奶及奶粉中4種阿維菌素類藥物殘留檢測高效液相色譜法

張玉潔，李 丹，李 倩，王鶴佳

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京海淀100081)

奶及奶粉中4種阿維菌素類藥物殘留檢測高效液相色譜法

張玉潔，李 丹，李 倩，王鶴佳

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京海淀100081)

建立一種適用于牛奶、羊奶和奶粉中乙酰氨基阿維菌素、阿維菌素、伊維菌素和多拉菌素的殘留檢測方法。奶及奶粉中的4種阿維菌素類藥物用20%乙醇乙腈溶液提取，加水和微量三乙胺稀釋后經(jīng)C18固相萃取柱凈化，氮氣吹干后，65 ℃避光衍生化反應(yīng)15 min。用高效液相色譜—熒光檢測法分析，外標(biāo)法定量。4種藥物在0.5～1 000 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，在牛奶、羊奶中的定量限為0.5 μg/kg；在奶粉中的定量限為5 μg/kg。一定濃度范圍內(nèi)，4種藥物在牛奶、羊奶和奶粉中的平均回收率為89.2%～113%；批內(nèi)變異系數(shù)為0.450%～9.73%，批間變異系數(shù)為2.90%～10.6%。該方法操作簡單、靈敏度高、準(zhǔn)確度和精密度好，適用于牛奶、羊奶及奶粉中阿維菌素類藥物的殘留檢測。

阿維菌素類 ； 奶 ； 奶粉 ； 高效液相色譜法

阿維菌素類藥物是目前應(yīng)用范圍最廣的抗寄生蟲藥。由于具有較高的脂溶性，阿維菌素和伊維菌素可經(jīng)乳腺排泄，脂溶性較高的多拉菌素在體內(nèi)消除緩慢，乙酰氨基阿維菌素極性稍高，乳中濃度較低，可用于防治包括奶牛在內(nèi)的所有種類牛寄生蟲病[1,2]。阿維菌素類藥物對哺乳動物的毒性很低，但是長期食用含有此類藥物的奶產(chǎn)品會對人類健康產(chǎn)生潛在威脅。我國農(nóng)業(yè)部于2002年發(fā)布的第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定阿維菌素禁用于泌乳期牛、羊，多拉菌素禁用于泌乳期牛，伊維菌素在牛奶中的最高殘留限量為10 μg/kg[3]。

阿維菌素類藥物分子量大，主要采用高效液相色譜法進(jìn)行分析。但目前該類藥物的多殘留檢測方法多集中于對豬、牛、羊等動物組織樣品中的殘留分析研究，而有關(guān)牛奶、羊奶及奶粉中殘留檢測的報道較少，尤其是針對羊奶及奶粉的檢測方法，鮮有報道[1,4-5]?，F(xiàn)行的兩個標(biāo)準(zhǔn)方法也存在適用組織不全面以及方法的靈敏度較低的問題[6-7]。因此，本試驗制訂了4種阿維菌素類藥物針對牛奶、羊奶和奶粉的檢測方法，并降低了定量限及檢測限，以便更好地滿足實際檢測工作的需求。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備、試劑及對照品 Agilent 1100高效液相色譜儀(配熒光檢測器)；SPE柱：Bond Elut C18固相萃取柱(500 mg/6 mL)，或相當(dāng)者；固相萃取裝置；氮吹儀；高速冷凍離心機；Milli-Q超純水儀等。

阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和乙酰氨基阿維菌素對照品，純度≥91.0%，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。甲醇、乙腈、無水乙醇為色譜純，異辛烷、三乙胺為分析純。試驗用水為符合GB/T 6682-2008的一級水。

1.2 溶液配制 20%乙醇乙腈溶液：取無水乙醇20 mL用乙腈稀釋至100 mL。固相萃取柱洗滌液：取乙腈30 mL、水70 mL和三乙胺20 μL，混勻。衍生化試劑A液：N-甲基咪唑-乙腈(1+1，v/v)。B液：三氟乙酸酐-乙腈(1+2，v/v)。均現(xiàn)用現(xiàn)配。

阿維菌素類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1 mg/mL)：分別稱取乙酰氨基阿維菌素、阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素標(biāo)準(zhǔn)品約10 mg，精密稱定于10 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度。配制成濃度為 1 mg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20 ℃保存，有效期6個月。

阿維菌素類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(10 μg/mL)：準(zhǔn)確量取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.25 mL于25 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為 10 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。-20 ℃保存，有效期3個月。

阿維菌素類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(1 μg/mL)：準(zhǔn)確量取10 μg/mL阿維菌素類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液2.5 mL于25 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，配制成濃度為1 μg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。-20 ℃ 保存，有效期3個月。

1.3 試驗方法

1.3.1 液相色譜條件 色譜柱: C18250 mm×4.6 mm (i. d)，粒徑5 μm；流動相:乙腈：水(90∶10,V/V)；流速: 1.8 mL/min；檢測波長:激發(fā)波長365 nm；發(fā)射波長475 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量: 40 μL。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍的測定 精密量取100 ng/mL阿維菌素類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液0.15、0.5 mL于10 mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度；精密量取1 μg/mL阿維菌素類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液0.5、1、2.5、5.0 mL至10 mL量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，配制成濃度分別為1.5、5、50、100、250、500 ng/mL乙酰氨基阿維菌素、阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。取上述6個濃度及1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作液各1.0 mL于各自的10 mL試管中，于50 ℃水浴氮氣吹干，按衍生化步驟處理后供高效液相色譜測定。以測得峰面積為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。求回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.3.3 樣品前處理 稱取牛奶、羊奶(5±0.05)g、奶粉(0.5±0.01)g，置50 mL離心管中，加20%乙醇乙腈溶液8 mL，渦旋混勻，中速振蕩5 min，5 000 r/min離心10 min。收集上清液于另一50 mL離心管中。殘渣重復(fù)提取1次。合并兩次上清液，加水15 mL和三乙胺50 μL，混勻，備用。

依次用乙腈5 mL、固相萃取柱洗滌液5 mL，活化C18固相萃取柱。將備用液過柱，抽干。加異辛烷3 mL洗滌，抽干。用乙腈5 mL洗脫。收集洗脫液于10 mL試管中，50 ℃下用氮氣吹干。備用。

向試管中依次加入衍生化試劑A液100 μL和衍生化試劑B液150 μL，密閉，渦動10 s，依次加冰醋酸、三乙胺各50 μL，渦動10 s，65 ℃避光密閉反應(yīng)15 min，取出后加650 μL甲醇混勻。經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，供高效液相色譜檢測。

1.3.4 檢測限及定量限 分別取牛奶、羊奶和奶粉的空白樣品進(jìn)行添加回收試驗，按照上述樣品前處理方法處理，進(jìn)HPLC分析。以S/N≥10，且在該添加水平的回收率和變異系數(shù)均滿足殘留分析要求的最小濃度作為定量限(LOQ)，以S/N=3作為藥物的檢測限(LOD)。

1.3.5 準(zhǔn)確度和精密度 采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，在牛奶和羊奶中添加3個不同濃度(0.5 μg/kg、10 μg/kg和50 μg/kg)的阿維菌素類標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行回收率測定，每個濃度設(shè)定5個平行樣品，同時進(jìn)行空白試驗，重復(fù)3次，求每個樣品的回收率和批內(nèi)、批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。按照相同方法，在奶粉中添加3個不同濃度(5 μg/kg、100 μg/kg和500 μg/kg)的阿維菌素類標(biāo)準(zhǔn)溶液，計算每個樣品的回收率和批內(nèi)、批間RSD。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 4種阿維菌素類藥物在0.5～1 000 μg/L濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其曲線方程和相關(guān)系數(shù)(R)見表1所示。

2.2 檢測限及定量限 空白試料按1.3.3步驟處理后，測定結(jié)果表明，在相應(yīng)的保留時間處，不同來源的空白試料對所測分析物均無干擾。圖1～3分別是羊奶空白樣品、標(biāo)準(zhǔn)對照液及0.5 μg/kg羊奶添加樣品的色譜圖。

表1 4種阿維菌素類藥物的回歸方程及相關(guān)系數(shù)

圖1 空白羊奶色譜圖 圖2 4種阿維菌素類藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖 圖3 0．5μg/kg羊奶添加樣品的色譜圖

按照S/N=3計算，4種藥物在牛奶和羊奶中的檢測限均為0.2 μg/kg，在奶粉中的檢測限為 2 μg/kg。在牛奶、羊奶中分別添加4種藥物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其添加濃度分別為0.2、0.5μg/kg和2 μg/kg；在奶粉中添加4種藥物的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使其添加濃度分別為2、5μg/kg和20 μg/kg。按照1.3.3提取凈化方法處理后，經(jīng)HPLC檢測。測定結(jié)果顯示，牛奶、羊奶中4種藥物的添加濃度為0.5 μg/kg時，S/N≥10，且回收率均大于90%，變異系數(shù)小于8.7%；奶粉中4種藥物的添加濃度為5 μg/kg時，S/N≥10，回收率均大于91%，變異系數(shù)小于8.9%。為此，確定該方法中乙酰氨基阿維菌素、阿維菌素、多拉菌素和伊維菌素在牛奶、羊奶組織中的定量限為0.5 μg/kg；在奶粉中的定量限為 5 μg/kg。

2.3 準(zhǔn)確度和精密度 牛奶、羊奶和奶粉中3個濃度阿維菌素類藥物添加回收試驗的回收率、批內(nèi)RSD和批間RSD的匯總結(jié)果見表2。

表2 4種阿維菌素類藥物準(zhǔn)確度及精密度試驗數(shù)據(jù) (n = 5)

由表2數(shù)據(jù)可知，該方法在牛奶、羊奶和奶粉中的平均回收率為89.2%～113%；批內(nèi)變異系數(shù)為0.45%～9.73%，批間變異系數(shù)為2.90%～10.6%。方法準(zhǔn)確度、精密度良好。

3 討論

3.1 提取條件的優(yōu)化 現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)GB 29696-2013使用乙腈8 mL分兩次提取牛奶中的4種藥物，提取過程簡單，提取效率高[6]。但針對羊奶和奶粉提取效率則顯著降低，羊奶和奶粉中的乙酰氨基阿維菌素回收率分別低于50%和30%，其他3種藥物的回收率也有不同程度的降低。

因此，考慮改變提取液極性，以提高羊奶和奶粉中各藥物的提取效率。乙醇毒性小，極性較乙腈更低，經(jīng)試驗摸索，在乙腈中加入一定比例的乙醇，確實可以有效提高羊奶和奶粉中的4種藥物的提取效率。但乙醇比例過高，會削弱乙腈沉淀蛋白的能力，后續(xù)凈化步驟困難；乙醇比例過低，又會不同程度的影響羊奶，尤其是奶粉中各藥物的提取效率。所以，經(jīng)進(jìn)一步摸索，最終確定提取液組成為乙腈∶乙醇=8∶2(v/v)。此提取液對牛奶、羊奶、奶粉3種基質(zhì)中4種藥物的提取效率均可達(dá)到80%以上。

3.2 凈化條件的優(yōu)化 對動物組織及奶中阿維菌素類藥物的凈化有采用C18固相萃取柱、堿性氧化鋁柱，也有方法采用兩柱聯(lián)用[4～7]。張啟迪等比較了堿性氧化鋁柱和C18柱的凈化效果，認(rèn)為堿性氧化鋁柱凈化效果更好。但其試驗樣本單一，僅針對魚肌肉樣品；檢測藥物僅包括阿維菌素和多拉菌素[8]?，F(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)GB 29696-2013及程林麗等檢測牛奶中的4種阿維菌素類藥物，采用了C18柱[6,9]。本方法進(jìn)一步摸索了C18固相萃取柱的柱效和過柱溶液中有機相和水相的最佳混合比例，最終采用C18固相萃取柱，向提取液中加水15 mL，從而在保證C18固相萃取柱對藥物保留效率的同時也縮短了過柱時間。

3.3 衍生化條件的優(yōu)化 對阿維菌素類藥物的衍生化試劑普遍使用N-甲基咪唑-乙腈(1+1，v/v)和三氟乙酸酐-乙腈(1+2，v/v)進(jìn)行，但不同方法間衍生化反應(yīng)條件有所差異，反應(yīng)溫度、時間跨度較大，光照要求也不同[4,6,9-10]。經(jīng)本試驗摸索，目前多數(shù)方法采用的室溫下衍生化反應(yīng) 15 min 或30 min并不充分，尤其是乙酰氨基阿維菌素，隨著反應(yīng)時間的延長衍生化產(chǎn)物的含量持續(xù)升高。

因此，本試驗對衍生化反應(yīng)的溫度、時間、光照條件進(jìn)行了更為深入的摸索。首先，在實驗室明亮光照和避光兩種條件下取標(biāo)準(zhǔn)溶液常溫下反應(yīng)80 min，結(jié)果顯示。明亮光照條件下4種藥物的峰面積均明顯低于避光條件下的藥物的峰面積。

然后，對比了避光條件下常溫、50 ℃和65 ℃3種溫度下0、15、30、45、60、75 min及100 min各反應(yīng)時長的衍生化效率。測定結(jié)果顯示，常溫反應(yīng)80 min和65 ℃反應(yīng)15 min這兩種條件下4種阿維菌素藥物的衍生產(chǎn)物含量最高，時間延長至100 min，阿維菌素的衍生化產(chǎn)物反而略有減少。

綜合考慮4種藥物的反應(yīng)效率以及試驗時長，本試驗確定衍生化反應(yīng)條件為65 ℃避光反應(yīng)15 min。此反應(yīng)條件下的衍生化反應(yīng)效率高、反應(yīng)充分，并且反應(yīng)后的衍生化產(chǎn)物加入甲醇后形成的醇式衍生化產(chǎn)物含量穩(wěn)定，反應(yīng)結(jié)束后立即進(jìn)樣與存放數(shù)小時、1 d以及1周后再進(jìn)樣所得的檢測組分的峰面積沒有明顯差異。

綜上所述，本試驗建立了一種適用于牛奶、羊奶和各類奶粉中4種阿維菌素類藥物的殘留檢測方法。用乙腈-乙醇溶液提取樣品中的藥物，加水稀釋后經(jīng)C18固相萃取柱凈化，在65 ℃避光條件下衍生化反應(yīng)15 min。反應(yīng)結(jié)束后加入甲醇，使衍生化產(chǎn)物形成穩(wěn)定的醇式衍生化產(chǎn)物，之后用高效液相色譜—熒光檢測法分析，外標(biāo)法定量。該方法操作簡單，靈敏度高，準(zhǔn)確度和精密度好，可以很好地滿足牛奶、羊奶及奶粉中阿維菌素類藥物的實際檢測需要。

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Determination of 4 kinds of avermectin residues in milk and milk powder by HPLC

ZHANG Yu-jie , LI Dan , LI Qian , WANG He-jia

(China Institute of Veterinary Drug Control , Beijing 100081,China)

An HPLC method for the determination of Eprinomectin, abamectin, ivermectin and doramectin in milk, goat milk and milk powder was developed. The 4 avermectin residues in the samples were extracted with 20%ethanol-acetonitrile solution and the supernatant of the extract was diluted with water and triethylamine, and then applied onto a C18solid phase extraction column for clean-up. The elution was evaporated to dryness and derivatized by 65℃ under darkness for 15 min . The derivatives were achieved by HPLC, and the detection was performed with a fluorescence detector. The calibration curves showed nearly perfect linearity between the peak areas and concentrations of 4 avermectins in range from 0.5 to 1000 ng/mL. The limit of quantification(LOQ) was 0.5 μg/kg for 4 avermectins in milk and goat milk and 5 μg/kg in milk powder. The average recoveries at a range of concentrations were 89.2%-113%, and intra - and inter - batch variation coefficients were 0.450%-9.73% and 2.90%-10.6% respectively. This simple HPLC method with high sensitivity, accuracy and precision can be applied for the detection of avermectins in milk, goat milk and milk powders.

avermectin; milk; milk powder; HPLC

WANG He-jia

2016-10-14

國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估項目(GJFP201600702)

張玉潔(1981 -)，女，助理研究員，碩士，從事獸藥殘留檢測方法學(xué)研究，E-mail:wenkzyj@163.com

王鶴佳，E-mail:pharhejia@163.com

S859

A

0529-6005(2017)04-0088-04