一氧化氮合酶、白細(xì)胞介素-8在不同類型胃食管反流病中的表達(dá)及意義

肖 蘭

四川省攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(攀枝花617000)

一氧化氮合酶、白細(xì)胞介素-8在不同類型胃食管反流病中的表達(dá)及意義

肖 蘭

四川省攀枝花學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科(攀枝花617000)

目的：對比不同類型胃食管反流病(GERD)食管黏膜上一氧化氮合酶(NOS)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)蛋白表達(dá)水平及在胃食管反流病發(fā)病中的意義。方法：反流性食管炎患者59例(RE組)、非糜爛性反流病(NERD組)患者58例及Barrett食管患者60例(BE組)，評估三組患者的食管黏膜損傷、酸反流情況，同時三組均于胃鏡下取病變食管黏膜，采用Western免疫組化法測定NOS及LI-8蛋白表達(dá)水平，比較三組患者損傷食管的免疫細(xì)胞學(xué)指標(biāo)變化。結(jié)果：所有GERD患者食管下段黏膜組織中，兩種NOS表達(dá)均出現(xiàn)異常，BE主要表達(dá)于化生的柱狀上皮腺體胞漿，而RE、NERD主要表達(dá)于鱗狀上皮的胞漿，其中 BE 組nNOS與iNOS的表達(dá)量均為1.1 β-actin；RE組nNOS的表達(dá)量為1.7 β-actin，iNOS表達(dá)量2.3 β-actin，NERD 組nNOS的表達(dá)量為1.3β-actin，iNOS表達(dá)量1.4 β-actin。三組之間NOS的mRNA表達(dá)量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),NOS表達(dá)量RE組>NERD組>BE組；BE、RE、NERD三組的IL-8表達(dá)水平分別為(195.06±67.59) pg/ml、(207.52±86.28) pg/ml、(202.07±81.52) pg/ml；三組IL-8 表達(dá)水平兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：IL-8和NOS可能共同參與了食管黏膜炎癥反應(yīng)，在導(dǎo)致食管黏膜損傷過程中可能起到了協(xié)同介導(dǎo)作用，但其具體機制仍需進(jìn)一步探討。

胃食管反流病(Gastroesophageal reflux disease,GERD) 是胃、十二指腸內(nèi)容物反流,進(jìn)入食管引起反酸、燒心、胸痛、呼吸困難等臨床癥狀，并在病理上引起胃、食管黏膜組織損傷的常見消化道疾病[1]。根據(jù)食管損傷后是否存在炎癥而將GERD分為反流性食管炎(RE)和非糜爛性反流病(NERD)及Barrett食管(BE)三個類型。GERD在亞洲國家發(fā)病率為5%～17%，近年來其發(fā)病率呈逐年上升趨勢[2]。NERD和RE是最常見的GERD類型,有學(xué)者認(rèn)為NERD屬GERD的輕型現(xiàn),從NERD轉(zhuǎn)變?yōu)镽E是疾病由輕轉(zhuǎn)重的發(fā)展過程[3]。目前GERD的病理生理機制尚不夠明確,但主要認(rèn)為其與胃食管連接部的抗反流屏障結(jié)構(gòu)破壞或功能障礙以及食管防御功能進(jìn)行性減退有關(guān)[4],而食管黏膜組織損傷和酸反流則被認(rèn)為是其發(fā)病機制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)一氧化氮合酶(NOS)及白細(xì)胞介素-8(IL-8)表達(dá)與GERD患者的食管黏膜組織損傷有關(guān),但其具體機制仍不明確[6]。本課題從基因蛋白水平對比NOS及LI-8在不同類型GERD患者食管黏膜的表達(dá)差異,旨在探討不同類型GERD的發(fā)病機制,為臨床開拓新的治療方法提供理論依據(jù)。

資料與方法

1 一般資料 選取我科于2013年9月至2015年6月收治的根據(jù)內(nèi)鏡下表現(xiàn)及病理特點確診為RE、NERD及BE患者為研究對象。RE組59例,男41例,女18例,年齡24～71歲之間、平均(52.3±8. 7)歲，平均病程(8.31±3.73)年。NERD組58例, 男39例,女19例,年齡23～70歲、平均(51.6±9.2)歲，平均病程(7.96±3.85)年。BE組60例, 男43例,女17例,年齡22～74歲、平均(52.3±8.9)歲，平均病程(8.14±3.72)年。三組在性別、年齡、病程、癥狀RDQ量表評分等方面比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。診斷標(biāo)準(zhǔn):本研究GERD的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2007年頒布的《中國胃食管反流病共識意見》關(guān)于GERD的診斷標(biāo)準(zhǔn)制定[7]。

2 檢查方法 ①內(nèi)鏡檢查：檢查前5 d停用抑制胃酸分泌、質(zhì)子泵抑制劑(PPI)和促進(jìn)胃動力藥物，檢查前12 h內(nèi)禁食、禁水。三組患者均采取平臥位,在Olympus EVIS-XQ260/240 型號電子胃鏡協(xié)助下觀察并記錄患者胃內(nèi)組織病理表現(xiàn)，根據(jù)不同分型納入不同組別。②活檢方法：BE及RE患者在接受胃鏡檢查同時接受病變部位組織活檢，共取4塊活檢組織，NERD組患者則于食管遠(yuǎn)端鱗狀上皮與柱狀上皮交界處上2 cm取4塊活檢組織。所有活檢組織取出后其中2塊組織立即置于液氮中保存30 min后置于-80 ℃冰箱中備用，另2塊組織立即用100 ml/L甲醛固定4 h后行HE染色及NOS免疫組化染色。③NOS-PCR檢測：提取RNA,瓊脂糖凝膠電泳鑒定,-80 ℃保存。并用Nano DropND-1000光度計測定含量和純度，根據(jù)測定RNA含量標(biāo)準(zhǔn)化。然后合成cDNA并進(jìn)一步行實時熒光PCR定量。以NCBI Gen Bank提供的人類基因序列行NOS引物設(shè)計,由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成。反應(yīng)體系為 Real time PCR Master Mix(2×) 12.5 μl,上游引物(10 μmol/L)各1 μl,cDNA 1 μl，Green DNA I dye(5×)3 μl,用DEPC水將總反應(yīng)體積加到25 μl。反應(yīng)條件為95 ℃,15 min;然后95 ℃,30 s;60 ℃,1 min;70 ℃,30 s共40個循環(huán)。同時用去離子水代替cDNA作為PCR反應(yīng)體系的陰性對照。④ELISA 檢測IL-8表達(dá)水平：采取患者肘靜脈血4 ml,制備血清標(biāo)本,充分分解，然后加樣、稀釋標(biāo)本置于反應(yīng)孔、加入待測樣品，再加入IL-8 抗體；溫育洗滌后加入親和鏈酶素-HRP，混勻溫育30 min；洗滌4次后每孔加入底物A、B各50 μl混勻，37 ℃溫育 10 min，避免光照；取出酶標(biāo)板，立即加入50 μl 終止液測定結(jié)果。

結(jié) 果

1 三組HE染色對比 見圖1。BE 光鏡下可見柱狀上皮化生；RE 可見鱗狀上皮增生、黏膜糜爛,伴炎性細(xì)胞浸潤；NERD 偶見鱗狀上皮增生及炎性細(xì)胞浸潤。

A:BE組,B：RE組,C：NERD組

2 NOS在不同類型胃食管反流病中的表達(dá) 見圖2。BE主要表達(dá)于化生的柱狀上皮腺體胞漿,而RE、NERD主要表達(dá)于鱗狀上皮的胞漿。其中 BE 組nNOS與iNOS的表達(dá)量均為1.1 β-actin；RE組nNOS的表達(dá)量為1.7 β-actin，iNOS表達(dá)量2.3 β-actin；NERD 組nNOS的表達(dá)量為1.3 β-actin，iNOS表達(dá)量1.4 β-actin。三組之間NOS的mRNA表達(dá)量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。NOS表達(dá)量：RE組>NERD組>BE組。

3 IL-8在不同類型胃食管反流病中的表達(dá) BE、RE、NERD 三組的IL-8表達(dá)水平分別為(195.06±67.59)pg/ml、(207.52±86.28)pg/ml、(202.07±81.52)pg/ml；三組IL-8 表達(dá)水平兩兩比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

4 NOS與血清IL-8表達(dá)量相關(guān)性分析 見圖3。經(jīng)Spearman相關(guān)分析，NOS與血清IL-8呈正相關(guān)(r=0.56，P<0.05)。

A：nNOS；B：iNOS

與 RE組比較，*P<0.05;與NERD組比較，#P<0.05

圖2 NOS在不同類型胃食管反流病中的表達(dá)

圖3 NOS與IL-8相關(guān)性分析

討 論

目前，研究已表明NO為非腎上腺素能和非膽堿能神經(jīng)的主要抑制性遞質(zhì),其介導(dǎo)的食管反應(yīng)對維持食管的張力起到關(guān)鍵作用[8]。NO由NOS介導(dǎo)生成，NOS的活性可直接調(diào)節(jié)NO的生成量及生物學(xué)效應(yīng),因此可通過測定NOS活性評估食管黏膜組織細(xì)胞中NO的含量[9]。NO亦是炎性介質(zhì)，iNOS在正常狀態(tài)下不表達(dá),在細(xì)胞因子等刺激下誘導(dǎo)性表達(dá)，并產(chǎn)生NO,與超氧化物反應(yīng)產(chǎn)生過氧化亞硝酸(PXN)，最后加速氧化脂類和巰基化合物,引起急慢性炎癥[10]。本研究采用免疫組化方法檢測了nNOS和iNOS在不同類型GERD患者食管黏膜組織中的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有GERD患者食管下段黏膜組織中,兩種NOS表達(dá)均出現(xiàn)異常,BE主要表達(dá)于化生的柱狀上皮腺體胞漿,而RE、NERD主要表達(dá)于鱗狀上皮的胞漿,其中 BE 組nNOS與iNOS的表達(dá)量均為1.1 β-actin；RE組nNOS的表達(dá)量為1.7 β-actin，iNOS表達(dá)量2.3β-actin,NERD 組nNOS的的表達(dá)量為1.3 β-actin,iNOS表達(dá)量1.4 β-actin。三組之間NOS的mRNA表達(dá)量有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05),NOS表達(dá)量RE組>NERD組>BE組,提示iNOS和nNOS可能共同導(dǎo)致食管組織內(nèi)、細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間NO的分布及量的改變,而此種改變正是食管平滑肌功能障礙的關(guān)鍵，如若病情未得到有效控制，這種改變加重的趨勢者越加明顯。通過查閱大量文獻(xiàn)，我們認(rèn)為上述改變與LES的功能下降關(guān)系密切，從而導(dǎo)致患者出現(xiàn)反酸、噯氣、燒心等癥狀，反流的存在不斷刺激食管組織分泌NO，造成惡性循環(huán)，因此我們有理由相信NOS的高水平分泌時食管黏膜損傷的重要因素，它產(chǎn)生的NO介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可能與食管反流疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

IL-8為一種強有效的中性粒細(xì)胞CXC類趨化因子,可啟動和促進(jìn)炎癥反應(yīng)。有報道[11]GERD患者食管黏膜上IL-8、蛋白的表達(dá)水平高于健康對照組,提示IL-8參與了食管黏膜的炎癥損傷。本研究中BE、RE、NERD 三組的IL-8表達(dá)水平分別為(195.06±67.59) pg/ml、(207.52±86.28) pg/ml、(202.07±81.52) pg/ml；三組IL-8 表達(dá)水平兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而且從BE、NERD到BE,隨著病情嚴(yán)重程度增加,其IL-8表達(dá)也升高,表明IL-8的表達(dá)是也食管黏膜炎癥損傷嚴(yán)重程度的一個敏感指標(biāo)。通過相關(guān)分析,我們發(fā)現(xiàn)GERD患者的NOS表達(dá)與IL-8表達(dá)呈正相關(guān),說明IL-8和NOS可能共同參與了食管黏膜炎癥反應(yīng),在導(dǎo)致食管黏膜損傷過程中可能起到了協(xié)同介導(dǎo)作用。

綜上所述，本研究探索了不同類型GERD患者食管下段黏膜組織中NOS的表達(dá)變化和血清白細(xì)胞介素-8的表達(dá)變化，認(rèn)為IL-8和NOS可能共同參與了食管黏膜炎癥反應(yīng)，在導(dǎo)致食管黏膜損傷過程中可能起到了協(xié)同介導(dǎo)作用，但其具體機制仍需進(jìn)一步探討。

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(收稿：2016-10-19)

Significance of NOS joint IL-8 expression in different types of gastroesophageal reflux disease

Xiao Lan.

Affiliated Hospital of Sichuan Panzhihua Medical College(Panzhihua 617000)

Objective：To compare the different types of gastroesophageal reflux disease (GERD) in the esophageal mucosa nitric oxide synthase (NOS) and interleukin -8 (IL-8) protein expression levels, explore NOS and LI-8 in different types of gastroesophageal reflux disease in significance. Methods： Gastroenterology endoscopic and pathological features of patients diagnosed with reflux esophagitis 59 cases (RE group) and diagnosed as non-erosive reflux disease (NERD group ) of 58 patients, and 60 patients with Barrett's esophagus (BE group) as the object of study, comparative assessment of the three groups of esophageal mucosa damage, acid reflux cases, while three were taken to the endoscopic esophageal lesions by western immunohistochemistry Determination of the method and its NOS LI-8 protein levels, immune cytology were compared indicators damage the esophagus. Results：All patients with GERD esophageal mucosa, both NOS expression of abnormal, BE mainly expressed in the cytoplasm of glandular metaplasia of columnar epithelium, and RE, NERD mainly expressed in the cytoplasm of squamous epithelium, in which BE group nNOS and iNOS expression were 1.1 β-actin; nNOS expression RE group was 1.7β-actin, iNOS expression 2.3β-actin, the amount of nNOS expression NERD group was 1.3β-actin, iNOS expression 1.4 β-actin. The expression of mRNA NOS among the three groups were significantly different by the statistics (allP<0.05), NOS expression of RE group> NERD group> BE Group; BE, RE, NERD IL-8 expression level of the three groups were(195.06±67.59)pg/ml,(207.52±86.28)pg/ml, (202.07±81.52)pg/ml; three groups of IL-8 expression level of any two differences were statistically significant (P<0.05). Conclusion：IL-8 and NOS esophageal mucosa may be involved in the inflammatory response, leading to esophageal mucosal injury in the process may play a synergistic role in mediating, but the exact mechanism remains to be explored.

Gastroesophageal reflux Nitric oxide synthase Interleukin-8 Causality

胃食管反流 一氧化氮合酶 白細(xì)胞介素-8 因果律

R571

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.06.038