細(xì)小病毒抗原快速檢測(cè)卡臨床使用效果評(píng)價(jià)

朱 軍， 鐘 承， 王安琦， 羅旭陽(yáng)， 陸寶生， 呂艷麗， 李文鵬

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193 ； 2.北京中農(nóng)大動(dòng)物醫(yī)院有限公司，北京海淀100193 ；3.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局， 北京朝陽(yáng)100026 ； 4.河南省社旗縣動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，河南社旗473300)

細(xì)小病毒抗原快速檢測(cè)卡臨床使用效果評(píng)價(jià)

朱 軍1，2， 鐘 承1，3， 王安琦1， 羅旭陽(yáng)1， 陸寶生1， 呂艷麗1， 李文鵬4

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京海淀100193 ； 2.北京中農(nóng)大動(dòng)物醫(yī)院有限公司，北京海淀100193 ；3.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局， 北京朝陽(yáng)100026 ； 4.河南省社旗縣動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，河南社旗473300)

本試驗(yàn)以PCR方法為標(biāo)準(zhǔn)，以臨床收集的213份糞便樣本為檢測(cè)對(duì)象，對(duì)3家商品化犬細(xì)小病毒抗原快速檢測(cè)卡的臨床應(yīng)用效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)：與PCR方法相比較，3家產(chǎn)品各自的敏感性分別為71.7%，66.4%和72.2%；相對(duì)應(yīng)的特異性分別為96%，97%和96%。3家檢測(cè)卡彼此之間的符合率分別為96.7%、99.5%和95.8%。以PCR方法和其中兩種檢測(cè)卡對(duì)同一窩5只感染犬細(xì)小病毒的幼犬的臨床病征與CPV檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性評(píng)估，結(jié)果顯示，犬細(xì)小病毒抗原快速檢測(cè)卡的陰性檢測(cè)結(jié)果與病犬臨床癥狀的緩解或消失時(shí)間呈正相關(guān)，而PCR方法在動(dòng)物臨床病征消失后仍可檢出病毒。

犬細(xì)小病毒； 抗原快速檢測(cè)卡； PCR

犬細(xì)小病毒(CPV)感染是以嘔吐和腹瀉并伴有胃腸道出血等為主要病征的急性傳染性胃腸道疾病，少數(shù)病犬可發(fā)生非化膿性心肌炎，各年齡段犬均可發(fā)病，以6月齡以下幼犬發(fā)病和死亡較多(耿志賢等，2009)。該病傳染性強(qiáng)，有些病犬康復(fù)后仍可長(zhǎng)期通過糞便排毒，成為本病的重要隱性傳染源(孔慶波，2008)。病毒對(duì)外界因素抵抗力較強(qiáng)，在糞便和固體污染物上病毒可存活數(shù)月至數(shù)年(陳莉嫻等，2014)。近10年來，犬細(xì)小病毒抗原快速檢測(cè)卡(CPV檢測(cè)卡)因操作快速、簡(jiǎn)便被廣泛應(yīng)用于國(guó)內(nèi)獸醫(yī)臨床上，對(duì)犬細(xì)小病毒病的診療做出了巨大貢獻(xiàn)。盡管目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上同類產(chǎn)品較多，但尚未見對(duì)這些產(chǎn)品的臨床實(shí)際應(yīng)用效果進(jìn)行橫向比較研究的相關(guān)資料。本實(shí)驗(yàn)室以PCR方法為參考標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司生產(chǎn)的CPV檢測(cè)卡進(jìn)行了臨床應(yīng)用效果評(píng)價(jià)，與此同時(shí)，將其與國(guó)內(nèi)臨床上應(yīng)用廣泛的2家同類進(jìn)口產(chǎn)品的敏感性和特異性進(jìn)行了比較，以期為寵物醫(yī)師選擇使用檢測(cè)產(chǎn)品提供科學(xué)的數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 犬細(xì)小病毒抗原快速檢測(cè)卡與PCR相關(guān)試劑 3種犬細(xì)小病毒抗原快速檢測(cè)卡，分別由北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司提供(元亨)或從北京代理商處購(gòu)入的進(jìn)口犬細(xì)小病毒抗原快速檢測(cè)卡(A和B)。PCRTaqMix由北京艾德萊生物科技有限公司購(gòu)入。

1.2 糞便樣本的采集與預(yù)處理 收集到中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)就診犬的糞便樣本612份，每份樣本取部分以無(wú)菌生理鹽水10倍稀釋后，加入等量的三氯甲烷，充分混勻后3 000 r/min離心5 min，取上清液，同未經(jīng)上述處理的糞便樣本一起置于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 糞便樣本PCR檢測(cè) 采用宋永奇等(2008)建立的PCR方法對(duì)糞便樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游引物P1-UP：5′-CCACCTCATATTTTCATCAA-3′，下游引物P1-DOWN：5′-TGAATCCAATCTCCTTCTG-3′，引物分別位于基因組的2 709～2 728位和其互補(bǔ)鏈的4 015～4 033位，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為1 325 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

煮沸—冰浴法提取病毒DNA(邵偉娟等，2006)：取100 μL“1.2”中已預(yù)處理的糞便上清樣本放入1.5 mL的離心管中，沸水煮沸10 min，即刻冰浴10 min，12 000 r/min離心15 min，取上清液，作為DNA模板備用。

PCR反應(yīng)體系：2 X PCR TaqMix 12.5μL，上游引物、下游引物各1μL(0.01 mol/L)，DNA模板 1.0 μL，無(wú)菌雙蒸水9.5 μL，總體積為25.0 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性4 min后，94 ℃變性30 s，52 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)，最后再以72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物 5 μL 經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，紫外成像觀察并記錄結(jié)果。

1.4 糞便樣本的CPV抗原快速檢測(cè)卡檢測(cè) 將“1.3”中檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的全部樣本和結(jié)果為陰性但被檢樣本來自于具有不同程度的腹瀉癥狀，糞便帶血/醬油色或含有黏膜脫落組織的病犬糞便樣本，分別按(元亨)、A和B 3家公司生產(chǎn)的CPV檢測(cè)卡說明書所述進(jìn)行操作，即用抗原檢測(cè)卡自帶的稀釋液對(duì)糞便樣本進(jìn)行稀釋，取適量稀釋液加入到CPV抗原快速檢測(cè)檢測(cè)卡加樣槽內(nèi)，在規(guī)定時(shí)間內(nèi)進(jìn)行結(jié)果判定。

1.5 糞便樣本復(fù)檢 對(duì)煮沸-冰浴法PCR檢測(cè)結(jié)果為陰性(或陽(yáng)性)而任一檢測(cè)卡檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性(或陰性)的樣本，采用Tris飽和酚法提取DNA，并以此DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果作為樣本的最終結(jié)果；同時(shí)，將這些檢測(cè)樣本離心后取上清液，分別用3種CPV快速檢測(cè)卡復(fù)檢，以確定檢測(cè)卡的最終結(jié)果。

1.6 臨床病犬康復(fù)情況與病原檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性觀察 在中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院住院治療的5只自然感染細(xì)小病毒的同窩金毛幼犬，表現(xiàn)為不同程度的厭食、精神不振和腹瀉，其中1只有便血癥狀。其中3只病犬在住院后第4天腹瀉癥狀消失，另外兩只第5天腹瀉癥狀消失，并于住院第6天全部出院。對(duì)其進(jìn)行跟蹤病原檢測(cè)，即每日采集病犬糞便，分別以(元亨)和A檢測(cè)卡及PCR方法進(jìn)行病原檢測(cè)，同時(shí)記錄每日臨床癥狀，并對(duì)病原檢測(cè)結(jié)果與病犬的臨床病征的改善情況進(jìn)行了相關(guān)性觀察分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 PCR檢測(cè) 以煮沸—冰浴法提取的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖1)，對(duì)612份糞便樣本的CPV帶毒情況進(jìn)行了初篩。選取其中PCR結(jié)果為陽(yáng)性的全部樣本和PCR結(jié)果為陰性但被檢犬具有不同程度腹瀉癥狀、糞便帶血或醬油色、糞便中存在黏膜脫落組織的糞便樣本，共計(jì)213例，用(元亨)和A及B 3家公司生產(chǎn)的CPV快速檢測(cè)卡進(jìn)行了檢測(cè)檢驗(yàn)。對(duì)檢測(cè)卡檢測(cè)為陽(yáng)性而煮沸冰浴法提取DNA進(jìn)行的PCR檢測(cè)結(jié)果為陰性的17份樣本，經(jīng)Tris飽和酚法提取DNA后再次PCR擴(kuò)增。最終共獲得113份陽(yáng)性樣本和100份陰性樣本。

圖1 部分樣品凝膠電泳結(jié)果

M：DNA Marker DL-2 000；N：陰性對(duì)照；3、4、5、8、9、10、12、13、14、15、16號(hào)CPV陽(yáng)性；1、2、6、7、11、17、18號(hào)CPV陰性

2.2 CPV抗原快速檢測(cè)卡檢測(cè) 經(jīng)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的113例樣本和陰性的100例樣本，以(元亨)和A及B 3家公司生產(chǎn)的CPV抗原檢測(cè)卡的檢測(cè)結(jié)果如表1：在113例PCR為陽(yáng)性的樣本中，(元亨)檢測(cè)卡檢出陽(yáng)性樣本81例，陰性32例；A檢測(cè)卡檢出陽(yáng)性樣本75例，陰性38例；B檢測(cè)卡檢出陽(yáng)性樣本82例，陰性31例。對(duì)100例PCR檢測(cè)為陰性的樣本，(元亨)檢測(cè)卡檢出陰性樣本96例，陽(yáng)性4例；A檢測(cè)卡檢出陰性樣本97例，陽(yáng)性3例；B檢測(cè)卡檢出陰性樣本96例，陽(yáng)性4例。與PCR檢測(cè)結(jié)果相比較，(元亨)和A及B檢測(cè)卡的敏感性分別為71.7%、66.4%和72.6%，特異性分別為96%、97%和96%，總符合率分別為83.1%、80.8%和83.6%。(元亨)檢測(cè)卡和A及B檢測(cè)卡的符合率分別為96.7%和99.5%，A和B檢測(cè)卡的符合率為95.8%(見表2)。

表1 CPV抗原快速檢測(cè)卡檢測(cè)結(jié)果與PCR檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性統(tǒng)計(jì)

表2 3種檢測(cè)卡的總符合率

2.3 病犬康復(fù)情況與病原檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性 對(duì)5只住院病犬住院期間每日觀察臨床癥狀并對(duì)糞便樣本進(jìn)行病原檢測(cè)：首日5只病犬抗原快速檢測(cè)卡和PCR方法檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，均表現(xiàn)為厭食、精神不振，且均有嘔吐和腹瀉癥狀，其中3號(hào)病犬有便血癥狀。隨著治療的進(jìn)行，5只病犬在住院的第3～4天臨床癥狀均明顯減輕，其中1、2、5號(hào)病犬在第3天不再發(fā)生嘔吐，第4天腹瀉癥狀消失；3號(hào)病犬便血持續(xù)至第4天，第5天3、4號(hào)病犬腹瀉癥狀消失。住院第6天5只犬均不表現(xiàn)臨床癥狀，全部出院。5只病犬在住院第2～6天的病原檢測(cè)結(jié)果見表3。由表可見，抗原快速檢測(cè)卡檢測(cè)結(jié)果的變化與患犬體況改善情況較為一致，而PCR方法敏感性高，在動(dòng)物明顯好轉(zhuǎn)乃至臨床康復(fù)后仍可檢測(cè)到病毒DNA。

表3 臨床病例病原檢測(cè)結(jié)果

3 討論

3.1 本研究以PCR 方法為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估了3個(gè)商品化CPV抗原檢測(cè)卡的敏感性和特異性，為了簡(jiǎn)便和經(jīng)濟(jì)的獲取充足的陽(yáng)性樣本，本試驗(yàn)首先以煮沸-冰浴法提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；鑒于冰浴煮沸法提取DNA敏感性較低的缺點(diǎn)，本研究以經(jīng)典的飽和酚法提取DNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增作為保證PCR方法敏感性的措施，以此結(jié)果作為標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)對(duì)檢測(cè)卡進(jìn)行敏感性和特異性檢驗(yàn)，從而保證了試驗(yàn)方法科學(xué)合理。本次試驗(yàn)結(jié)果表明，3家公司的CPV抗原快速檢測(cè)卡的敏感性和特異性無(wú)顯著差異。盡管與PCR方法相比較，抗原檢測(cè)檢測(cè)卡的敏感性均較低，但其快速、簡(jiǎn)便和經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢(shì)是PCR方法無(wú)法替代的。

3.2 對(duì)5例經(jīng)治療逐漸康復(fù)的臨床病例的跟蹤檢測(cè)結(jié)果表明，抗原快速檢測(cè)卡的陽(yáng)性檢出結(jié)果與病犬臨床癥狀的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。當(dāng)抗原檢測(cè)卡檢測(cè)結(jié)果轉(zhuǎn)陰性時(shí)，臨床癥狀減輕或消失，但此時(shí)PCR檢測(cè)結(jié)果仍可為陽(yáng)性。因此，在臨床應(yīng)用上，快速檢測(cè)卡的檢測(cè)結(jié)果與動(dòng)物體征的動(dòng)態(tài)變化更加符合，更有利于評(píng)估動(dòng)物的患病狀態(tài)，但PCR檢測(cè)對(duì)于動(dòng)物是否排毒更為敏感。這一結(jié)果為寵物醫(yī)生對(duì)臨床上犬細(xì)小病毒病的經(jīng)驗(yàn)性預(yù)后判斷提供了理論依據(jù)，同時(shí)提示，CPV抗原快速檢測(cè)卡在今后很長(zhǎng)時(shí)期內(nèi)仍將是寵物醫(yī)院中CPV感染最方便快捷的檢測(cè)工具，而PCR方法將可能作為抗原快速檢測(cè)卡的有效補(bǔ)充工具在寵物臨床上應(yīng)用。

3.3 宋永奇等(2008)提到，糞便的復(fù)雜成分(食物殘?jiān)?、?xì)胞碎片、菌體成分等)和檢測(cè)卡中免疫膠體金復(fù)合物或檢測(cè)線上的抗體發(fā)生非特異性結(jié)合，可能是造成CPV檢測(cè)假陽(yáng)性結(jié)果的重要原因，離心粗提可降低假陽(yáng)性發(fā)生率。本試驗(yàn)操作過程中均嚴(yán)格按照CPV快速檢測(cè)檢測(cè)卡說明書進(jìn)行操作，糞便檢測(cè)前先靜置一段時(shí)間，而后取其上清，再用快速檢測(cè)卡自帶的稀釋液進(jìn)行稀釋和檢測(cè)。該方法的檢驗(yàn)結(jié)果與離心上清復(fù)檢的結(jié)果完全一致。這一方面說明，利用CPV抗原快速檢測(cè)卡進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí)，將糞便充分靜置后取上清進(jìn)行檢測(cè)即可有效減少假陽(yáng)性的發(fā)生。

[1] 孔慶波.犬細(xì)小病毒病免疫預(yù)防研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，29(9):62-66.

[2] 陳莉嫻，李信朝.犬細(xì)小病毒病的診斷和防控[J].畜牧與飼料科學(xué)，2014，35(5):114-115.

[3] 宋永奇，李玉燕，呂艷麗，等.種犬細(xì)小病毒感染診斷方法比較[J].畜牧與獸醫(yī)，2008，40(6):31-35.

[4] 邵偉娟，謝建云,胡建華，等.犬細(xì)小病毒核酸診斷方法的建立和應(yīng)用[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2006，16(1):9-11.

[5] 耿志賢，時(shí)彥勝，鄭亞平，等.犬細(xì)小病毒病的流行現(xiàn)狀調(diào)查[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2009，36(11):135-137.

2016-02-24

朱軍(1990- )，男，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物病毒學(xué)，E-mail:asaszhujun@163.com

呂艷麗,E-mail：luyanli@cau.edu.cn

S858.292

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0529-6005(2017)04-0071-03