葡萄葉提取物對葡萄生單軸霉菌游動孢子釋放、萌發(fā)和游動性的影響

楊佳瑤++申紅妙++賈招閃++郭金堂++冉隆賢

摘要：為了研究不同品種及葉齡的葡萄葉提取物對葡萄生單軸霉菌游動孢子的影響，選用3個(gè)葡萄品種，制備其新葉、老葉的乙醇提取物，測定不同提取物對葡萄生單軸霉菌游動孢子釋放、萌發(fā)和游動性的影響。結(jié)果表明，不同品種的葡萄葉提取物對霜霉病菌的游動孢子均有明顯的抑制作用，并且新老葉之間差異較??；抗病品種巨峰葉片提取物在濃度為5 mg/mL時(shí)對游動孢子釋放、萌發(fā)的抑制率都能達(dá)90%，并能使游動孢子失去游動性；感病品種紅乳葉片提取物在濃度為10 mg/mL以上時(shí)才能達(dá)到上述效果；感病品種美人指葉片提取物在濃度為5 mg/mL時(shí)對游動孢子萌發(fā)的抑制率可達(dá)90%，在濃度為10 mg/mL時(shí)才對游動孢子的釋放、游動性具有強(qiáng)烈的抑制作用。由結(jié)果可知，抗病品種的葡萄葉提取物的抑制效果要好于感病品種，而同一品種的新葉和老葉之間差異基本不顯著。

關(guān)鍵詞：葡萄霜霉?。蝗~提取物；葡萄生單軸霉菌；葡萄；游動孢子；霜霉病防治

中圖分類號： S436.631.1+9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2017）08-0079-03

葡萄霜霉病是世界上最嚴(yán)重的卵菌病害之一，多發(fā)生在雨水較多的地區(qū)和年份[1]，在我國各葡萄產(chǎn)區(qū)均有分布，其病原為葡萄生單軸霉菌[Plasmopara viticola （Berk. et Curt.） Burl. et de Toni]，屬于藻物界（假菌界）卵菌門卵菌綱霜霉菌目單軸霉屬，是一種專性寄生菌，主要危害葡萄的葉片、新梢、卷須、嫩梢、葉柄、花穗梗等[2]。該菌的無性階段會產(chǎn)生大量孢子囊，在高濕、溫暖的條件下，梨形的孢子囊會釋放多個(gè)具有雙鞭毛的游動孢子，當(dāng)游動孢子靠近氣孔后會收縮其鞭毛變?yōu)殪o止孢，隨后萌發(fā)產(chǎn)生芽管，由氣孔侵入寄主。孢子囊可以通過雨水、空氣等條件傳播后再次進(jìn)行侵染。在適宜條件下，病菌傳播迅速且危害巨大，每年都會給葡萄產(chǎn)業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。葡萄生單軸霉菌游動孢子的釋放、游動、萌發(fā)是病菌完成侵染的關(guān)鍵，也是病害發(fā)生最重要的階段和病害防治的關(guān)鍵時(shí)期。Islam等研究發(fā)現(xiàn)，2，4-二乙?；g苯三酚（DAPG）及其衍生物對葡萄生單軸霉菌游動孢子的釋放和游動性均有良好的抑制作用[5]；Abdalla等研究發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌ANK313菌株的代謝產(chǎn)物對葡萄生單軸霉菌游動孢子的游動性具有強(qiáng)烈的抑制作用，同時(shí)還表現(xiàn)出對游動孢子具有較強(qiáng)的溶解作用[6]。目前葡萄霜霉病的防治手段以化學(xué)農(nóng)藥為主，雖然化學(xué)農(nóng)藥具有高效、速效和經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，但是由于大量使用，造成病原產(chǎn)生抗藥性、破壞環(huán)境及影響人類健康等諸多弊端[7]。植物源農(nóng)藥主要來源于植物體內(nèi)，其有效成分通常不是單一化合物，而是植物有機(jī)體中大部分有機(jī)物質(zhì)。與化學(xué)農(nóng)藥相比，植物源農(nóng)藥具有環(huán)境相容性好、對非靶標(biāo)生物安全、不易產(chǎn)生抗藥性、生物活性多樣、種類多、開發(fā)途徑多等優(yōu)點(diǎn)[8]。近年來，利用植物源提取物防治葡萄霜霉病的研究日漸增多，焦文哲研究表明，樟樹、桉樹、馬齒莧的不同有機(jī)溶劑提取物對葡萄霜霉病具有很好的防治作用[9]；郭秀萍等研究發(fā)現(xiàn)，葡萄、委陵菜以及無花果葉片的有機(jī)提取物能降低葡萄生單軸霉菌的侵染率[10]。

葡萄作為一種具有抗菌活性的生物質(zhì)資源，具有廣闊的發(fā)展前景。葡萄體內(nèi)包含大量的抗微生物活性的化學(xué)成分，如酚酸類、鞣酸類、黃酮類和茋類等[11-12]。Schnee等在葡萄藤提取物中發(fā)現(xiàn)，6種物質(zhì)對葡萄生單軸霉菌具有良好的抑制作用[13]；袁茜等研究認(rèn)為，葡萄葉有機(jī)提取物能明顯抑制黃瓜、辣椒枯萎菌的生長[14]；李曉瓊等研究發(fā)現(xiàn)，圓葉葡萄葉提取物對南方根結(jié)線蟲具有較強(qiáng)的毒殺活性[15]。關(guān)于葡萄不同抗性品種之間存在的抑菌物質(zhì)的種類和含量是否存在差異，以及是否都能對葡萄生單軸霉菌游動孢子產(chǎn)生抑制作用尚未見報(bào)道。為了測定不同抗性葡萄品種，以及不同葉齡葡萄葉提取物對葡萄生單軸霉菌的抑制作用，本研究選取對霜霉病具有不同抗性的3個(gè)葡萄品種，制備其新葉、老葉的乙醇提取物，測定不同乙醇提取物對葡萄生單軸霉菌游動孢子釋放、萌發(fā)和游動性的影響，旨在為葡萄葉提取物應(yīng)用于葡萄霜霉病防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試葡萄品種巨峰、紅乳、美人指的新葉、老葉均采自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)苗圃，其中巨峰為抗病品種，紅乳、美人指為感病品種[16-17]。從枝條頂端以下算起，第2、3張葉片視為新葉，第6、7張葉片視為老葉。

葡萄生單軸霉菌，分離自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)苗圃發(fā)病葉片。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1葡萄葉提取物的制備將3個(gè)品種健康的新葉、老葉分別用清水洗凈晾干，放入烘箱內(nèi)于60 ℃烘至恒質(zhì)量，用微型植物粉碎機(jī)粉碎后過40目篩。分別取過篩的材料，按料液比1 g ∶8 mL與95%乙醇混合，在40 ℃超聲提取30 min，用4層紗布過濾；濾液于8 000 r/min離心20 min，取上清液在恒溫下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至固態(tài)，最后用50%乙醇定容至原植物干樣含量為1 g/mL的提取母液[14]。分別將母液用無菌水稀釋成1、5、10、50、100 mg/mL備用。

1.2.2葡萄葉提取物對游動孢子釋放的影響將新鮮病葉采回，用清水洗凈，葉柄用脫脂棉包扎后置于鋪有紗布的培養(yǎng)皿中，于20 ℃培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)2 d，待新孢子囊成熟，用毛筆將孢子囊刷至無菌水中，用單層鏡頭紙過濾，配成濃度為106個(gè)/mL的孢子囊懸浮液[18]。然后將不同濃度葡萄葉提取物分別與孢子囊懸浮液按體積比1 ∶1混合，分別用5%乙醇、無菌水與孢子囊懸浮液按體積比1 ∶1混合作為對照，混合后放置在22 ℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，2 h后置于200倍光學(xué)顯微鏡下觀察，每個(gè)處理觀察20個(gè)視野，記錄每個(gè)視野下游動孢子的數(shù)量（個(gè)），并計(jì)算抑制率，相關(guān)公式：

游動孢子釋放抑制率=[（對照游動孢子總數(shù)-處理游動孢子總數(shù)）/對照游動孢子總數(shù)]×100%。

1.2.3葡萄葉提取物對游動孢子萌發(fā)的影響孢子囊懸浮液的制備同“1.2.2”節(jié)，待游動孢子釋放后加入NaCl，使懸浮液中NaCl含量為10 mmol/L，輕輕搖晃以促進(jìn)游動孢子停止萌發(fā)[19]。然后將不同濃度葡萄葉提取物與懸浮液按體積比 1 ∶1 混合，分別用5%乙醇、無菌水與懸浮液按體積比1 ∶1混合作為對照，放入22 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，鏡檢游動孢子的萌發(fā)數(shù)，每個(gè)處理檢驗(yàn)不少于200個(gè)獨(dú)立的游動孢子，計(jì)算游動孢子萌發(fā)抑制率，相關(guān)公式：

游動孢子萌發(fā)抑制率= [（對照游動孢子萌發(fā)率-處理游動孢子萌發(fā)率）/對照游動孢子萌發(fā)率]×100%。

1.2.4葡萄葉提取物對游動孢子游動性的影響將濃度為106個(gè)/mL的孢子囊懸浮液置于22 ℃光照培養(yǎng)箱中2 h，待游動孢子被釋放后，將懸浮液與不同葡萄葉提取物按體積比1 ∶1混合，分別用5%乙醇、無菌水與懸浮液按體積比1 ∶1混合作為對照，5 min后置于200倍光學(xué)顯微鏡下檢查游動孢子的運(yùn)動狀態(tài)[20]。每個(gè)處理觀察不少于15個(gè)視野，并記錄每個(gè)視野下具有游動性的游動孢子數(shù)量，計(jì)算每個(gè)視野下的平均值。

1.2.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析以上試驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1葡萄葉提取物對葡萄生單軸霉菌游動孢子釋放的影響

由圖1可知，隨著處理濃度的增加，3個(gè)品種葡萄的新葉和老葉提取物對游動孢子釋放的抑制率也顯著提高；當(dāng)濃度為1 mg/mL時(shí)，各個(gè)品種葡萄的新葉、老葉提取物對游動孢子的釋放均無明顯抑制作用。巨峰葉片提取物處理濃度為 5 mg/mL 時(shí)，對游動孢子釋放的抑制率達(dá)90%；當(dāng)濃度提高到10 mg/mL時(shí)，對游動孢子釋放的抑制率可達(dá)95%；當(dāng)處理濃度為50 mg/mL及以上時(shí)可完全抑制游動孢子的釋放，且新老葉作用基本相同，與其他處理相比不存在顯著差異（圖1-a）。紅乳葉片提取物對游動孢子釋放的抑制能力較弱，新葉、老葉之間無顯著差別，當(dāng)處理濃度為5、10、50 mg/mL時(shí)，對游動孢子釋放的抑制率均低于巨峰、美人指葉片提取物；當(dāng)處理濃度達(dá)到100 mg/mL時(shí)，其抑制率才能達(dá)到另兩者濃度為50 mg/mL的抑制水平（圖1-b、圖1-c）。美人指葉片提取物處理濃度為5 mg/mL時(shí)，新葉、老葉提取物對游動孢子釋放的抑制率分別為75%、58%，存在顯著性差異；當(dāng)處理濃度大于10 mg/mL時(shí)，新老葉提取物對游動孢子釋放的抑制率均為95%以上，且差異不明顯（圖1-c）。

2.2葡萄葉提取物對葡萄生單軸霉菌游動孢子萌發(fā)的影響

由圖2可知，當(dāng)處理濃度為1 mg/mL時(shí)，3個(gè)品種葡萄的新葉、老葉提取物均不能明顯抑制游動孢子的萌發(fā)；當(dāng)處理濃度為5 mg/mL時(shí)，3個(gè)品種葡萄的新葉、老葉提取物對游動孢子的萌發(fā)抑制率顯著提高，只有紅乳新葉的抑制率仍較低，為77%，其他葡萄葉提取物抑制率均在90%左右，同品種新老葉提取物之間無顯著差異；當(dāng)處理濃度為10 mg/mL及以上時(shí)，3個(gè)品種葡萄的新葉和老葉提取物均能明顯抑制游動孢子的萌發(fā)，且不存在顯著差異。

2.3葡萄葉提取物對葡萄生單軸霉菌游動孢子游動性的影響

由表1可知，當(dāng)處理濃度為1 mg/mL時(shí)，3個(gè)品種葡萄的新葉、老葉提取物均不影響游動孢子的游動性，并且與對照無明顯差異，巨峰葉片提取物在處理濃度為5mg/mL及以上時(shí)，使游動孢子完全失去游動性，與對照差異顯著，并且新葉、老葉的作用相同；紅乳葉片提取物在處理濃度為5 mg/mL

時(shí)，對游動孢子的游動性產(chǎn)生抑制作用，與巨峰處理無顯著差異，但與對照有顯著差異；在處理濃度為10 mg/mL及以上時(shí)，使游動孢子完全失去游動性，并且新、老葉之間無明顯差異；美人指葉片提取物當(dāng)濃度為5 mg/mL時(shí)，對游動孢子的游動性產(chǎn)生抑制作用，并與對照有顯著差異，但是顯著低于巨峰葉片提取物，新葉的抑制作用也低于老葉，在10 mg/mL濃度下，對游動孢子游動性的抑制作用增強(qiáng)，美人指老葉提取物對游動孢子游動性的影響顯著好于新葉提取物，當(dāng)濃度為 50 mg/mL 及以上時(shí)，使游動孢子失去游動性。運(yùn)動中的游動孢子鞭毛透明，其形態(tài)在顯微鏡下不明顯，而失去游動性的游動孢子鞭毛變得清晰可見，并向兩側(cè)伸展（圖3）。

3結(jié)論與討論

本研究表明，3個(gè)葡萄品種新葉和老葉的乙醇提取物對葡萄生單軸霉菌游動孢子的釋放、萌發(fā)及游動性均有良好的抑制作用。在高濃度下不同葡萄品種、葉齡的葡萄葉提取物對游動孢子均有顯著的影響且無明顯差異；在低濃度下巨峰葉片提取物的抑制效果最穩(wěn)定，好于紅乳、美人指葉片提取物。相比較而言，抗病品種的葡萄葉提取物的抑制效果要好于感病品種，而同一品種的新葉和老葉之間差異較小。因此可見，在不同抗性品種、不同葉齡葡萄葉中抑菌活性物質(zhì)的種類沒有差別，只是含量有所不同，這與Pezet等的研究結(jié)果[20-21]一致。結(jié)合葡萄葉提取物對游動孢子3個(gè)方面的影響和不同濃度的抑制效果，建議在應(yīng)用葡萄葉提取物防治葡萄霜霉病時(shí)抗病品種提取物采用5 mg/mL以上濃度，感病品種提取物采用 10 mg/mL 以上濃度為宜。

本研究初步探討了葡萄葉乙醇提取物對葡萄生單軸霉菌游動孢子的抑制作用，但是對于田間防治效果尚須進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究發(fā)現(xiàn)，在處理濃度為5 mg/mL時(shí)，3個(gè)品種葡萄的新葉、老葉提取物都有游動孢子的釋放、萌發(fā)，但與對照相比其釋放的游動孢子大多數(shù)為不具游動性的畸形孢子，萌發(fā)的游動孢子也存在一定的畸形且芽管短小，其中的作用機(jī)制和活性成分尚不明確，今后還須要進(jìn)一步研究。

植物源農(nóng)藥產(chǎn)品中除有效成分外，還含有其他多種物質(zhì)。有些物質(zhì)表現(xiàn)出特殊的生物活性，例如促進(jìn)植物生長、誘導(dǎo)植物提高抗病性和抗逆性、改善作物的品質(zhì)等[22]。前人研究發(fā)現(xiàn)，葡萄葉有機(jī)提取物可以提高葡萄葉片內(nèi)2種防御酶的活性[10]，圓葉葡萄葉乙醇提取物可以增加番茄的高度、鮮質(zhì)量和根長[15]。關(guān)于葡萄葉乙醇提取物是否能誘導(dǎo)葡萄對霜霉病產(chǎn)生抗性以及對葡萄是否具有促生作用也須要做進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Wong F P. Burr H N，Wilcox W F. Heterothallism in Plasmopara viticola[J]. Plant Pathology，2001，50（4）：427-432.

[2]Agrios G N，Beckerman J. Plant pathology[M]. 6th ed. Burlington：Elsevier Academic Press，2011.

[3]龍世林，胡瑾，房小晶，等. 葡萄霜霉病研究進(jìn)展[J]. 耕作與栽培，2015（4）：65-67.

[4]Kiefer B，Riemann M，Büche C，et al. The host guides morphogenesis and stomatal targeting in the grapevine pathogen Plasmopara viticola[J]. Planta，2002，215（3）：387-393.

[5]Islam M，von Tiedemann A. 2，4-Diacetylphloroglucinol suppresses zoosporogenesis and impairs motility of Peronosporomycete zoospores[J]. World Journal of Microbiology & Biotechnology，2011，27（9）：2071-2079.

[6]Abdalla M，Win H，Islam M，et al. Khatmiamycin，a motility inhibitor

and zoosporicide against the grapevine downy mildew pathogen Plasmopara viticola from Streptomyces sp. ANK313[J]. The Journal of Antibiotics，2011，64（10）：655-659.

[7]何昆，羅寬. 中草藥萃取液對植物病原真菌、細(xì)菌的抑制作用[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003（1）：43-45.

[8]何軍，馬志卿，張興. 植物源農(nóng)藥概述[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006，34（9）：79-85.

[9]焦文哲. 生防細(xì)菌和植物提取物等防治葡萄霜霉病研究[D]. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[10]郭秀萍，車永梅，侯麗霞，等. 四種植物提取物對抵御葡萄霜霉病菌的影響[J]. 北方園藝，2012（3）：130-133.

[11] Pawlus A D，Waffo- Téguo P，Saver J，et al. Stilbenoid chemistry from wine and the genus “Vitis”：a review[J]. Journal International des Sciences de la Vigne et du Vin，2012，46（2）：57-111.

[12]etin E S，Altinoz D，Tarcan E，et al. Chemical composition of grape canes[J]. Industrial Crops and Products，2011，34（1）：994-998.

[13]Schnee S，Queiroz E，Voinesco F，et al. Vitis vinifera canes，a new source of antifungal compounds against Plasmopara viticola，Erysiphe necator，and Botrytis cinerea[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2013，61（23）：5459-5467.

[14]袁茜，周寶利，李之璞. 不同提取條件對葡萄葉提取物抑制兩種病原菌活性的影響[J]. 植物保護(hù)，2009，35（2）：125-127.

[15]李曉瓊，唐軍，毛潤萍，等. 圓葉葡萄葉提取物對南方根結(jié)線蟲的生物活性[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，46（10）：1812-1816.

[16]趙雪艷，張瑋，嚴(yán)紅，等. 不同葡萄品種對霜霉病的田間苗期抗性評價(jià)[J]. 植物保護(hù)，2014，40（5）：172-175.

[17]李寶燕，王培松，倪壽山，等. 不同葡萄品種對霜霉病的抗性鑒定及相關(guān)生理生化研究[J]. 果樹學(xué)報(bào)，2016，33（2）：217-223.

[18]杜興蘭，李正楠，姬惜珠，等. 葡萄生軸霜霉菌孢子囊的長期保存[J]. 菌物學(xué)報(bào)，2008，27（6）：908-914.

[19]Riemann M，Büche C，Kassemeyer H，et al. Cytoskeletal responses during early development of the downy mildew of grapevine （Plasmopara viticola）[J]. Protoplasma，2002，219（1/2）：13-22.

[20]Pezet R G K，Gindro K，Viret O，et al. Effects of resveratrol，viniferins and pterostilbene on Plasmopara viticola zoospore mobility and disease development[J]. Vitis，2004，43（3）：145-148.

[21] Steimetz E，Trouvelot S，Gindro K，et al. Influence of leaf age on induced resistance in grapevine against Plasmopara viticola[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology，2012，79（10）：89-96.

[22]張興，馬志卿，馮俊濤，等. 植物源農(nóng)藥研究進(jìn)展[J]. 中國生物防治學(xué)報(bào)，2015，31（5）：685-698.