肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)以心包積液為特征病例的診斷

鄭 成，謝夢(mèng)利，胡羅紅，羅 銳，金梅林，張安定

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢430070 ； 2.農(nóng)業(yè)部獸用診斷制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430070)

肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)以心包積液為特征病例的診斷

鄭 成1，2，謝夢(mèng)利1，胡羅紅1，羅 銳1，2，金梅林1，2，張安定1，2

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢430070 ； 2.農(nóng)業(yè)部獸用診斷制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢430070)

自2014年以來(lái)，出現(xiàn)了一種以發(fā)生于28～35日齡、發(fā)病急、病死率高、剖檢可見(jiàn)心包積液、肝臟壞死、腎臟腫大、出血為特征的雞急性傳染病的病例。本研究通過(guò)其中一例典型病例的病原分離鑒定研究，發(fā)現(xiàn)禽腺病毒檢測(cè)為陽(yáng)性。進(jìn)一步通過(guò)禽腺病毒的動(dòng)物回歸試驗(yàn)、病理組織切片分析等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該病毒可引起雞出現(xiàn)相似的臨床發(fā)病特征和病理變化特征。通過(guò)對(duì)病毒的hexon基因序列及推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析，其與血清4型的同源性最高。因此，確定該病的病原為禽腺病毒血清4型，也確認(rèn)雞心包積水綜合征在我國(guó)肉雞場(chǎng)的發(fā)生和流行。

雞 ； 心包積液 ； 禽腺病毒血清型4型

雞心包積水綜合征最早報(bào)道于1988年，是Jaffery和Khawaja分別在巴基斯坦和印度發(fā)現(xiàn)的一種引起3～7周齡肉雞高死亡率(70%)的新病[1]。病變特征是心包內(nèi)蓄積有草黃色水樣或果胨狀物，并伴有肝臟腫大、質(zhì)脆、色淡，核內(nèi)有嗜酸性或嗜堿性包涵體，腎充血。其后日本[2-3]、韓國(guó)[4]等國(guó)均先后報(bào)道了這種有嚴(yán)重心包積水的綜合征[5]。

2014年，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部獸用診斷制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)某肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)了雞急性傳染病的病例。該病主要發(fā)生于生長(zhǎng)速度快的肉雞，發(fā)病率為30%～50%，發(fā)病時(shí)病雞精神沉郁，采食下降，聚堆趴窩，排出黃綠色稀糞，嚴(yán)重者死亡。剖檢死亡雞，可見(jiàn)心包有2～8 mL黃褐色積液，肝臟、腎臟腫大、出血，盲腸扁桃體出血。取病死雞的組織固定、制作切片、染色觀察。通?？梢?jiàn)肝臟、腎臟和心臟均有明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、變性和壞死。為了確診該病，我們進(jìn)行了病原分離、鑒定以及動(dòng)物回歸試驗(yàn)研究，確診該病為禽腺病毒血清型4型感染所致。

1 材料與方法

1.1 試劑、抗原和試驗(yàn)動(dòng)物 TRIZol、AMV、RNA酶抑制劑、rTaqDNA聚合酶、dNTP混合物、DNA提取試劑盒，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。SPF雞胚、SPF雞來(lái)自于山東種雞場(chǎng)。新城疫、禽流感等疾病標(biāo)準(zhǔn)抗原及PCR引物由本實(shí)驗(yàn)室保存。其他化學(xué)試劑均本國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 病原分離 從典型的發(fā)病雞的心臟、肝臟、脾臟、腎臟等組織，剪碎并以1∶1比例加入無(wú)菌PBS勻漿，制成組織懸液，凍融后，8 000 r/min離心5 min，上清用PBS按1∶1 000稀釋，經(jīng)0.22 μm微孔膜過(guò)濾，濾液經(jīng)卵黃接種6日齡SPF雞胚，0.2 mL/胚，37 ℃孵育，每天觀察，取出死胎，觀察胚胎病變，收集死亡胚胎尿囊液作為毒種[6]。

1.3 病原鑒定

1.3.1 RT-PCR和PCR 將發(fā)病雞的心臟、肝臟、腎臟、脾臟及其他病變器官剪碎，加入無(wú)菌PBS勻漿，制成組織懸液，凍融后離心取上清，提RNA、反轉(zhuǎn)錄cDNA，分別用高致病性禽流感病毒(HPAIV)、新城疫病毒(NDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)和傳染性腔上囊病毒(IBDV)的特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果。

提組織懸液的基因組，參照文獻(xiàn)[7-8]，用禽腺病毒(FAV)特異性引物FAVHL和FAVHR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的片段大小為728 bp，瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果。

FAVHL:5′-GACATGGGGTCGACCTATTTCGACAT-3′；FAVHR:5′-AGTGATGACGGGACATCAT-3′。

1.3.2hexon的克隆、測(cè)序及同源性分析 參照文獻(xiàn)[9]，hexon基因序列設(shè)計(jì)引物FADV-serotypeF和FADV-serotypeR，PCR擴(kuò)增特異片段，經(jīng)測(cè)序，利用DNAman軟件，將分離獲得的毒株基因(SD)和腺病毒(FAV)不同血清型基因序列轉(zhuǎn)換為氨基酸序列，并進(jìn)行同源性比對(duì)分析，繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

FADV-serotypeF：5′-CAARTTCAGRCAGACGGT-3′；FADV-serotypeR：5′-TAGTGATGMCGSGACATCAT-3′。1.4 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 將10只購(gòu)買的30日齡SPF白羽雞隨機(jī)分成兩組，攻毒組和對(duì)照組各5只。飼養(yǎng)一周后，進(jìn)行病毒的感染試驗(yàn)。攻毒組每只雞頸部皮下接種由無(wú)菌PBS按1∶10稀釋的毒種0.2 mL，對(duì)照組每只雞按同樣方式接種等量無(wú)菌PBS。攻毒后，雞只正常飼養(yǎng)，觀察兩周并記錄發(fā)病和死亡情況。動(dòng)物死亡后，立即剖檢，觀察組織器官病變，分離病原，PCR檢測(cè)FAV-4是否為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 病雞剖檢 某肉雞場(chǎng)出現(xiàn)了一種以發(fā)生于28～35日齡、發(fā)病迅速、病死率高、剖檢可見(jiàn)心包積液、肝臟壞死、腎臟腫大、出血為特征的雞急性傳染病的病例。為了確診該病，取新鮮死亡樣本剖檢。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，如中插彩版圖1所示，心包有2～8 mL黃褐色清亮積液，腹腔有黃色膠胨樣滲出，肝臟、腎臟腫大、出血，十二指腸有出血點(diǎn)，盲腸扁桃體腫大、出血。

將病死雞的組織固定、制作切片、H.E.染色觀察。發(fā)現(xiàn)肝組織局部區(qū)域壞死，壞死灶細(xì)胞核消失，胞漿淡染。脾組織結(jié)構(gòu)紊亂，紅髓與白髓界限模糊，白髓區(qū)，細(xì)胞排列散亂。腎小管上皮細(xì)胞水腫，腎小管上皮細(xì)胞部分細(xì)胞核固縮，胞漿出現(xiàn)空腔。心肌纖維間隙水腫，胞漿淡染，可見(jiàn)較多空泡；心肌間隙可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(中插彩版圖2)。

2.2 病原分離與鑒定 鑒于該病的臨床癥狀，初步懷疑該病為高致病性禽流感病毒(HPAIV)、新城疫病毒(NDV)、傳染性腔上囊病病毒(IBDV)、傳染性支氣管炎病毒(IBV)和禽腺病病毒(FAV)感染所引起。因此，將病料提RNA，RT-PCR擴(kuò)增HPAIV、NDV、IBV和IBDV；提病料的基因組，PCR擴(kuò)增FAV。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，HPAIV、NDV、IBDV、IBV結(jié)果為陰性，F(xiàn)AV結(jié)果呈陽(yáng)性。說(shuō)明該心包積液病例不是感染HPAIV、NDV、IBV和IBDV，很可能是由于感染了禽腺病病毒(FAV)所致。

2.3 病原分離與鑒定 由于FAV血清型眾多，而且其血清型的劃分依賴于hexon抗原性差異。參考文獻(xiàn)[9]，對(duì)hexon進(jìn)行擴(kuò)增及測(cè)序。我們利用hexon基因氨基酸同源性繪制的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖3)，通過(guò)比較分離毒株(SD)hexon基因氨基酸序列與其他血清型之間的同源性，發(fā)現(xiàn)本毒株與腺病毒血清型4型同源性最高，為96%。因此，該毒株應(yīng)該為血清型4型。

圖3 FAV不同血清型毒株的進(jìn)化樹(shù)圖

2.4 分離病毒的動(dòng)物回歸試驗(yàn) 將分離到的病毒感染SPF雞進(jìn)行本動(dòng)物回歸試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)攻毒組所有雞在攻毒后第3天均出現(xiàn)精神極度沉郁，不飲不食，趴窩，其中3只迅速死亡，第4天，攻毒組完全死亡，而對(duì)照組雞無(wú)明顯發(fā)病表現(xiàn)(圖4)。攻毒組雞的發(fā)病特征與雞場(chǎng)發(fā)病的特征相似，說(shuō)明FAV-4很可能是導(dǎo)致肉雞場(chǎng)雞發(fā)病甚至死亡的原因。

圖4 攻毒組1(FAV-4)和對(duì)照組1(PBS)的存活率

剖檢攻毒組死雞可見(jiàn)，心包有2～5 mL黃褐色清亮積液，腹腔有膠胨狀黃色滲出，肝臟、腎臟和脾臟出血、腫脹，盲腸扁桃體出血，十二指腸出血，直腸末端有針尖狀出血點(diǎn)，與肉雞場(chǎng)案例中的臨床特征一致。

而且所有攻毒組死亡雞均分離到FAV-4。進(jìn)一步確定了FAV-4是導(dǎo)致該肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)心包積水病例的病原。

3 討論

禽腺病毒4型是引起肉雞包涵體肝炎-心包積水綜合征的特異病原體，目前已經(jīng)成為全球肉雞生產(chǎn)中的一個(gè)嚴(yán)重問(wèn)題。自2014年，我國(guó)山東、湖北和河南等地養(yǎng)雞場(chǎng)也有報(bào)道類似病例的發(fā)生[10]，對(duì)我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)構(gòu)成巨大的威脅，因此，該病例的診斷和防治十分必要。

2014年，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部獸用診斷制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)類似病例，通過(guò)RT-PCR和PCR進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)，結(jié)果顯示，HPAIV、NDV、IBDV、IBV為陰性，F(xiàn)AV結(jié)果呈陽(yáng)性。通過(guò)對(duì)病毒的hexon基因序列及推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析，確定其血清分型為腺病毒血清型4型。通過(guò)動(dòng)物回歸試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)可引起相似的臨床癥狀與病變，并且在攻毒組病死雞中也分離出FAV-4病毒。從而確診了以心包積液為特征的傳染病的病原為FAV-4。

另外，有文獻(xiàn)報(bào)道FAV-4單獨(dú)不致病，只有在雞感染傳染性腔上囊病病毒或者傳染性貧血病毒時(shí)才會(huì)導(dǎo)致雞心包積液綜合征的發(fā)生[11]。而本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在未感染其他病毒時(shí)，F(xiàn)AV-4也能導(dǎo)致雞心包積液綜合征的發(fā)生，并且發(fā)病迅速，死亡率高。當(dāng)然，對(duì)于在感染傳染性腔上囊病病毒或者傳染性貧血病毒時(shí)，對(duì)腺病毒感染的影響，值得后續(xù)進(jìn)一步深入研究。心包積液綜合征已經(jīng)對(duì)國(guó)內(nèi)發(fā)病地區(qū)的養(yǎng)雞行業(yè)造成的極大的經(jīng)濟(jì)損失，應(yīng)予以重視。

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Diagnosis of an Infectious Disease Characterized with Hydropericardium in Broiler Farm

ZHENG Cheng1，2，XIE Meng-li1，HU Luo-hong1，LUO Rui1，2，JIN Mei-lin1，2，ZHANG An-ding1，2

(1.College of Veterinary Medicine，Huazhong Agricultural University , Wuhan 430070 , China 2.Key Laboratory of development of veterinary diagnostic products，Ministry of Agriculture，Wuhan 430070，China)

Since 2014，we have noticed that a new chicken disease emerged in the broiler farms，which is characterized by an acute outbreak at 28-35 days of age，high mortality with pericardial effusion，liver necrosis，renal swelling and bleeding.In the present study，one of the typical case of the diseases was selected for the identification of the pathogen.Fowl adenovirus was detected by PCR.The isolated virus caused similar clinical signs and pathological changes in chickens during the animal regression test.According to gene sequence and the deduced amino acid sequence ofhexon，the isolated virus showed high homology to serotype 4.Based on the study，we conclude that the pathogen of the hydrocephalus syndrome is fowl adenovirus serotype 4.

Chicken; Hydropericardium; Fowl adenovirus serotype 4(FAV-4)

ZHANG An-ding

2016-06-02

鄭成(1993-)，女，碩士生，研究方向?yàn)閯?dòng)物傳染病學(xué)，E-mail:zhengcheng@webmail.hzau.edu.cn

張安定，E-mail:andye8019@126.com

S855.3

A

0529-6005(2017)04-0036-03