RNA干擾抑制KLF10基因?qū)G-63細(xì)胞成骨分化的影響

付峰勃,殷 霄

西安市中心醫(yī)院口腔科(西安 710003)

△通訊作者

RNA干擾抑制KLF10基因?qū)G-63細(xì)胞成骨分化的影響

付峰勃,殷 霄△

西安市中心醫(yī)院口腔科(西安 710003)

目的：研究Kruppel樣因子10(KLF10)在MG-63細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中的作用。方法：采用RNA干擾的方法抑制MG-63細(xì)胞中KLF10的表達(dá)，并使用成骨分化培養(yǎng)液誘導(dǎo)細(xì)胞分化，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)成骨分化標(biāo)志性基因ALP、OC、BSP 及轉(zhuǎn)錄因子Runx2的mRNA的表達(dá)量變化，蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)Runx2的蛋白表達(dá)。結(jié)果：誘導(dǎo)分化后，KLF10表達(dá)抑制細(xì)胞的ALP、OC的mRNA表達(dá)量低于正常細(xì)胞(P<0.05)；KLF10表達(dá)抑制會(huì)直接導(dǎo)致Runx2的mRNA及蛋白表達(dá)量降低。結(jié)論：KLF10在MG-63細(xì)胞成骨分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

骨組織的重建與損傷修復(fù)是正畸和種植治療的基礎(chǔ)。在此過(guò)程中，機(jī)體依靠成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的分化調(diào)節(jié)著骨組織的動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)間充質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞后，開(kāi)始持續(xù)分泌細(xì)胞外基質(zhì)并礦化形成新的骨組織，以達(dá)到骨修復(fù)與改建的效果。成骨細(xì)胞的分化受到多種轉(zhuǎn)錄因子及信號(hào)通路調(diào)節(jié)，其中TGF-β信號(hào)通路是研究最多也是最明確的調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化的信號(hào)之一[1]，其眾多下游信號(hào)分子也被證實(shí)參與了成骨細(xì)胞分化調(diào)節(jié)。Kruppel樣因子10(Kruppel-like factor 10，KLF10)是Kruppel樣家族轉(zhuǎn)錄因中的一員。它編碼的480-氨基酸蛋白在NH2末端區(qū)域有若干Src同源結(jié)構(gòu)域，并在COOH末端區(qū)域有3個(gè)C2H2類(lèi)鋅指結(jié)構(gòu)DNA結(jié)合序列。KLF10最早是Subramaniam等在人成骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，此研究發(fā)現(xiàn)TGF-β處理人成骨細(xì)胞后可以通過(guò)PCR檢測(cè)到KLF10的表達(dá)[2]。之后的研究表明KLF10在很多細(xì)胞核中都有表達(dá)，TGF-β直接調(diào)控其表達(dá)。通過(guò)對(duì)KLF10基因敲除的小鼠研究發(fā)現(xiàn)，小鼠呈現(xiàn)性別特異性的骨質(zhì)疏松：母鼠出現(xiàn)骨密度及礦化成分減少，骨強(qiáng)度喪失。進(jìn)一步細(xì)胞層面的研究發(fā)現(xiàn)，KLF10敲除導(dǎo)致母鼠成骨細(xì)胞數(shù)量減少、顯微結(jié)構(gòu)改變。體外細(xì)胞研究也顯示KLF10能夠調(diào)節(jié)與成骨分化密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Runx2的表達(dá)與活性[3]。因此，以上眾多的研究都表明，KLF10與成骨細(xì)胞的分化有密切關(guān)系。然而關(guān)于KLF10在成骨細(xì)胞分化中作用的體外研究并不透徹，KLF10是否參與了MG-63細(xì)胞的成骨向分化，目前仍沒(méi)有確切的研究結(jié)論。本實(shí)驗(yàn)采用RNA干擾的方式，抑制MG-63細(xì)胞中KLF10的表達(dá)，觀察KLF10缺失條件下MG-63在受到成骨分化誘導(dǎo)時(shí)特性的改變，以探討KLF10對(duì)MG-63細(xì)胞分化命運(yùn)的調(diào)控，為骨組織損傷修復(fù)與重建提供新的研究思路。

材料與方法

1 材 料 MG-63細(xì)胞系(購(gòu)于ATCC，美國(guó))；α-MEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco BRL，美國(guó))；L-抗壞血酸、β-磷酸甘油、細(xì)胞培養(yǎng)用地塞米松(Sigma-Aldrich，美國(guó))；Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、Trizol(Invitrogen，美國(guó))；RevertAid First Strand cDNA SynthesisKit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo，美國(guó))；SYBR Premix EX Taq(Takara，日本)；全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(凱基生物科技發(fā)展有限公司，南京)；Anti-KLF10 抗體、Anti-β-actin抗體(Abcam，英國(guó))；Anti-Runx2抗體(Santa Cruz，美國(guó))；PVDF膜(Roche，瑞士)；二氧化碳恒溫孵箱(Thermo，美國(guó))；熒光定量PCR儀、酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Bio-Rad，美國(guó))；Image Quant 350 快速化學(xué)光成像系統(tǒng)(GE，美國(guó))。

2 實(shí)驗(yàn)方法 ①轉(zhuǎn)染抑制KLF10的shRNA表達(dá)載體：MG-63細(xì)胞系培養(yǎng)采用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)于飽和濕度37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中。根據(jù)文獻(xiàn)[4]中已驗(yàn)證的針對(duì)KLF10基因的siRNA干擾序列(5’-GAA CCC TCT CAA GTG TCA AAT-3’)，經(jīng)過(guò)BLAST驗(yàn)證確定干擾靶點(diǎn)唯一后交由上海吉瑪技術(shù)有限公司利用pGPH1/GFP/Neo載體構(gòu)建相應(yīng)的shRNA表達(dá)質(zhì)粒。取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MG-63細(xì)胞均勻接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合后使用Lipofectamine 2000將shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，命名為si-KLF10常規(guī)培養(yǎng)24 h后提取細(xì)胞RNA及蛋白進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。②KLF10 mRNA的檢測(cè)：取轉(zhuǎn)染shRNA及正常的MG-63細(xì)胞，棄培養(yǎng)液后PBS清洗，加入Trizol提取細(xì)胞總RNA，定量后取1 μg RNA，使用RevertAid First Strand cDNA SynthesisKit試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，保存于-80℃冰箱備用。設(shè)計(jì)KLF10及GAPDH引物，序列如下。KLF10：正向5’- ACT GCC AAA CCT CAC ATT GC -3’, 反向 5’-ACG AAT CAC ACT TGT TGC CTG-3’。GAPDH：正向5’-GAC CCC TTC ATT GAC CTC A-3’ 反向5’-GCT CCT GGA AGA TGG TGA-3’。 PCR反應(yīng)體系如下：SYBR Premix EX Taq 12.5 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，cDNA模板2 μl，ddH2O 8.5 μl。實(shí)時(shí)定量反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延展10 s，讀取熒光，45個(gè)循環(huán)；65～95 ℃每次遞增0.5℃加熱5 s并讀取熒光繪制溶解曲線以驗(yàn)證擴(kuò)增的特異性，后冷卻至4 ℃。將GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算KLF10 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)分析各組細(xì)胞間差異。③蛋白質(zhì)印跡(Western blot)檢測(cè)KLF10的蛋白表達(dá)：取轉(zhuǎn)染shRNA及正常的MG-63細(xì)胞，棄培養(yǎng)液并用預(yù)冷PBS清洗后，胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明步驟提取細(xì)胞蛋白。BCA法測(cè)定各組蛋白濃度后按比例加入5×Loading Buffer，開(kāi)水煮沸5 min。取等量蛋白樣本進(jìn)行SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)，根據(jù)KLF10蛋白及β-actin蛋白分子量大小截取凝膠并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h。分別用Anti-KLF10 抗體，Anti-β-actin抗體室溫孵育1 h，4 ℃過(guò)夜，TBST洗膜，加入二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜后加化學(xué)發(fā)光試劑浸潤(rùn)，ImageQuant 350成像。④成骨分化誘導(dǎo)：實(shí)驗(yàn)分為兩組，對(duì)照組為正常MG-36細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組為轉(zhuǎn)染shRNA表達(dá)載體的KLF10表達(dá)抑制的MG-63細(xì)胞。成骨分化誘導(dǎo)前取生長(zhǎng)良好的MG-63細(xì)胞接種至6孔培養(yǎng)板，實(shí)驗(yàn)組按上述方案轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h，對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)。之后兩組均更換為含有50 ng/ml L-抗壞血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油鈉及1×10-8mmol/L地塞米松并添加10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化。培養(yǎng)72 h后收集細(xì)胞提取RNA，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)成骨標(biāo)志性基因堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣蛋白(OC)、骨唾液酸蛋白(BSP)以及成骨調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Runx2的mRNA表達(dá)量，引物序列如下。ALP：5’- ACT GGT ACT CAG ACA ACG AGA T -3’, 反向 5’- ACG TCA ATG TCC CTG ATG TTA TG -3’。OC：5’- CAC TCC TCG CCC TAT TGG C -3’, 反向 5’- CCC TCC TGC TTG GAC ACA AAG-3’。BSP：5’- CAC TGG AGC CAA TGC AGA AGA -3’, 反向 5’- TGG TGG GGT TGT AGG TTC AAA -3’。Runx2：正向5’- TGG TTA CTG TCA TGG CGG GTA -3’, 反向 5’- TCT CAG ATC GTT GAA CCT TGC TA-3’。同時(shí)提取細(xì)胞蛋白Western blot檢測(cè)Runx2蛋白表達(dá)。

結(jié) 果

1 KLF10干擾效率的驗(yàn)證 將干擾KLF10的shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入MG-63細(xì)胞系后，由于載體帶有GFP綠色熒光蛋白，可見(jiàn)絕大多數(shù)細(xì)胞均成功轉(zhuǎn)染，呈現(xiàn)綠色熒光(圖1 A)，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)達(dá)到較高的轉(zhuǎn)染效率。之后，我們檢測(cè)了轉(zhuǎn)染后細(xì)胞KLF10 mRNA的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果顯示經(jīng)過(guò)shRNA干擾后細(xì)胞的KLF10 mRNA表達(dá)水平降低到之前的40%左右(圖1 B)。進(jìn)一步Western blot同樣驗(yàn)證了siRNA干擾后的MG-63細(xì)胞KLF10蛋白表達(dá)顯著降低(圖1C)。

A：shRNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率；B：實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)KLF10 mRNA相對(duì)表達(dá)量；C：Western blot檢測(cè)KLF10蛋白

2 KLF10表達(dá)抑制對(duì)MG-63細(xì)胞成骨分化誘導(dǎo)后成骨標(biāo)志性基因mRNA表達(dá)的影響 MG-63細(xì)胞經(jīng)過(guò)siRNA干擾KLF10后ALP mRNA表達(dá)并無(wú)明顯變化(P>0.05)(圖2 A)。經(jīng)過(guò)成骨誘導(dǎo)分化72 h后，正常MG-63細(xì)胞及KLF10抑制的si-KLF10細(xì)胞的ALP mRNA水平都顯著提升(P<0.05)，分別提升了6倍及4倍左右；同時(shí)，無(wú)論是否經(jīng)過(guò)成骨分化誘導(dǎo)，KLF10抑制卻可導(dǎo)致MG-63細(xì)胞中OC mRNA表達(dá)量的持續(xù)降低(圖2B)。然而，無(wú)論是否經(jīng)過(guò)成骨分化誘導(dǎo)，KLF10抑制都對(duì)MG-63細(xì)胞中BSP mRNA表達(dá)量無(wú)顯著影響(圖2 C)。

3 KLF10表達(dá)抑制對(duì)MG-63細(xì)胞中成骨調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子Runx2的影響 成骨分化誘導(dǎo)能夠顯著提升Runx2的表達(dá)。然而siRNA干擾KLF10表達(dá)下降后，無(wú)論是否進(jìn)行成骨分化誘導(dǎo)，MG-63細(xì)胞中的Runx2 mRNA及蛋白的表達(dá)量都要顯著低于正常MG-63細(xì)胞(圖3)。

相同*標(biāo)識(shí)的兩組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；相同#標(biāo)識(shí)的兩組之間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)

圖3 各組細(xì)胞中Runx2 mRNA (A)及蛋白(B)的表達(dá)

討 論

MG-63細(xì)胞系是骨肉瘤細(xì)胞來(lái)源的永生化細(xì)胞系，經(jīng)過(guò)成骨分化誘導(dǎo)液及多種因子如TGF-β、BMP2等誘導(dǎo)后可表現(xiàn)出成骨細(xì)胞的特性并形成礦化結(jié)節(jié)，因此眾多實(shí)驗(yàn)都將選用它進(jìn)行成骨分化調(diào)控的研究[5-7]。TGF-β對(duì)成骨細(xì)胞分化的調(diào)控較為復(fù)雜，不僅通過(guò)其下游的smads分子發(fā)揮作用，還與notch、Wnt等多種信號(hào)通路均有交通與對(duì)話。KLF作為其直接的效應(yīng)分子，也與成骨發(fā)育密切相關(guān)。從KLF10基因敲除小鼠顱蓋中分離的成骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)呈現(xiàn)分化延遲及基質(zhì)分泌、礦化障礙[3]，說(shuō)明KLF10在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中起到不可或缺的作用。另一方面，KLF10還在肝癌、乳腺癌、胰腺癌等眾多惡性腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控機(jī)制中發(fā)揮重要作用[4,8]。那么KLF10在腫瘤細(xì)胞來(lái)源的MG-63細(xì)胞系中是依舊行使其成骨活性，還是促使細(xì)胞向腫瘤增殖方向發(fā)展呢？本實(shí)驗(yàn)在體外采用RNA干擾的方法抑制MG-63細(xì)胞中KLF10的表達(dá)，以觀察其成骨特性的改變。

ALP在組織礦化過(guò)程中發(fā)揮非常重要的作用，常在成骨細(xì)胞分化早期表達(dá)。而OC則是成骨細(xì)胞分化的晚期標(biāo)志物[7]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明KLF10抑制的細(xì)胞經(jīng)過(guò)分化誘導(dǎo)后ALP，OC表達(dá)的增加量低于正常細(xì)胞。這表明KLF10對(duì)ALP、OC的表達(dá)都有著調(diào)控作用。而在分化誘導(dǎo)之前KLF10被抑制并沒(méi)有直接導(dǎo)致MG-63細(xì)胞中ALP mRNA表達(dá)量的減少，這可能是由于未分化的MG-63細(xì)胞中ALP的表達(dá)量很低造成的。BSP是也一種和成骨密切相關(guān)的的胞外糖蛋白，本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)雖然成骨分化誘導(dǎo)能夠顯著提高BSP的表達(dá)，但KLF10表達(dá)抑制對(duì)BSP的表達(dá)無(wú)顯著影響。有研究表明BSP不僅在礦化相關(guān)細(xì)胞中表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞中也有明確表達(dá)并發(fā)揮重要作用[9]，因此，在MG-63細(xì)胞系中，BSP可能到其他信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。

Runx2是成骨細(xì)胞分化調(diào)控的一個(gè)關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)，它也被證實(shí)是受TGF-β調(diào)控的下游分子。本實(shí)驗(yàn)表明在MG-63細(xì)胞系中，KLF10對(duì)Runx2有直接的調(diào)控作用，這與Hawse等[3]在KLF10基因敲除的狗顱蓋骨成骨細(xì)胞的研究結(jié)果相一致。由于Runx2作為轉(zhuǎn)錄因子直接調(diào)控眾多成骨相關(guān)因子的表達(dá)[10]，因此KLF10在MG-63細(xì)胞系中的調(diào)控作用可能是通過(guò)Runx2實(shí)現(xiàn)的，但其中的確切機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

[1] Chen G, Deng C, Li YP. TGF-β and BMP signaling in osteoblast differentiation and bone formation[J]. Int J Biol Sci,2012,8(2)：272-288.

[2] Subramaniam M,Hawse JR,Rajamannan NM,etal.Functional role of KLF10 in multiple disease processes[J]. Biofactors,2010 ,36(1)：8-18.

[3] Hawse JR,Cicek M,Grygo SB,etal.TIEG1/KLF10 modulates Runx2 expression and activity in osteoblasts[J]. PLoS One,2011,6(4):e19429.

[4] Hwang YC,Yang CH,Lin CH,etal.Destabilization of KLF10, a tumor suppressor, relies on thr93 phosphorylation and isomerase association[J]. Biochim Biophys Acta,2013,1833(12)：3035-3045.

[5] Liu B,Wu S,Han L,etal. β-catenin signaling induces the osteoblastogenic differentiation of human pre-osteoblastic and bone marrow stromal cells mainly through the upregulation of osterix expression[J]. Int J Mol Med,2015,36(6)：1572-1582.

[6] Sefat F,Khaghani SA,Nejatian T,etal.Transforming growth factor beta (TGF-β) isomers influence cell detachment of MG-63 bone cells[J]. Tissue Cell,2015,47(6)：567-574.

[7] Ongaro A,Pellati A,Bagheri L,etal.Characterization of Notch Signaling During Osteogenic Differentiation in Human Osteosarcoma Cell Line MG63[J]. Cell Physiol,2016 ,231(12):2652-2663.

[8] Yao K,Xing HC,Wu B,etal.Effect of TIEG1 on apoptosis and expression of Bcl-2/Bax and Pten in leukemic cell lines[J]. Genet Mol Res,2015,14(1)：1968-1974.

[9] Wang J,Wang L,Xia B,etal.BSP gene silencing inhibits migration, invasion, and bone metastasis of MDA-MB-231BO human breast cancer cells[J].PLoS One,2013,8(5)：e62936.

[10] Komori T. Regulation of osteoblast differentiation by Runx2[J]. Adv Exp Med Biol, 2010,658:43-49.

(收稿：2016-12-21)

RNA干擾 成骨細(xì)胞 細(xì)胞分化 類(lèi)Kruppel轉(zhuǎn)錄因子 @MG-63細(xì)胞系

R783.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.06.006