龍脷葉配方顆粒的制備及質(zhì)量分析

黃慧+左婷

[摘要]目的 制備龍脷葉配方顆粒并測定其質(zhì)量，為龍脷葉配方顆粒質(zhì)量分析提供依據(jù)。方法 用水煎煮方法提取生藥制備龍脷葉配方顆粒；建立合適的高效液相色譜方法，采用甲醇和0.4%磷酸溶液按照48∶52的比例等度洗脫測定龍脷葉配方顆粒中的山柰酚-3-O-龍膽二糖苷含量。結(jié)果 山柰酚-3-O-龍膽二糖苷的線性范圍是0.1208～1.098 μg，r=1.002；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.03%。結(jié)論 本研究所建立的龍脷葉配方顆粒的制備及質(zhì)量分析方法準(zhǔn)確可靠，能夠?yàn)槠溥M(jìn)一步的分析和研究打下了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]龍脷葉；配方顆粒；山柰酚-3-O-龍膽二糖苷；質(zhì)量分析

[中圖分類號(hào)] R927.11 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2017）05（c）-0090-04

[Abstract]Objective To prepare the Sauropus spatulifolius Beille dispersing granules and determine its quality，to provide the basis for the quality analysis.Methods Sauropus spatulifolius Beille dispersing granules were prepared by boiling water extraction method of crude drug，and the suitable HPLC method was established.The content of kaempferol -3-O-gentiobioside of Sauropus spatulifolius Beille dispersing granules was determined by using methanol and 0.4% phosphoric acid solution in accordance with the proportion of 48∶52.Results The linear range of kaempferol -3-O-gentiobioside was 0.1208-1.098 μg，r=1.002.The relative standard deviation was 1.03%.Conclusion The preparation and quality analysis method of Sauropus spatulifolius Beille dispersing granules established in this study is accurate and reliable，it can lay a foundation for further analysis and research.

[Key words]Sauropus spatulifolius Beille；Dispersing granules；Kaempferol -3-O-gentiobioside；Quality analysis

龍脷葉首次記載于《嶺南采藥錄》，具有清肺止咳、抗炎鎮(zhèn)痛、通便的療效[1]。其主要成分包括正十八醇、β-谷甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇酸酸酯、cyclohomonervilol和山柰酚-3-O-龍膽二糖苷等[2]。20世紀(jì)70年代，龍脷葉便以“龍利葉”之名收載于《中國藥典》；近些年，已出現(xiàn)關(guān)于龍脷葉的主要化學(xué)成分[3]、薄層色譜鑒定、龍脷葉化學(xué)成分藥效學(xué)[4]、龍脷葉揮發(fā)性成分GC-MS測定[5]以及龍脷葉的質(zhì)量分析[6]等方面內(nèi)容的報(bào)道?！吨袊幍洹?015年版第一部首次將龍脷葉的“含量鑒定”收載其中。但在國內(nèi)仍未見到龍脷葉顆粒制備工藝、龍脷葉顆粒的鑒定以及其質(zhì)量分析指標(biāo)等內(nèi)容的報(bào)道。本文優(yōu)化龍脷葉配方顆粒制備方法，從鑒別、檢查以及含量測定等方面對(duì)龍脷葉顆粒的質(zhì)量進(jìn)行分析，為龍脷葉配方顆粒質(zhì)量分析提供依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器

日本島津1260色譜儀（LC-20A），十萬分之一天平（AB135-S，購自瑞典Mettler Toledo公司），超聲波清洗器（KQ5200B，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司），高速離心機(jī)（TGL-16C，上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2試藥

龍脷葉藥材購自北京同仁堂大藥房，經(jīng)專家鑒定為大戟科植物龍脷葉Sauropus rostratus的干燥葉。山柰酚-3-O-龍膽二糖苷對(duì)照品（含量≥98.0%）購自sigma公司（批號(hào)：20130301）。甲醇等試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為純凈水（購自娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

2方法與結(jié)果

2.1龍脷葉配方顆粒的制備

2.1.1龍脷葉提取物制備工藝的篩選

本實(shí)驗(yàn)采用三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，以龍脷葉提取物提取率為篩選中間產(chǎn)物制備工藝的評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)，以加入溶劑倍數(shù)、煎煮時(shí)間和煎煮次數(shù)為三個(gè)因素，其相應(yīng)因素的三水平見表1。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Rc是影響龍脷葉提取物提取率的最主要因素；加13倍量水煎煮2次、每次1.5 h提取率最高，是龍脷葉提取物的最佳提取工藝。

2.1.2龍脷葉配方顆粒的制備

稱取龍脷葉藥材原料適量，經(jīng)簡單除雜后，加入13倍量蒸餾水，沸后繼續(xù)煎煮1.5 h，共煎煮2次，濾過，合并濾液。于50～80℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得龍脷葉提取物；加入適量麥芽糊精，經(jīng)噴霧干燥后制粒。

2.2樣品溶液的制備

2.2.1對(duì)照品溶液的制備

精密稱定山柰酚-3-O-龍膽二糖苷對(duì)照品5.04 mg，置于100 ml容量瓶中，用50%甲醇溶解、定容，搖勻，制成0.0504 mg/ml的對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備

取1 g龍脷葉配方顆粒研細(xì)，精密稱定重量。將所稱樣品置于25 ml錐形瓶內(nèi)，精密量取50%的甲醇25 ml，密閉超聲40 min，補(bǔ)足損失溶劑，搖勻，濾過即得。

2.3色譜條件

色譜柱采用ODS-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸溶液（48∶52）；實(shí)驗(yàn)過程中采用1.0 ml/min的流速，檢測波長設(shè)定為349 nm。

2.4龍脷葉配方顆粒質(zhì)量分析

2.4.1鑒別

取本品適量，研細(xì)；取樣品0.50 g溶于20 ml無水乙醇中，超聲30 min，濾過，濾液于水浴鍋上蒸干；殘?jiān)訜o水乙醇溶解定容至1 ml容量瓶，作為供試品溶液。另取龍脷葉對(duì)照藥材1.01 g加60 ml蒸餾水，加熱煮沸30 min，濾過，濾液于水浴鍋上蒸干；殘?jiān)訜o水乙醇溶解定容至20 ml容量瓶，作為對(duì)照藥材溶液。將5 μl供試品溶液和15 μl對(duì)照藥材溶液分別點(diǎn)在薄層硅膠板上，置于加有適量正己烷-乙酸乙酯（1∶4）展開劑的展開槽中，按規(guī)定步驟操作。顯色劑選用10%硫酸乙醇溶液。結(jié)果顯示，龍脷葉配方顆粒供試品溶液和龍脷葉對(duì)照藥材溶液在薄層板中色斑的位置、數(shù)量基本一致（圖1）。

2.4.2檢查

2.4.2.1粒度 參照《中國藥典》2015年版四部通則0982粒度測定法的第二法雙篩分法對(duì)本品粒度進(jìn)行測定。稱取10.00 g龍脷葉配方顆粒，將顆粒置于10目篩進(jìn)行篩動(dòng)，收集不能通過的部分；將剩余的部分置于80目篩進(jìn)行篩動(dòng)，收集通過的部分；將收集的兩部分合在一起精密稱定重量為0.6 g，所占百分比為6%，不超過15%，符合規(guī)定。

2.4.2.2水分 參照《中國藥典》2015年版四部通則0832水分測定法對(duì)本品中所含水分進(jìn)行測定。稱取龍脷葉配方顆粒適量，平行3份，以相同的厚度放于稱量瓶的底部，于105℃下干燥至恒重。結(jié)果顯示，水分分別為6.2%、5.8%、5.7%，均<8.0%，符合規(guī)定。

2.4.2.3溶化性 參照《中國藥典》2015年版四部通則0104項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定檢查。稱定龍脷葉配方顆粒10 g溶于200 ml熱水，持續(xù)攪拌5 min，顆粒全部溶解，符合規(guī)定。

2.5龍脷葉配方顆粒有效成分含量測定

2.5.1專屬性考察

按“2.3”項(xiàng)下的色譜條件操作，山柰酚-3-O-龍膽二糖苷峰計(jì)算理論板數(shù)≥3000；山柰酚-3-O-龍膽二糖苷峰與其他成分峰達(dá)到基線分離（R>0.05）。

2.5.2線性關(guān)系考察

將山柰酚-3-O-龍膽二糖苷對(duì)照品溶液的進(jìn)樣體積依次設(shè)定為2、5、10、15、20 μl，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件操作，記錄峰面積?？v坐標(biāo)為峰面積，橫坐標(biāo)為進(jìn)樣量，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程方程：y=1.432×106x-3.148×104（r=1.002）。山柰酚-3-O-龍膽二糖苷的線性范圍為0.1208～1.098 μg。

2.5.3精密度試驗(yàn)

精密吸取10 μl對(duì)照品溶液，于“2.3”項(xiàng)下色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果顯示，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.12%，表明精密度高。

2.5.4穩(wěn)定性試驗(yàn)

取配方顆粒（批號(hào)：6076532）1 g制成供試品溶液，將其于室溫下放置，每隔2 h進(jìn)樣1次，共測定6次，記錄每次測定的峰面積。結(jié)果顯示，峰面積的RSD為0.48%，表明在室溫條件下，山柰酚-3-O-龍膽二糖苷在12 h內(nèi)有很好的穩(wěn)定性。

2.5.5重復(fù)性試驗(yàn)

取配方顆粒（批號(hào)：6076532）1 g制成供試品溶液，平行6份，于“2.3”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣測定，得出山柰酚-3-O-龍膽二糖苷的峰面積。結(jié)果顯示，該批次配方顆粒中有效成分的平均含量為0.3762 mg/g，RSD為0.14%，表明該實(shí)驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

2.5.6加樣回收試驗(yàn)

精密稱定已知含量（0.3828 mg/g）的配方顆粒（批號(hào)：6076532）0.5 g，平行6份，按“2.2.2”進(jìn)行操作，分別加入4 ml山柰酚-3-O-龍膽二糖苷對(duì)照品溶液，于“2.3”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

2.5.7樣品含量測定

取3批龍脷葉配方顆粒（批號(hào)：T1608078、6076532、6095873），制備成供試品溶液，分別測定3次有效成分含量（均按干燥品計(jì)算），計(jì)算平均含量，結(jié)果見表3。

3討論

3.1制備工藝考察

在中藥實(shí)驗(yàn)中，?？紤]將水煎煮提取法作為中藥提取方法，其適用范圍較廣泛，并且擁有較高的提取回收率[7]；近期研究發(fā)現(xiàn)乙醇回流提取的提取回收率也較高，在重要領(lǐng)域也有著較為廣泛的應(yīng)用。目前關(guān)于龍脷葉有效成分的提取主要包括以上兩種方法[8]。水煎煮提取法所用溶劑為水，更加經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，干凈環(huán)保；所用設(shè)備容易操作，安全性好，更適合應(yīng)用于生產(chǎn)，因此本實(shí)驗(yàn)采用水煎煮來獲得龍脷葉提取物。龍脷葉配方顆粒的制備工藝采用正交試驗(yàn)方法對(duì)其進(jìn)行篩選，以龍脷葉提取物的提取率為指標(biāo)，以加入溶劑倍數(shù)（11、13、15倍）、煎煮時(shí)間（1.0、1.5、2.0 h）、煎煮次數(shù)（1、2、3次）為三因素來設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，加13倍量水煎煮2次，每次1.5 h時(shí)提取率最高，優(yōu)選為最佳提取工藝。本實(shí)驗(yàn)采用上述提取方法提取3批龍脷葉，計(jì)算得龍脷葉提取物的平均提取率為47.0%。本實(shí)驗(yàn)使用了噴霧干燥制粒的制備工藝，避免龍脷葉所含揮發(fā)性成分因加熱干燥而造成損失。

3.2龍脷葉配方顆粒的定性鑒別

薄層色譜鑒別幾乎成為中藥材和中成藥首選的鑒別方法[9]?！吨袊幍洹?015年版對(duì)龍脷葉生藥材的鑒別項(xiàng)采用的便是薄層色譜分析方法；同時(shí)丘琴等[10]采用薄層色譜方法對(duì)龍脷葉的氨基酸與皂苷等部分進(jìn)行了定性鑒別。本研究采用薄層色譜鑒別對(duì)龍脷葉配方顆粒進(jìn)行定性鑒別。龍脷葉配方顆粒制成的供試品溶液與龍脷葉對(duì)照藥材薄層色譜圖的相同位置有相同的斑點(diǎn)，說明兩者主要成分相同。該方法操作簡單，結(jié)果可靠。同時(shí)，龍脷葉配方顆粒的各個(gè)檢測項(xiàng)也均符合《中國藥典》2015年版要求。

3.3龍脷葉配方顆粒的定量分析

相關(guān)研究顯示，龍脷葉含有皂苷類、苷類、生物堿、香豆素等多種有效成分，其中山柰酚-3-O-龍膽二糖苷在各個(gè)批次中的含量較為穩(wěn)定，專屬性良好[11]。同時(shí)藥理學(xué)研究顯示，山柰酚-3-O-龍膽二糖苷主要的藥理學(xué)作用是抗炎、止咳、解痙、抗?jié)兊龋c龍脷葉配方顆粒在臨床上的主要療效基本一致[12-14]，具有很高程度的代表性，因此，本實(shí)驗(yàn)將山柰酚-3-O-龍膽二糖苷作為質(zhì)量分析考察的主要指標(biāo)?！吨袊幍洹?015年版首次將山柰酚-3-O-龍膽二糖苷作為龍脷葉生藥材含量測定的指標(biāo)，進(jìn)一步佐證了其作為龍脷葉制備顆粒質(zhì)量分析指標(biāo)的可行性[4]。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法測定龍脷葉配方顆粒中的山柰酚-3-O-龍膽二糖苷，通過對(duì)色譜條件的考察驗(yàn)證，該方法專屬性高，測定有效、結(jié)果可靠。

綜上所述，本研究所優(yōu)化的龍脷葉配方顆粒制備工藝生產(chǎn)效率高、操作簡單、安全環(huán)保，所得產(chǎn)品符合藥典要求，適合用于大生產(chǎn)過程中龍脷葉配方顆粒的制備。同時(shí)，本文所采用的薄層色譜定性鑒別方法以及高效液相色譜的定量分析方法準(zhǔn)確可靠，操作簡單，適用于龍脷葉配方顆粒的質(zhì)量分析評(píng)估。

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（收稿日期：2017-03-28 本文編輯：祁海文）