長鏈非編碼RNA HOTAIR對非小細胞肺癌遷移與侵襲能力的影響

彭 卓,李 維,牛澤群,王維霞,鄔 媛,潘龍飛△

1.西安交通大學第二附屬醫(yī)院急診科(西安 710004),2.西安交通大學第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科(西安 710004)

長鏈非編碼RNA HOTAIR對非小細胞肺癌遷移與侵襲能力的影響

彭 卓1,李 維2,牛澤群1,王維霞1,鄔 媛1,潘龍飛1△

1.西安交通大學第二附屬醫(yī)院急診科(西安 710004),2.西安交通大學第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科(西安 710004)

目的：探討非小細胞肺癌組織中長鏈非編碼RNA HOTAIR的表達情況及其對細胞侵襲與遷移水平的作用。方法：利用定量的反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)檢測50例非小細胞肺癌組織中LncRNA HOTAIR的表達，然后通過過表達技術(shù)與RNA干擾技術(shù)研究LncRNA HOTAIR的主要功能。再對其pcDNA-HOTAIR與si-HOTAIR進行轉(zhuǎn)染調(diào)控LncRNA HOTAIR的表達，設置空白載體與陰性對照組,應用反轉(zhuǎn)錄PCR進行轉(zhuǎn)染效率的定量檢測。然后分別實施MTT與Transwell兩種方法來判斷LncRNA HOTAIR的異常表達對非小細胞肺癌細胞活性的干預作用。結(jié)果：在非小細胞肺癌組織中LncRNA HOTAIR的相對表達水平是(24.50±7.43)。LncRNA HOTAIR在SPC-A1和SK-MES-1兩種細胞中的相對表達水平比在正常的支氣管上皮細胞中更高，在A549細胞中的相對表達水平比在正常的支氣管上皮細胞中更低。而經(jīng)2 d的轉(zhuǎn)染 siRNA后，LncRNA HOTAIR 在A549與SPC-A1兩種細胞中的表達水平降低；pcDNA3. 1-HOTAIR后，LncRNA HOTAIR在A549細胞中的表達水平升高。利用RNA干擾技術(shù)阻礙HOTAIR的表達水平，不能抑制非小細胞肺癌細胞的增殖。而利用si-HOTAIR的轉(zhuǎn)染降低LncRNA HOTAIR的表達水平能夠阻礙癌細胞的遷移與侵襲作用(P<0.05)；而LncRNA HOTAIR的過度表達能夠明顯推動癌細胞的遷移與侵襲作用(P<0.05)。結(jié)論：HOTAIR在非小細胞肺癌中的高水平異常表達，能夠提高非小細胞肺癌細胞遷移與侵襲水平，可能和患者的不良預后有聯(lián)系。

肺癌是全球發(fā)病率、病死率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌(NSCLC)約占80%[1]，其早期缺乏典型臨床癥狀，大多數(shù)患者就診時已為晚期，預后不良。目前普遍認為NSCLC治療失敗的主要原因是腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移機制復雜不明確。因此早期判斷轉(zhuǎn)移對NSCLC 的治療及預后甚為關(guān)鍵。長鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類長度大于200nt的非編碼RNA,不能編碼蛋白質(zhì),但研究表明其能夠在染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后等水平調(diào)控下游基因的表達,進而參與細胞增殖、凋亡及侵襲等多種生物學過程,并在腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要的角色[2-4]。因此,研究LncRNA和NSCLC發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系,從這一新的角度闡明LncRNA參與NSCLC侵襲轉(zhuǎn)移的分子調(diào)控機制具有重要臨床意義。本文擬通過實驗研究HOX基因的反義基因間RNA(HOTAIR)在NSCLC組織中的表達及對NSCLC細胞增殖、遷移與侵襲水平的影響。

材料與方法

1 材 料 選取2013年1月至2015年12月我院50例非小細胞肺癌患者的癌組織與臨近癌旁組織標本。全部病人手術(shù)前均未接受過化療或分子靶向治療。參與本實驗患者均簽署知情同意書。標本在采集后立即置于液氮中凍存。研究中使用的細胞系有非小細胞肺癌腺癌A549、SPC-A1，鱗癌細胞系SK-MES-1與人類正常支氣管上皮細胞系 16HBE四種[5]。使用的試劑有RPMI 1640 和DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(10%)、Trizol、pcDNA3.1與陰性對照siRNA、Lipofectamine 2000均來自美國的Invitrogen公司,Matrigel 與結(jié)晶紫(0.1%)均來自Sigma-Aldrich，SYBR Premix Ex Taq以及 PrimeScript均來自日本 Takara公司,MTT 和Mi-diprep 試劑盒均來自德國Qiagen公司,倒置顯微鏡來自日本Olympus。

2 實驗方法 采集的細胞在37 ℃與5%的CO2的條件下培養(yǎng),培養(yǎng)基中需添加10%的胎牛血清、青霉素與鏈霉素[6]，然后構(gòu)建表達載體,將pcDNA3.1-HOTAIR 轉(zhuǎn)染到A549中,把si-HOTAIR轉(zhuǎn)染到A549與SPC-A1中,然后對細胞進行培養(yǎng)。設置空白載體與陰性對照組(si-NC)，在2 d后采用Trizol試劑提取PCR,再應用定量的反轉(zhuǎn)錄PCR以PrimeScript與 SYBR Premix Ex Taq試劑進行轉(zhuǎn)染效率的定量檢測[7]。然后分別實施MTT與Transwell兩種方法來判斷LncRNA HOTAIR的異常表達對非小細胞肺癌細胞活性的干預作用,其中,MTT 法是通過酶標儀來判斷細胞增殖的情況，而Transwell實驗是通過倒置顯微鏡來觀察細胞的遷移與侵襲情況。

結(jié) 果

1 非小細胞肺癌組織中LncRNA HOTAIR 表達水平 見表1。在非小細胞肺癌組織中LncRNA HOTAIR的相對表達水平(24.50±7.43)。LncRNA HOTAIR 在SPC-A1和SK-MES-1兩種細胞中的相對表達水平比在正常的支氣管上皮細胞中更高(P<0.05)；在A549細胞中的相對表達水平比在正常的支氣管上皮細胞中更低(P<0.05)。

表1 HOTAIR 在不同細胞系中的表達情況

注：與16HBE組比較,△P<0.05

2 非小細胞肺癌細胞中外源性LncRNA HOTAIR 表達水平 見表2和圖1。經(jīng)2 d的轉(zhuǎn)染siRNA后，LncRNA HOTAIR在A549與SPC-A1兩種細胞中的表達水平比在轉(zhuǎn)染之前更低(P<0.05)。經(jīng)2 d的轉(zhuǎn)染pcDNA3. 1-HOTAIR后，RNA HOTAIR在A549細胞中的表達水平比轉(zhuǎn)染之前更高(P<0.05)。

表2 轉(zhuǎn)染后HOTAIR 的表達情況

注：si-NC為陰性對照組

圖1 轉(zhuǎn)染后pc HOTAIR 的表達情況

3 HOTAIR表達水平對細胞增殖的作用 見圖2。利用RNA干擾技術(shù)阻礙HOTAIR的表達水平，不能抑制NSCLC細胞的增殖。轉(zhuǎn)染 pcDNA-HOTAIR促使HOTAIR的表達能夠抑制NSCLC細胞的增殖。在SPC-A1細胞中,各時間段si-HOTAIR的吸光值與si-NC差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，在24、48、72、96 h si-HOTAIR的吸光值分別是1.3、2.3、3.8和5.0，si-NC的吸光值分別是1.2、2.4、3.9和4.9。在 A549細胞中，各時間段si-HOTAIR的吸光值明顯低于si-NC(P<0.05)。在24、48、72、96 h,si-HOTAIR的吸光值分別是1.0、2.7、3.8和5.8，si-NC的吸光值分別是1.5、3.1、4.2和6.3。

圖2 轉(zhuǎn)染si-HOTAIR后非小細胞肺癌組織中HOTAIR的表達情況

4 HOTAIR表達水平對細胞遷移與侵襲的作用 見圖3。利用 si-HOTAIR的轉(zhuǎn)染降低LncRNA HOTAIR的表達水平能夠阻礙癌細胞的遷移與侵襲作用(P<0.01)，在遷移實驗中，轉(zhuǎn)染si-HOTAIR的細胞表達數(shù)為202，而在陰性對照組si-NC的細胞表達數(shù)為484；在侵襲實驗中，轉(zhuǎn)染si-HOTAIR的細胞表達數(shù)為121，而在陰性對照組si-NC的細胞表達數(shù)為388。而LncRNA HOTAIR的過度表達能夠明顯推動癌細胞的遷移與侵襲作用(P<0.01)，在遷移實驗中，轉(zhuǎn)染pcDNA-HOTAIR的細胞表達數(shù)為503，空白載體組pcDNA- NC的細胞表達數(shù)為282；在侵襲實驗中，轉(zhuǎn)染pcDNA-HOTAIR的細胞表達數(shù)為193，空白載體組pcDNA- NC的細胞表達數(shù)為492。

圖3 轉(zhuǎn)染后非小細胞肺癌組織中細胞遷移與侵襲情況

討 論

NSCLC是一種死亡率非常高的惡性腫瘤，5年生存率僅為17%[8]。該病的發(fā)生涉及到癌基因與原癌基因的突變、DNA甲基化的變化與非編碼RNA表達的異常等[9]。NSCLC患者在發(fā)病早期診斷率較低，原因是NSCLC細胞非常容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，而明確NSCLC細胞轉(zhuǎn)移的發(fā)生機制對于在該病早期提高診斷率、改善預后具有非常重要的意義。以往的研究表明，長鏈非編碼RNA能夠在腫瘤的形成和發(fā)展過程中發(fā)揮重要的調(diào)控功能，Nie等[10]研究表明，HOTAIR在胰腺癌中呈現(xiàn)出高表達的狀態(tài)，其能夠經(jīng)組蛋白的甲基化以阻礙多類抑癌基因的相對表達水平以便于參與腫瘤的病情發(fā)展進程，其可成為反應腫瘤預后的相關(guān)因子。Alves 等[11]研究表明，在結(jié)腸癌和乳腺癌的病人中，HOTAIR能夠經(jīng)由調(diào)節(jié)各類信號的作用機制，參加上皮間質(zhì)的轉(zhuǎn)化作用，從而保證腫瘤干細胞的特質(zhì)?？梢奌OTAIR在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到一定的作用，這為研究HOTAIR在NSCLC發(fā)展變化中的作用機制奠定了基礎。本文通過實驗檢測 HOTAIR在NSCLC中的表達情況，并分析HOTAIR的異常表達對NSCLC增殖、遷移與侵襲的作用。HOTAIR在NSCLC組織中表達水平高，在SPC-A1與 SK-MES-1細胞中相對表達水平較高，而在A549細胞中相對表達水平較低。經(jīng)靶向敲除HOTAIR的方法阻礙HOTAIR的表達對NSCLC細胞的增殖沒有影響，而降低HOTAIR 的表達水平能夠阻礙細胞的遷移與侵襲，HOTAIR的過度表達能夠明顯推動癌細胞的遷移與侵襲作用，而侵襲與遷移作用的強弱能夠直接影響腫瘤的發(fā)展進程。

綜上所述，LncRNA HOTAIR在NSCLC中高水平的異常表達，能夠提高NSCLC細胞的遷移與侵襲水平，這表明其可能和患者的不良預后相關(guān)，為今后在分子水平進一步研究抑制NSCLC的治療手段提供了依據(jù)。

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(收稿：2016-11-15)

Influence of down-regulated long noncoding RNA HOTAIR on migration and invasion of non-small cell lung cancer cell lines

Peng Zhuo,Li Wei,Niu Zequn,et al.

Emergency Department, Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University (Xi’an 710004)

Objective：To research the expression profile of long noncoding RNA HOTAIR in non-small cell lung cancer tissues,and to study its functions in NSCLC cell migration and invasion.Methods: Quantitative reverse-transcription PCR was performed to detect the relative expression of HOTAIR in 50 NSCLC tissues.To further explore its function,techniques of overexpression and RNA interference were applied．pcDNA-HOTAIR and si-HOTAIR was transfected to regulate HOTAIR expression in NSCLC cells，and the transfection efficiency was evaluated by qRT-PCR．MTT assay and Transwell assay were performed to evaluate the effect of ectopic HOTAIR expression on proliferation，migration and invasion potential of NSCLC cells.Results：The relative expression of HOTAIR in 50 cases of NSCLC tissues was(24.50±7.43)．Compared with normal bronchial epithelium cell 16HBE，there was a relatively high expression of HOTAIR in SPC-A1 and SK-MES-1 cells，and a relatively low expression in A549 cell.The HOTAIR expression was downregulated in A549 and SPC-A1 cells at two days after transfection of HOTAIR siRNA，and up-regulated in A549 cells at two days after transfection of pcDNA3. 1-HOTAIR.RNAi-mediated suppression of HOTAIR had little effect on cell proliferation,while inhibition of HOTAIR by si-HOTAIR could repress cell migration and invasion(P<0. 05); overexpression of HOTAIR could significantly promote cell migration and invasion(P<0.05).Conclusion:The high expression of HOTAIR in NSCLC can promote cell migration and invasion.It may correlates with poor prognosis in NSCLC．

Cancer,non-small cell lung RNA,long noncoding Cell migration inhibition Neoplasm metastasis

*陜西省科技攻關(guān)項目(2016YFJH2-05)

癌非小細胞,肺 RNA,長鏈非編碼 細胞遷移抑制 腫瘤轉(zhuǎn)移

R734.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.06.004

△通訊作者