姜黃素與卡鉑聯(lián)合用藥對鼠卵巢癌轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的影響

高英卓，孔令婷，齊亞飛，王勁歐，曹程程，呂慶杰

姜黃素與卡鉑聯(lián)合用藥對鼠卵巢癌轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的影響

高英卓，孔令婷，齊亞飛，王勁歐，曹程程，呂慶杰*

目的 探討姜黃素與卡鉑聯(lián)合用藥對鼠卵巢癌轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系T1、T2、T3的影響。方法 采用MTT法檢測卡鉑、姜黃素單獨及聯(lián)合用藥對鼠卵巢癌轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系增殖的影響，RT-PCR及Western blot檢測各組細(xì)胞中K-RAS、PI3K、AKT的表達(dá)水平。結(jié)果 通過MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率，各濃度卡鉑單獨作用于鼠卵巢癌轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系T1、T2、T3的增殖抑制率<30%，與姜黃素聯(lián)用后，增殖抑制率均>30% (P<0.05)，對轉(zhuǎn)染了AKT的T2、T3作用更明顯。聯(lián)合組T1、T2、T3細(xì)胞的K-RAS、PI3K (p-PI3K)、AKT (p-AKT)的mRNA及蛋白表達(dá)量低于卡鉑單用組。結(jié)論 鼠卵巢癌轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系T1、T2、T3對卡鉑具有耐藥性。姜黃素可逆轉(zhuǎn)其對卡鉑的耐藥性，且對含有AKT的T2、T3作用更加明顯。姜黃素的逆轉(zhuǎn)作用可能與抑制K-RAS、PI3K、AKT的表達(dá)有關(guān)，其也可能直接抑制PI3K/AKT信號通路。

姜黃素；卡鉑；卵巢癌

0 引言

卵巢癌的死亡率在女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中居首位[1]。姜黃素(Curcumin，Cur)是從中藥姜黃中提取的一種相對分子質(zhì)量小的脂溶性多酚類色素，具有抗炎、抗氧化、抗癌、清除自由基、抗微生物等多方面藥理作用[2]，美國國立腫瘤所已將其列為第3代癌化學(xué)預(yù)防藥物[3]?？ㄣK(Carboplatin，Cap)是一種抗癌譜廣、抗癌作用強(qiáng)、與多種抗癌藥具有協(xié)同作用的第2代鉑絡(luò)合物[4-7]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床。

本實驗通過觀察姜黃素與卡鉑單獨或聯(lián)合用藥對鼠卵巢癌轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的影響，探討姜黃素對鼠卵巢癌細(xì)胞系的抑制作用機(jī)制與K-RAS及其下游的PI3K/AKT信號通路的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與耗材 姜黃素(美國Sigma公司)，卡鉑注射液(波貝，齊魯制藥有限公司)，二苯基四氮硅溴(MTT，華美生物工程公司)，二甲基亞砜(DMSO，美國Sigma公司)，K-RAS、p-PI3K、p-AKT抗體(博奧森公司)，β-actin(Santa Cruz公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)抗羊/兔IgG抗體(二抗，北京中山生物技術(shù)有限公司)，細(xì)胞培養(yǎng)板與培養(yǎng)瓶(Corning)。

1.1.2 儀器 CO2孵箱(Heraues)，低溫高速離心機(jī)(Sigma)，倒置相差顯微鏡(OLYMPUS)。

1.1.3 細(xì)胞株 本研究應(yīng)用具有明確基因型的卵巢癌細(xì)胞系T1、T2、T3，該體系以逆轉(zhuǎn)錄病毒為載體，將一系列確定可引起遺傳突變的癌基因(c-myc、K-RAS、AKT基因)轉(zhuǎn)染到p53基因敲除的雌性成年大鼠的卵巢表面上皮細(xì)胞內(nèi)。大鼠卵巢癌細(xì)胞系的生成如下：C1(基因型：p53-/-，c-myc，K-RAS)，C2(基因型：p53-/-，c-myc，AKT)，C3(基因型：p53-/-，K-RAS，AKT)。由C1、C2、C3來源的腫瘤結(jié)節(jié)分離后，進(jìn)行體外培養(yǎng)，形成鼠卵巢癌轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系T1、T2、T3。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 鼠卵巢癌轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系T1、T2、T3用含10%胎牛血清DMEM高糖培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2、相對濕度90%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，常規(guī)方法消化傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。分組：對照組為空白組；實驗組為卡鉑單用組，濃度為1、2、4、8 μg/mL；卡鉑姜黃素聯(lián)用組，即各濃度卡鉑與20 μmol/L姜黃素聯(lián)用。

1.2.2 MTT比色分析法檢測細(xì)胞增殖抑制率 分別檢測卡鉑單用及卡鉑與姜黃素聯(lián)合作用于T1、T2、T3的細(xì)胞增殖抑制率，方法參照MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒說明書，以上實驗重復(fù)3次。平均生長抑制率(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%，其值<30%為耐藥。

1.2.3 實時定量PCR法檢測細(xì)胞K-RAS、PI3K、AKT的mRNA表達(dá)量 Trizol法抽提總RNA，樣品-80 ℃保存，利用紫外分光光度計檢測RNA樣品濃度和純度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，PCR擴(kuò)增，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.4 Western blot檢測K-RAS、p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá) 取對數(shù)生長期的T1、T2、T3細(xì)胞，卡鉑單用或卡鉑姜黃素聯(lián)合作用24 h后，回收細(xì)胞，用細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，于10%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，參照Western blot常規(guī)方法，ECL試劑盒顯影并成像。每組重復(fù)3次。以Bioimagining System灰度測量系統(tǒng)測量Wb條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料比較采用t檢驗，計數(shù)資料比較采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測T1、T2、T3細(xì)胞增殖抑制率 各濃度卡鉑(1、2、4、8 μg/mL)單獨作用于T1、T2、T3細(xì)胞的增殖抑制率均<30%，表明鼠卵巢癌轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系T1、T2、T3對卡鉑具有耐藥性；單用姜黃素20 μmol/L作用于3種細(xì)胞的增殖抑制率<30%。當(dāng)各濃度卡鉑與姜黃素20 μmol/L聯(lián)用時，細(xì)胞增殖抑制率升高。結(jié)果表明，姜黃素逆轉(zhuǎn)了T1、T2、T3對卡鉑的耐藥性。當(dāng)藥物濃度為CBP 1+Cur 20時，T1細(xì)胞(33.11%)與T3細(xì)胞(70.92%)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CBP 4+Cur 20時，T1細(xì)胞(43.71%)與T2細(xì)胞(88.01%)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；CBP 8+Cur 20時，T1細(xì)胞(50.26%)與T3細(xì)胞(90.5%)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)?？ㄣK與姜黃素聯(lián)用時，T2和T3的細(xì)胞增殖抑制率高于T1細(xì)胞。見圖1。

圖1 MTT法檢測T1、T2、T3細(xì)胞增殖抑制率

注：CG：空白對照組；C1：卡鉑濃度1 μg/mL，以此類推；Cur：姜黃素濃度均為20 μmol/L。同種細(xì)胞卡鉑姜黃素聯(lián)用組與同濃度卡鉑單用組比較，*P<0.05，**P<0.01；卡鉑姜黃素聯(lián)用時，同樣藥物濃度，不同細(xì)胞間比較，△P<0.05

2.2 RT-PCR檢測K-RAS、PI3K、AKT的mRNA表達(dá)水平 相應(yīng)試劑作用24 h后，各組T1、T2、T3細(xì)胞K-RAS、PI3K及AKT的mRNA表達(dá)量見表2?！鳌鰿T=(CT目的基因-CT管家基因)實驗組-(CT目的基因-CT管家基因)對照組，用2-△△CT表示mRNA的表達(dá)量，對照組為1。T1的AKT基因、T2的K-RAS基因呈低表達(dá)。

2.3 關(guān)聯(lián)分析 聯(lián)用組T3細(xì)胞的K-RAS與PI3K mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.97，P<0.05)，提示姜黃素可能通過K-RAS影響PI3K的表達(dá)，來逆轉(zhuǎn)卵巢癌轉(zhuǎn)基因細(xì)胞對卡鉑的耐藥性。

2.4 Western blot檢測K-RAS、p-PI3K及p-AKT的蛋白表達(dá)水平 記錄K-RAS、p-PI3K及p-AKT的蛋白表達(dá)水平，進(jìn)行灰度翻轉(zhuǎn)，計算其灰度值，見圖2。

K-RAS。T1：C4+Cur組較C4組降低(P<0.05)，C8+Cur組較C8降低(P<0.01)；T3：C1+Cur組較C1降低(P<0.05)。T2呈低表達(dá)?？ㄣK姜黃素聯(lián)用組T1、T3細(xì)胞K-RAS的蛋白表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

p-PI3K。T1：C2+Cur較C2降低(P<0.01)；T2：C2+Cur較C2降低(P<0.05)，C4+Cur較C4降低(P<0.01)；T3：C1+Cur較C1降低(P<0.05)，C4+Cur較C4降低(P<0.05)，C8+Cur較C8降低(P<0.01)。C4+Cur組T3的p-PI3K表達(dá)量高于T1(P<0.05)。

p-AKT。T2：C2+Cur較C2降低(P<0.01)，C4+Cur較C4降低(P<0.01)；T3：C4+Cur較C4降低(P<0.05)，C8+Cur較C8降低(P<0.05)。C2+Cur組T3的表達(dá)高于T1。

3 討論

本研究應(yīng)用具有明確基因型的鼠卵巢癌轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系T1(p53-/-，c-myc，K-RAS)、T2(p53-/-，c-myc，AKT)、T3(p53-/-，K-RAS，AKT)，觀察到各濃度卡鉑或姜黃素(20 μmol/L)單獨作用于T1、T2、T3的細(xì)胞增殖抑制率均低于30%，聯(lián)合應(yīng)用卡鉑與姜黃素組均高于30%，說明鼠卵巢癌轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系對卡鉑具有耐藥性，姜黃素逆轉(zhuǎn)了其對卡鉑的耐藥性?？ㄣK姜黃素聯(lián)用組T2、T3的細(xì)胞增殖抑制率均高于T1細(xì)胞，而T2、T3的細(xì)胞增殖抑制率無顯著差異。T1與T2均具有c-myc基因，二者的差異可能是由于K-RAS和AKT基因的不同；然而，T1與T3均具有K-RAS基因，由此推斷，T2和T3的細(xì)胞增殖抑制率高于T1細(xì)胞，可能是由于T1細(xì)胞缺乏AKT基因，AKT基因是姜黃素逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞耐藥性的重要靶點。

卡鉑姜黃素聯(lián)用組T1、T3細(xì)胞的K-RAS表達(dá)量低于卡鉑單用組，聯(lián)用組T1、T2、T3細(xì)胞的PI3K表達(dá)量低于卡鉑單用組，提示姜黃素逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞對卡鉑的耐藥性可能與K-RAS、PI3K有關(guān)。PI3K是AKT的上游調(diào)節(jié)因子[8]，提示姜黃素逆轉(zhuǎn)作用與PI3K/AKT信號通路有關(guān)。

姜黃素是姜科植物的根莖，在亞洲應(yīng)用歷史悠久。目前認(rèn)為，姜黃素能影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個環(huán)節(jié)與步驟[9-11]。前期研究結(jié)果表明，姜黃素對細(xì)胞增殖的抑制率隨濃度增高而增加，表現(xiàn)為明顯的濃度-效應(yīng)依賴關(guān)系。當(dāng)姜黃素濃度為20 μmol/L時，作用時間為24 h，其對T1、T2、T3的增殖抑制率為15%～35%，表明單獨應(yīng)用姜黃素對卵巢癌細(xì)胞抑制作用較小。有研究表明，姜黃素誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡具有p53依賴性[12-13]，同時涉及p38絲裂原活化蛋白激酶激活及下調(diào)Bcl-2、Bcl-X、Survivin表達(dá)和AKT信號。目前，姜黃素在應(yīng)用中存在的主要問題是生物利用度低，研究合成其衍生物以改善其化學(xué)性質(zhì)近年來已有報道[14-16]。隨著對姜黃素抗癌作用機(jī)制和構(gòu)效關(guān)系的深入研究，姜黃素將有望作為新型植物來源抗腫瘤藥物應(yīng)用于人類癌癥的治療和預(yù)防。活化的RAS基因能直接和PI3K調(diào)節(jié)亞基p110結(jié)合。

表2 T1、T2、T3細(xì)胞K-RAS、PI3K及AKT的mRNA水平

注：CG：空白對照組；C1：卡鉑濃度1 μg/mL，以此類推；Cur：姜黃素濃度均為20 μmol/L。同種細(xì)胞卡鉑姜黃素聯(lián)用組與同濃度卡鉑單用組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖2 T1、T2、T3細(xì)胞K-RAS、p-PI3K、p-AKT的蛋白水平

PI3K/AKT信號通路參與抗細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、癌性轉(zhuǎn)化等過程。研究表明，通過降調(diào)PI3K/AKT表達(dá)可提高卵巢癌對鉑類藥物的敏感性[17]。研究顯示，以PI3Kp110α、AKT為靶點的RNA干擾技術(shù)有望成為卵巢癌基因治療的新策略。PI3K通路并非AKT激活的唯一途徑[18]。過表達(dá)的Lewis(y)抗原通過激活PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)卵巢癌RMG-I細(xì)胞的增殖，抑制Lewis(y)抗原表達(dá)可能是一種治療Lewis(y)高表達(dá)腫瘤的新方法。

MAPK通路中的RAS基因?qū)儆贕TP酶基因家族，約30%的腫瘤發(fā)生中存在RAS基因突變，其中約85%為K-RAS突變，活化的RAS能直接結(jié)合并激活PI3K的催化亞基。PI3K/AKT通路與RAS/MAPK通路在功能上十分類似[19]，兩者之間存在一定程度的補(bǔ)償作用，即一條通路的抑制可能導(dǎo)致另一條通路的異?；罨?。這種作用可以使細(xì)胞外的致瘤信號增強(qiáng)，但有時也會使信號減弱。因此，應(yīng)用具有同時抑制雙通路的藥物會起到較好的治療作用。

綜上所述，卵巢癌轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系T1、T2、T3對卡鉑具有耐藥性，姜黃素可逆轉(zhuǎn)其對卡鉑的耐藥性，且對含有AKT的T2、T3作用效果更加明顯，提示姜黃素逆轉(zhuǎn)卵巢癌對卡鉑的耐藥性可能與AKT密切相關(guān)。通過檢測3種細(xì)胞的K-RAS、PI3K及AKT表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，其逆轉(zhuǎn)機(jī)制可能與抑制K-RAS、PI3K、AKT的表達(dá)有關(guān)，也可能直接抑制PI3K/AKT信號通路。

[1] Bast RC,Hennessy B,Mills GB.The biology of ovarian cancer:new opportunities for translation[J].Nat Rev Cancer,2009,9(6):415-428.

[2] Zhang X,Zhang HQ,Zhu GH,et al.A novel mono-carbonyl analogue of curcumin induces apoptosis in ovarian carcinoma cells via endoplasmic reticulum stress and reactive oxygen species production[J].Mol Med Rep,2012,5(3):739-744.

[3] Selvendiran K,Ahmed S,Dayton A,et al.HO-3867,a curcumin analog,sensitizes cisplatin-resistant ovarian carcinoma,leading to therapeutic synergy through STAT3 inhibition[J].Cancer Biol Ther,2011,12(9):837-845.

[4] Wagstaff AJ,Ward A,Benfield P,et al.Carboplatin.A preliminary review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties and therapeutic efficacy in the treatment of cancer[J].Drugs,1989,37(2):162-190.

[5] 林春生,曾清芳.異環(huán)磷酰胺聯(lián)合卡鉑方案治療復(fù)發(fā)性卵巢癌的臨床分析[J].臨床軍醫(yī)雜志,2015,43(10):1074-1076.

[6] 劉仁杰,段天林,李景釗,等.不同鉑類藥物聯(lián)合長春瑞濱治療晚期非小細(xì)胞肺癌臨床效果及安全性分析[J].中國醫(yī)藥,2015,10(9):1289-1292.

[7] 張瀟.趙慶春.601例非小細(xì)胞肺癌患者化療用藥分析[J].創(chuàng)傷與急危重病醫(yī)學(xué),2016,4(3):158-161.

[8] Ghosh A,Lai C,McDonald S,et al.HSP27 expression in primary colorectal cancers is dependent on mutation of KRAS and PI3K/AKT activation status and is independent of TP53[J].Exp Mol Pathol,2013,94(1):103-108.

[9] Mosieniak G,Adamowicz M,Alster O,et al.Curcumin induces permanent growth arrest of human colon cancer cells:link between senescence and autophagy[J].Mech Ageing Dev,2012,133(6):444-455.

[10] Seo JH,Jeong KJ,Oh WJ,et al.Lysophosphatidic acid induces STAT3 phosphorylation and ovarian cancer cell motility:their inhibition by curcumin[J].Cancer Lett,2010,288(1):50-56.

[11]王亞華,應(yīng)雪,張春春,等.替莫唑胺聯(lián)合姜黃素對C6 膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的作用[J].實用醫(yī)學(xué)雜志,2016,32(10):1564-1567.

[12]Yunos NM,Beale P,Yu JQ,et al.Synergism from sequenced combinations of curcumin and epigallocatechin-3-gallate with cisplatin in the killing of human ovarian cancer cells[J].Anticancer Res,2011,31(4):1131-1140.

[13]Shi M,Cai Q,Yao L,et al.Antiproliferation and apoptosis induced by curcumin in human ovarian cancer cells[J].Cell Biol Int,2006,30(3):221-226.

[14]Dayton A,Selvendiran K,Kuppusamy ML,et al.Cellular uptake,retention and bioabsorption of HO-3867,a fluorinated curcumin analog with potential antitumor properties[J].Cancer Biol Ther,2010,10(10):1027-1032.

[15]Zhang X,Zhang HQ,Zhu GH,et al.A novel mono-carbonyl analogue of curcumin induces apoptosis in ovarian carcinoma cells via endoplasmic reticulum stress and reactive oxygen species production[J].Mol Med Rep,2012,5(3):739-744.

[16]Selvendiran K,Ahmed S,Dayton A,et al.Safe and targeted anticancer efficacy of a novel class of antioxidant-conjugated difluorodiarylidenyl piperidones:differential cytotoxicity in healthy and cancer cells[J].Free Radic Biol Med,2010,48(9):1228-1235.

[17]el-SA A,Zhu Q,Barakat BM,et al.Tangeretin sensitizes cisplatin-resistant human ovarian cancer cells through downregulation of phosphoinositide 3-kinase/Akt signaling pathway[J].Cancer Res,2009,69(23):8910-8917.

[18]Liu J,Lin B,Hao Y,et al.Lewis y antigen promotes the proliferation of ovarian carcinoma-derived RMG-I cells through the PI3K/Akt signaling pathway[J].J Exp Clin Cancer Res,2009,28:154.

[19]De Luca A,Maiello MR,D′Alessio A,et al.The RAS/RAF/MEK/ERK and the PI3K/AKT signalling pathways:role in cancer pathogenesis and implications for therapeutic approaches[J].Expert Opin Ther Targets,2012,16(Suppl 2):S17-S27.

Effect of curcumin combined with carboplatin on ovarian cancer transgenic cell lines

GAO Ying-zhuo,KONG Ling-ting,QI Ya-fei,WANG Jin-ou,CAO Cheng-cheng,Lü Qing-jie*

(Department of Pathology,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Objective To investigate the effect of curcumin combined with carboplatin on rat′s ovarian cancer transgenic cell line T1,T2 and T3.Methods The effect of carboplatin and curcumin alone and in combination on proliferation of rat′s ovarian cancer transgenic cell lines was detected by MTT method,and the expression levels of K-RAS,PI3K and AKT were detected by RT-PCR and Western blotting.Results The cell inhibition rate of proliferation of different concentrations of carboplatin alone on rat ovarian cancer transgenic cell line T1,T2 and T3 was less than 30%;the rate was more than 30% after combination use of carboplatin and curcumin (P<0.05);the effect on T2 and T3 which was transfected with AKT was more obvious.The expression of K-RAS,PI3K (p-PI3K) and AKT (p-AKT) in T1,T2 and T3 of combination group was lower than that of carboplatin group.Conclusion Rat ovarian cancer transgenic cell lines T1,T2 and T3 are resistant to carboplatin.Curcumin can reverse the drug resistance to carboplatin,especially for T2 and T3 cells which contain AKT.The reverse effect of curcumin may be related to the inhibition of the expression of K-RAS,PI3K and AKT or direct inhibition of PI3K/AKT signaling pathway.

Curcumin;Carboplatin;Ovarian cancer

2017-01-13

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院病理科，沈陽 110004

遼寧省科技攻關(guān)計劃項目(2013225021)；遼寧省“百千萬人才工程”資助項目(2011921040)；沈陽市科技創(chuàng)新專項資金(F14-231-1-46)

10.14053/j.cnki.ppcr.201706004

*通信作者