2.1扦插試驗(yàn)

于2016年4月初在三亞學(xué)院苗圃內(nèi)進(jìn)行扦插試驗(yàn)，插條取自三亞學(xué)院崖臺(tái)山黃花梨種植園內(nèi)，2012年栽植的降香黃檀母樹(shù)基部當(dāng)年萌芽條中生長(zhǎng)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害的木質(zhì)化硬枝。摘去下部葉片，保留2～3張上部葉片和頂芽，剪成長(zhǎng)度為 8～10 cm的插穗，下切口平剪，用石蠟涂抹上切口，剪好的插穗每20根為1捆，用1 000倍多菌靈溶液浸泡20 min晾干后備用。扦插前用濃度為50、100、200 mg/L的ABT1溶液浸泡2 h，對(duì)照用蒸餾水浸泡2 h。扦插基質(zhì)為珍珠巖、蛭石、細(xì)河沙的混合基質(zhì)（體積比為5 ∶3 ∶2）。扦插后保持遮光率50%左右，相對(duì)濕度控制在70%～80%，溫度控制在20～30 ℃，按照需要進(jìn)行噴霧處理，常規(guī)管理。完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)處理80根插穗，3次重復(fù)。扦插深度為穗長(zhǎng)的2/3，密度為50根/m2，保持基質(zhì)濕潤(rùn)，每周消毒1次（多菌靈和甲基硫菌靈交替使用）。新葉完全展開(kāi)后每隔15 d噴1次0.2%尿素溶液。

2.2測(cè)定指標(biāo)

2.2.1生長(zhǎng)形態(tài)指標(biāo)扦插10 d后觀察插穗愈傷組織形成情況和出現(xiàn)不定根的情況。以后每隔2～3 d觀察1次，至切口愈合。統(tǒng)計(jì)和測(cè)定的指標(biāo)有：愈傷組織出現(xiàn)期（d）、生根始期（d）、生根率（%）、不定根條數(shù)（條）、不定根長(zhǎng)度（cm）。

2.2.2關(guān)聯(lián)酶指標(biāo)扦插后每隔4 d采樣1次，每區(qū)隨機(jī)取5株插穗，采樣后洗凈吸干水分，先觀察生根情況，然后取插穗基部3 cm表皮部分別測(cè)定POD、PPO、SOD、IAAO的活性，3次重復(fù)。

2.3測(cè)定方法

PPO活性采用焦兒茶酚比色法方法[4]測(cè)定；POD活性采用愈創(chuàng)木酚法[5]測(cè)定；SOD活性采用氯化硝基氮藍(lán)四唑法[5]測(cè)定；IAAO活性用比色方法[6]測(cè)定。PPO以1 g鮮樣品 1 min 的D410 nm光密度變化0.01個(gè)單位所需要的酶液量作為1個(gè)活力單位（U），POD以1 min內(nèi)D470 nm變化0.01為1個(gè)過(guò)氧化物酶活性單位（U），SOD以抑制NBT光氧化還原50%的酶量為1個(gè)酶活性單位（U），IAAO以1 g鮮樣品在1 h內(nèi)分解破壞IAA的mg數(shù)表示1個(gè)酶活性單位（U）。

2.4數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007軟件整理分析數(shù)據(jù)并繪制指標(biāo)變化圖；采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行方差分析和Duncans多重對(duì)比。

3結(jié)果與分析

3.1ABT1濃度對(duì)硬枝插穗生根特性的影響

降香黃檀硬枝扦插生根形態(tài)學(xué)觀測(cè)結(jié)果表明：經(jīng)ABT1處理后插穗扦插10～20 d（對(duì)照組為20～30 d）后，觀察到切口及以上3～5 cm區(qū)段部位的插穗膨脹并伴有更多的突起；20～30 d（對(duì)照組為30～40 d）時(shí)有一些插穗切口愈傷組織處已伸出明顯的不定根尖端，陸續(xù)形成根系，不定根明顯伸長(zhǎng)。

由表1可知，與對(duì)照相比，外源生長(zhǎng)素ABT1的所有處理均能明顯縮短降香黃檀硬枝插穗愈傷組織出現(xiàn)及不定根發(fā)生時(shí)間，各處理的愈傷組織分別出現(xiàn)在插后16～20 d，不定根出現(xiàn)在22～28 d，而對(duì)照則分別在扦插后25、33 d才出現(xiàn)愈傷組織及不定根。且用ABT1處理的降香黃檀硬枝插穗在不定根數(shù)量、不定根長(zhǎng)度2個(gè)方面均顯著高于對(duì)照，各處理的生根率分別高出對(duì)照5.79%、41.50%、15.57%。就生根質(zhì)量而言，100 mg/L ABT1處理的不定根長(zhǎng)度分別顯著高出其他3組處理1.26、0.41、0.85 cm，而生根條數(shù)分別多出其他3組處理20.00、9.17、0.84條。總體來(lái)看，ABT1處理能提高降香黃檀硬枝插穗的生根率與生根質(zhì)量，其中100 mg/L ABT1處理的插穗生根率最高，且生根質(zhì)量最佳。

3.2.1POD的活性變化POD是活性較高的酶，可參與植物體內(nèi)的各種生理過(guò)程以及木質(zhì)素的形成，與不定根的誘導(dǎo)和伸長(zhǎng)生長(zhǎng)密切相關(guān)，能氧化IAA，消除體內(nèi)過(guò)多的內(nèi)源IAA，與一些高等植物的發(fā)育進(jìn)程有密切關(guān)系。POD的活性與離體植物生根有密切關(guān)系，是植物生根標(biāo)志性物質(zhì)之一[7]，在不定根誘導(dǎo)期和表達(dá)期，POD活性升高是有生根能力的標(biāo)志[8]。從圖1可以看出，對(duì)照插穗及3個(gè)不同濃度ABT1溶液處理的插穗在扦插后0～15 d，POD活性均不同程度上升，且在15 d的時(shí)候達(dá)到最高，之后開(kāi)始下降，而在30 d時(shí)再次升高，之后再次下降。扦插天數(shù)為5～40 d，100 mg/L ABT1處理與對(duì)照中的插穗POD活性差異均顯著（P<005），這說(shuō)明100 mg/L ABT1可以提高插穗的POD活性，而在扦插過(guò)程中，其他2個(gè)處理插穗的POD活性與對(duì)照相比具有一定的變化。POD活躍狀態(tài)對(duì)降香黃檀插穗的生根是有利的。所有處理的POD的活性都是先上升后下降，再上升然后再下降的趨勢(shì)，其中在扦插天數(shù)40 d時(shí)，對(duì)照、50、100、200 mg/L ABT1處理插穗中的POD含量比扦插15 d峰值時(shí)分別下降16.22%、27.97%、38.63%、29.55%。

3.2.2PPO的活性變化PPO是一種含銅的酶，能夠催化吲哚乙酸（IAA）與酚類物質(zhì)縮合形成IAA-酚酸復(fù)合物，可以促進(jìn)不定根形成的生根輔助因子，對(duì)植物生根具有重要作用，同時(shí)也與植物光合作用、抵抗病蟲(chóng)害等有關(guān)[9-10]。從圖2可以看出，對(duì)照處理的插穗PPO活性在0～30 d內(nèi)都是逐漸提高的，在30 d時(shí)達(dá)到峰值，之后逐漸降低；而50、100 mg/L ABT1處理的插穗PPO活性在0～25 d內(nèi)均是逐漸提高的，在25 d時(shí)到達(dá)峰值，之后逐漸降低；200 mg/L ABT1處理的插穗PPO活性在0～15 d內(nèi)均是逐漸提高的，在20 d時(shí)出現(xiàn)降低，而在25 d達(dá)到峰值，之后逐漸降低。扦插天數(shù)在5～40 d，100 mg/L ABT1處理插穗的PPO活性均顯著高于對(duì)照處理（P<0.05）。

3.2.3SOD的活性變化SOD是生物體內(nèi)天然的超氧陰離子自由基的有效清除劑，是植物氧化代謝的關(guān)鍵酶，能催化體內(nèi)O2-轉(zhuǎn)化為H2O2，從而減輕自由基對(duì)植物的毒害作用，能有效地抑制自由基對(duì)生物體的傷害，使植物在一定程度上忍耐或抵抗逆境脅迫[10]。SOD活性影響著植物的發(fā)育過(guò)程，與植物生根密切相關(guān)。從圖3可以看出，各處理的降香黃檀硬枝插穗在扦插過(guò)程中韌皮部的SOD活性均成先上升后下降趨勢(shì)。在扦插初期的0～25 d內(nèi)，50、100、200 mg/L ABT1處理的插穗SOD活性逐步升高，在25 d時(shí)達(dá)到峰值，而對(duì)照處理的SOD活性則是在30 d達(dá)到峰值，之后隨不定根的長(zhǎng)出，SOD活性均逐漸降低。除扦插天數(shù) 10 d 的200 mg/L ABT1處理外，其他各階段各處理插穗的SOD活性均與對(duì)照差異顯著（P<0.05）。

3.2.4IAAO的活性變化IAA重要的生理功能就是促進(jìn)不定根的形成，它的含量變化影響不定根的發(fā)生。IAAO可以氧化IAA，因此IAAO活性的大小與根的發(fā)生也有重要聯(lián)系[11]。由圖4可以看出，在降香黃檀硬枝扦插的過(guò)程中，所有處理的IAAO活性均為先升高后降低的趨勢(shì)。不同的是，50、100、200 mg/L ABT1處理的插穗IAAO活性在扦插25 d時(shí)候達(dá)到最高，而對(duì)照處理則是在扦插30 d時(shí)達(dá)到最高。除扦插 5 d 的50 mg/L ABT1處理外，其他各階段各處理插穗的IAAO活性均與對(duì)照差異顯著（P<0.05）。

4結(jié)論與討論

選擇應(yīng)用植物促根劑，是提高林木扦插成活率的關(guān)鍵技術(shù)之一[12]。降香黃檀屬于韌皮部生根類型，試驗(yàn)中分別采用50、100、200 mg/L ABT1對(duì)插穗進(jìn)行處理，結(jié)果表明，適宜濃度的ABT1可以顯著縮短降香黃檀硬枝扦插的生根周期，提高生根率和不定根的質(zhì)量。在該試驗(yàn)條件下，降香黃檀的硬枝插穗最適宜的ABT1濃度為100 mg/L，該處理比對(duì)照生根率提高41.50%，不定根出現(xiàn)時(shí)間縮短11.66 d，根長(zhǎng)增加126 cm，生根條數(shù)增加20.00條。這與前人的研究結(jié)果一致，較高濃度的促根劑反而會(huì)影響到插穗的生根時(shí)間及其生根質(zhì)量[13-15]。

過(guò)氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）和吲哚乙酸氧化酶（IAAO）等活性酶均與降香黃檀硬枝插穗生根過(guò)程有非常密切的關(guān)系，直接影響植物的生根特性。不同的ABT1處理明顯改變了降香黃檀硬枝插穗內(nèi)的過(guò)氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）和吲哚乙酸氧化酶（IAAO）等氧化酶的活性，且在生根過(guò)程中成規(guī)律性變化。其中多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）和吲哚乙酸氧化酶（IAAO）的活性在扦插后逐漸升高，在根系形成期達(dá)到高峰，然后逐漸下降。多酚氧化酶（PPO）活性變化呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，這說(shuō)明在降香黃檀硬枝扦插生根過(guò)程中，愈傷組織的形成、分化以及不定根誘導(dǎo)形成時(shí)，需要高活性的多酚氧化酶（PPO），而在不定根伸長(zhǎng)階段則需要低活性的多酚氧化酶（PPO）。還有研究也表明，PPO活性與植物的抗性密切相關(guān)[16-17]，當(dāng)植物受到外界不良刺激，PPO活性就會(huì)升高，而在扦插后期，PPO活性開(kāi)始下降，這可能是由于不定根伸長(zhǎng)、細(xì)胞數(shù)量增多，PPO參與了細(xì)胞壁及木質(zhì)素的合成所致[18]。降香黃檀插穗在離開(kāi)母體之后就處于逆境條件下生長(zhǎng)，這會(huì)促進(jìn)氧自由基或超氧負(fù)離子的生成，增加了細(xì)胞膜透性，而超氧化物歧化酶（SOD）對(duì)細(xì)胞膜脂過(guò)氧化具有保護(hù)作用，所以在扦插后到根系形成期這一階段活性逐漸升高，并達(dá)到最大值。吲哚乙酸氧化酶（IAAO）活性先升高后降低，這是因?yàn)橛鷤M織形成后，低活性的IAAO能夠減少IAA的消耗，增加插穗內(nèi)部IAA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，而高濃度的IAA能促進(jìn)插穗不定根的形成與生長(zhǎng)。這一變化趨勢(shì)與前人對(duì)其他物種的的研究不太一致，據(jù)推測(cè)這是插穗內(nèi)激素種類和相對(duì)比例、生根抑制劑的存在與否、插穗內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量等多種因素綜合作用的結(jié)果，但這種推測(cè)還有待進(jìn)一步深入研究。過(guò)氧化物酶（POD）活性在扦插后逐漸升高，在根系形成期達(dá)到高峰，然后逐漸下降，再逐漸升高，在根系生長(zhǎng)期達(dá)到另一個(gè)高峰，然后隨著根系的伸長(zhǎng)，又逐漸下降，呈現(xiàn)“升高—下降—升高—下降”的雙峰趨勢(shì)，這和前人的研究結(jié)果[19-22]一致。

ABT1對(duì)過(guò)氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）和吲哚乙酸氧化酶（IAAO）等產(chǎn)生的酶活性變化，從而促進(jìn)細(xì)胞的脫分化，產(chǎn)生愈傷組織。本研究從生根過(guò)程中相關(guān)氧化酶變化方面揭示了降香黃檀硬枝扦插生根的生理響應(yīng)機(jī)制，但由于影響植物扦插生根的因素較多，只有對(duì)插穗內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量、內(nèi)源激素水平等與生根相關(guān)指標(biāo)的變化規(guī)律進(jìn)行研究后，才能更確切地闡明降香黃檀硬枝扦插生根的機(jī)制。

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