紅景天苷對(duì)急性缺氧性神經(jīng)細(xì)胞損傷保護(hù)作用及機(jī)制探討

王 軍,曹 艷,常 江,蒲亞蕓

武警陜西省總隊(duì)醫(yī)院麻醉科(西安710054)

紅景天苷對(duì)急性缺氧性神經(jīng)細(xì)胞損傷保護(hù)作用及機(jī)制探討

王 軍,曹 艷,常 江,蒲亞蕓

武警陜西省總隊(duì)醫(yī)院麻醉科(西安710054)

目的：探討紅景天苷對(duì)急性缺氧性神經(jīng)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。方法：新生小鼠處死后取大腦皮層神經(jīng)元進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)，神經(jīng)元細(xì)胞經(jīng)紅景天苷處理后測定胞內(nèi)ATP水平、己糖激酶等活性，提取mRNA通過RT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)PI3K、己糖激酶、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體-1 mRNA表達(dá)水平。同時(shí)以1%低氧處理原代神經(jīng)元細(xì)胞建立急性缺氧模型，紅景天苷處理后，通過MTT法觀察紅景天苷對(duì)缺氧神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用，PI3K抑制劑LY294002處理缺氧神經(jīng)元細(xì)胞后探討紅景天苷的分子保護(hù)機(jī)制。結(jié)果：紅景天苷組處理細(xì)胞的PI3K、己糖激酶(HK)、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(GLUT-1)等表達(dá)水平顯著升高, HK活性增強(qiáng)，胞內(nèi)ATP水平顯著提高。PI3K抑制后紅景天苷的上述作用明顯減弱。缺氧處理促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞死亡，紅景天苷減少缺氧性神經(jīng)細(xì)胞死亡，PI3K抑制后紅景天苷的上述作用明顯減弱。結(jié)論：紅景天苷處理可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞中PI3K的表達(dá),增加葡萄糖代謝,提高胞內(nèi)ATP水平，抑制缺氧性神經(jīng)細(xì)胞損傷。

紅景天具有抗高原缺氧作用，其主要成分紅景天苷對(duì)心臟和大腦等器官的缺血再灌注損傷可產(chǎn)生一定的保護(hù)作用[1]。文獻(xiàn)報(bào)道,紅景天苷可增強(qiáng)培養(yǎng)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞對(duì)抗缺氧性死亡的能力,起到細(xì)胞保護(hù)作用[2-3]。紅景天苷還可促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞分化,并促進(jìn)分化的神經(jīng)元細(xì)胞生長[4]。可見,紅景天苷對(duì)腦神經(jīng)細(xì)胞具有良好的保護(hù)作用，為其臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。不過，目前有關(guān)紅景天苷神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制研究并不完全清楚。多數(shù)研究表明，缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)介導(dǎo)紅景天苷的多種生物學(xué)效應(yīng)[5]。另外，JAK2-STAT3信號(hào)途徑可介導(dǎo)紅景天苷抗結(jié)腸癌的作用[6]。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)信號(hào)分子激活是紅景天苷減弱心肌缺血再灌注損傷的細(xì)胞內(nèi)主要分子機(jī)制[7]。已知，糖代謝和細(xì)胞內(nèi)ATP生成變化對(duì)于細(xì)胞活性至關(guān)重要。本研究觀察了紅景天苷保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞抗損傷過程中糖代謝和能量變化情況，進(jìn)一步探討紅景天苷保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞的機(jī)制。

材料和方法

1 材 料 Balb/c小鼠由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。四氮唑鹽(MTT)購自于碧云天生物科技有限公司。SYBR green熒光定量PCR試劑盒由Takara公司提供。己糖激酶檢測試劑盒購自上海索寶生物科技有限公司。細(xì)胞ATP定量檢測試劑盒和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體-1(GLUT-1)檢測試劑盒分別購自Sigma公司及武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：出生5 d的雄性Balb/c小鼠處死后快速于冰冷條件下取大腦皮質(zhì),預(yù)冷的PBS沖洗后加入0.25%胰酶于37℃消化10 min,終止消化后,吹打組織成勻漿，離心去上清，加入培養(yǎng)液(DMEM/F12+20%FBS)接種，6 h后取出未貼壁神經(jīng)元細(xì)胞，按實(shí)驗(yàn)要求種植于培養(yǎng)板中，次日加入阿糖胞苷(5g/ml)培養(yǎng)，獲得原代神經(jīng)元細(xì)胞。

2.2 原代神經(jīng)元細(xì)胞處理：原代神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理，10 mg/ml紅景天苷處理神經(jīng)元細(xì)胞48 h觀察其對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制;之后紅景天苷處理細(xì)胞48 h，再以1%低氧處理6 h建立缺氧模型，檢測紅景天苷對(duì)缺氧性神經(jīng)元保護(hù)作用。以往的文獻(xiàn)報(bào)道紅景天苷的保護(hù)機(jī)制可能是通過PI3K通路實(shí)現(xiàn)[7]，為了明確紅景天苷對(duì)缺氧性神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用的分子機(jī)制，上述三組先以1mol/L PI3K抑制劑LY294002預(yù)處理48 h，再分別以紅景天苷和(或)缺氧處理；同時(shí)以PI3K抑制劑LY294002單獨(dú)處理及正常未處理細(xì)胞作為陰性對(duì)照或空白對(duì)照。

2.3 定量RT-PCR：神經(jīng)元細(xì)胞經(jīng)過處理后,去除上清,加入裂解液,用RNA提取試劑盒提供的試劑和步驟提取RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,隨后應(yīng)用定量PCR方法進(jìn)行檢測。所用引物的序列如下：己糖激酶(HK)的上游引物5’-CAT GAG GAA GAT GCT TGC CG-3’,下游引物5’-CTA CCA GCA CTC TGC TTG CC-3’。GLUT-1的上游引物5’- GCC CCC AGA AGG TTA TTG A -3’，下游引物5’- CGT GGT GAG TGT GGT GGA T -3’。PI3K的上游引物5’- ACA GAT TGA ATC GCA CAC GC -3’,下游引物5’- GAG GAA TGG ATG AGG GCG TC -3’。內(nèi)對(duì)照18S的上游引物5’-CGG CTA CCA CAT CCA AGG AA-3’,下游引物5’-GCT GGA ATT ACC GCG GCT-3’。采用Delta-delta Ct法對(duì)基因表達(dá)水平差異進(jìn)行分析。

2.4 HK活性測定：細(xì)胞種植于6孔板，分組處理后，去除培養(yǎng)液，用PBS洗細(xì)胞兩次，加入勻漿緩沖液刮細(xì)胞至微量離心管內(nèi)超聲破碎細(xì)胞離心細(xì)胞上清液用于酶活性測定。己糖激酶活性測定采取6-磷酸葡萄糖脫氫酶偶聯(lián)比色法,反應(yīng)體系3 ml，充分混勻后，30℃水浴 5 min，再加入細(xì)胞上清液50 μl進(jìn)行反應(yīng)，在340 nm處讀取吸光度的變化，每30 s記錄1次，連續(xù)記錄3 min，測出每分鐘光密度增加值。與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比計(jì)算己糖激酶活性。

2.5 細(xì)胞內(nèi)ATP水平測定：根據(jù)熒光素酶化學(xué)發(fā)光法測定ATP水平。細(xì)胞種植于6孔板分組處理后去除培養(yǎng)液，每孔加入200l裂解液，裂解后12 000×g離心5～10 min,取上清用于ATP水平測定。加100l ATP檢測工作液到檢測孔或檢測管內(nèi)。室溫放置3～5 min,隨后在檢測孔或檢測管內(nèi)加上100l樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，迅速混勻，立即用化學(xué)發(fā)光測定儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度測定。各個(gè)樣本的化學(xué)發(fā)光測定值與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比計(jì)算ATP水平。

2.6 GLUT-1表達(dá)水平檢測：細(xì)胞種植于96孔板，分組處理后，取細(xì)胞培養(yǎng)上清于1000 r/min離心20 min，除去雜質(zhì)及細(xì)胞碎片。取上清在450 nm處檢測。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中GLUT-1的表達(dá)水平。

2.7 細(xì)胞活性測定：小鼠神經(jīng)元細(xì)胞均勻種植于96孔板中,在培養(yǎng)2 d后,加藥處理后,在收取細(xì)胞前4 h加入MTT(5 mg/ml),37℃孵育4 h,隨后去除細(xì)胞上清,加入二甲基亞砜(DMSO)(100l/孔)溶解MTT結(jié)晶，脫色搖床混勻后在酶標(biāo)儀上檢測560 nm處的吸光度。根據(jù)吸光度反映細(xì)胞活性。

結(jié) 果

1 紅景天苷誘導(dǎo)PI3K、HK、GLUT-1的基因表達(dá) 見圖1。紅景天苷(10 mg/ml)處理2 d后，小鼠神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)HK、GLUT-1基因表達(dá)水平較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)。同時(shí)，代謝相關(guān)調(diào)節(jié)基因PI3K表達(dá)也顯著升高(P<0.05)。

2 紅景天苷增加神經(jīng)元細(xì)胞HK活性和細(xì)胞內(nèi)ATP水平 紅景天苷(10 mg/ml)處理2 d后,小鼠神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)HK活性較對(duì)照組顯著升高(P<0.05),圖2A。小鼠神經(jīng)元細(xì)胞的胞內(nèi)ATP水平也較對(duì)照組顯著升高(P<0.05),圖2B。

與對(duì)照組比較，*P<0.05

與對(duì)照組比較，*P<0.05

3 紅景天苷對(duì)缺氧性神經(jīng)元細(xì)胞損傷的保護(hù)作用 見圖3。急性缺氧可導(dǎo)致小鼠神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)明顯的死亡，MTT檢測缺氧組(在1%低氧狀態(tài)下處理6 h)、缺氧+紅景天苷組(紅景天苷10 mg/ml，預(yù)先處理2 d后再缺氧處理6 h)細(xì)胞活性檢測均低于對(duì)照組(P<0.01)。缺氧組細(xì)胞死亡率達(dá)到80%，缺氧+紅景天苷組神經(jīng)元細(xì)胞的死亡率降低到65%(P<0.01)。

與對(duì)照組比較，*P<0.01

4 PI3K抑制可消除紅景天苷對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用 見圖4。LY294002+紅景天苷組，紅景天苷(10 mg/ml)處理較LY294002組不能夠升高神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)HK、GLUT-1表達(dá),同時(shí)細(xì)胞內(nèi)ATP水平也無明顯升高(P>0.05)，結(jié)果見圖4A～C。在LY294002+缺氧組，缺氧所致神經(jīng)元細(xì)胞的死亡率達(dá)到88%，LY294002+紅景天苷+缺氧組在紅景天苷(10 mg/ml)預(yù)處理2 d死亡率也高達(dá)85%，與LY294002+缺氧組無顯著區(qū)別(P>0.05)，紅景天苷不再顯著降低缺氧所致神經(jīng)元細(xì)胞的死亡率，結(jié)果見圖4D。

圖4 PI3K抑制對(duì)紅景天苷神經(jīng)元保護(hù)作用的影響

討 論

本研究首先明確了紅景天苷具有明確的神經(jīng)保護(hù)作用。以往多項(xiàng)研究從在體水平明確了紅景天苷具有減少大腦缺血再灌注損傷的作用,在離體細(xì)胞水平也有一些研究表明紅景天苷可減少缺氧等刺激對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷。本研究在小鼠原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)現(xiàn)紅景天苷可減少急性缺氧導(dǎo)致的神經(jīng)元細(xì)胞死亡,這進(jìn)一步證實(shí)了紅景天苷的保護(hù)作用,表明紅景天苷是一個(gè)神經(jīng)保護(hù)劑,具有良好的應(yīng)用前景。

雖然紅景天苷的作用十分明確,但是保護(hù)作用的機(jī)制還有待深入研究?，F(xiàn)已明確能量代謝異常是細(xì)胞死亡的一個(gè)主要原因。葡萄糖作為神經(jīng)元細(xì)胞的主要能源物質(zhì)，經(jīng)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(GLUT)進(jìn)入細(xì)胞后被HK活化為6-磷酸葡萄糖，進(jìn)而進(jìn)入糖代謝的一系列過程中，最終在線粒體氧化磷酸化生成ATP。糖代謝異常和隨之ATP生成減少成為許多種細(xì)胞經(jīng)受不同損傷后發(fā)生死亡的一個(gè)共同表現(xiàn)[8]。本研究觀察了紅景天苷對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞代謝的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)紅景天苷上調(diào)GLUT-1、HK等表達(dá)，并提高HK活性和細(xì)胞內(nèi)ATP水平。胞內(nèi)ATP水平升高可對(duì)抗缺氧所致的代謝下降，起到一定的細(xì)胞保護(hù)作用，本研究認(rèn)為這是紅景天苷具有神經(jīng)保護(hù)作用的一個(gè)重要原因。

本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，介導(dǎo)紅景天苷代謝調(diào)節(jié)作用的一個(gè)關(guān)鍵信號(hào)分子是PI3K。PI3K是磷脂酰肌醇家族中一個(gè)重要成員，可催化產(chǎn)生磷酸化的磷脂酰肌醇，進(jìn)而激活下游分子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖分化、黏附遷移、代謝活性等[9]。目前已知，PI3K與細(xì)胞的物質(zhì)代謝尤其是糖代謝關(guān)系密切[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，原代培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞經(jīng)紅景天苷處理可高表達(dá)PI3K。PI3K高表達(dá)伴隨著糖代謝關(guān)鍵蛋白HK和GLUT-1高表達(dá)。PI3K表達(dá)被抑制后，紅景天苷增加HK和GLUT-1高表達(dá)的作用也被削弱，其對(duì)神經(jīng)元保護(hù)作用也相應(yīng)減弱。由此可見，PI3K是神經(jīng)元糖代謝中一個(gè)關(guān)鍵分子，并通過促進(jìn)糖代謝增加細(xì)胞內(nèi)ATP水平而產(chǎn)生抗損傷作用。

總之，本研究在細(xì)胞水平進(jìn)一步證實(shí)紅景天苷具有神經(jīng)保護(hù)作用，并且表明，PI3K介導(dǎo)的糖代謝增強(qiáng)是紅景天苷保護(hù)作用的一個(gè)重要原因。

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(收稿：2016-11-22)

紅景天苷 腦損傷 缺氧，腦 神經(jīng)保護(hù)

R651.15

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.06.008