miR-182在膽囊癌中的表達(dá)及其對(duì)膽囊癌細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響

張智勇,鄭 偉,?；⒘?杜立學(xué),劉 陽

1.陜西省人民醫(yī)院肝膽外科(西安710068),2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院普外科(西安710004)

miR-182在膽囊癌中的表達(dá)及其對(duì)膽囊癌細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響

張智勇1,鄭 偉1,?；⒘?,杜立學(xué)1,劉 陽2△

1.陜西省人民醫(yī)院肝膽外科(西安710068),2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院普外科(西安710004)

目的：檢測(cè)miR-182在膽囊癌中的表達(dá)，探討其影響膽囊癌細(xì)胞增殖、侵襲的可能機(jī)制。方法：實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)miR-182、p38在10例膽囊癌組織、癌旁組織中的表達(dá)情況；應(yīng)用miR-182 mimics轉(zhuǎn)染膽囊癌細(xì)胞GBC-SD，應(yīng)用p38 MAPK信號(hào)通路特異性阻滯劑SB203580處理轉(zhuǎn)染miR-182 mimics的GBC-SD細(xì)胞，通過MTT實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期檢測(cè)、Transwell小室檢測(cè)miR-182對(duì)GBC-SD細(xì)胞增殖、侵襲能力的影響。結(jié)果：膽囊癌組織中miR-182、p38的表達(dá)高于癌旁組織；miR-182 mimics轉(zhuǎn)染GBC-SD細(xì)胞后，p38的表達(dá)水平隨之升高(P<0.05)，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，細(xì)胞遷移數(shù)增多(75±8)，S期細(xì)胞比例增多[(68.81±7.57)%]；應(yīng)用SB203580處理轉(zhuǎn)染miR-182的GBC-SD細(xì)胞，細(xì)胞增殖能力降低，細(xì)胞遷移數(shù)減少(23±5)，S期細(xì)胞比例減少[(34.49±7.05)%]。結(jié)論：miR-182 在膽囊癌組織中高表達(dá)，通過上調(diào)p38 MAPK信號(hào)通路增強(qiáng)膽囊癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力，參與了膽囊癌的發(fā)生發(fā)展過程。

膽囊癌是膽道系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，發(fā)病隱匿，是侵襲性和致死性較高的惡性腫瘤之一，由于腫瘤早期極易侵犯肝臟或通過淋巴結(jié)發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此手術(shù)切除率較低，文獻(xiàn)報(bào)道外科手術(shù)切除后5年存活率約為5%[1]，因此，研究膽囊癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制對(duì)改善患者預(yù)后有著重要的意義。microRNA(miRNA)是一類約18～25個(gè)堿基組成的非編碼單鏈RNA，轉(zhuǎn)錄后參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2]。miR-182定位于人7號(hào)染色體(7q32.2)，大量研究報(bào)道m(xù)iR-182與胃癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[3]。本研究旨在探討miR-182在膽囊癌組織與癌旁組織中的表達(dá)差異，并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討miR-182影響膽囊癌細(xì)胞GBC-SD增殖、侵襲的可能機(jī)制。

材料與方法

1 材 料 選取2013年1月至2014年6月陜西省人民醫(yī)院肝膽外科收治的10例膽囊癌患者，癌組織標(biāo)本均為手術(shù)切除并經(jīng)過病理證實(shí)，切除距癌灶邊緣2～5 cm的組織作為癌旁組織；膽囊癌細(xì)胞GBC-SD，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。主要試劑：p38 MAPK信號(hào)通路特異性阻滯劑SB203580，購自美國Selleck公司；miR-182、p38、β-actin引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；miR-182 mimics、miRNA陰性對(duì)照，購自廣州銳博生物科技有限公司；胎牛血清、Trizol試劑，購自美國Amresco公司；LipofectamineTM2000、Opti-MEM，購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒，購自北京中山生物工程公司；Transwell小室，購自美國Corning公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法 ①實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)膽囊癌組織、癌旁組織中miR-182、p38 mRNA的表達(dá)：按照Trizol試劑說明書提取膽囊癌組織、癌旁組織的總RNA，取1μl RNA 溶液，用無RNA酶的水10倍稀釋，取2 μl稀釋后的RNA溶液，在波長260 nm和280 nm處測(cè)定光密度(OD)值，估計(jì)RNA 純度，A260/A280 比值在1.8～2.0之間則滿足實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)要求。配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：總RNA 500 ng，特異性逆轉(zhuǎn)錄引物0.5 μl，10 mmol/L的dNTP mix 0.5 μl，5×ExScriptTMBuffer 2 μl，RNase inhibitor 0.25 μl,ExScriptTMRtase 0.25 μl，加無RNA酶水至10 μl，反應(yīng)體系的配制在冰上進(jìn)行。將反應(yīng)體系混勻后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),反應(yīng)條件：42 ℃,15 min；95 ℃,2 min。將所得的cDNA模板2 μl與上游引物1μl、下游引物1μl、SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μl、ddH2O 8.5 μl混勻，用ABI Prism 7000型熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min后；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸40 s,總計(jì)40個(gè)循環(huán)。根據(jù)公式 Folds=2-△△Ct來計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。②miR-182轉(zhuǎn)染膽囊癌細(xì)胞GBC-SD：選取對(duì)數(shù)生長期的GBC-SD細(xì)胞胰酶消化后接種到6孔板(1×105/孔)，24 h后細(xì)胞融合率達(dá)到30%～50%后棄去培養(yǎng)液，使用LipofectamineTM2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染試劑配制：將1 μl 的LipofectamineTM2000與50 μl輕輕混勻，室溫孵育5 min；將miR-182 mimics(20 pmol)、miRNA陰性對(duì)照分別溶于Opti-MEM使其終濃度為20 μmol/L，室溫孵育5 min；將miR-182 mimics、miRNA陰性對(duì)照分別與LipofectamineTM2000混勻，室溫放置20 min，加入到含有GBC-SD細(xì)胞的6孔板中，并置于培養(yǎng)箱孵育24 h，實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后GBC-SD細(xì)胞中miR-182、p38 mRNA的表達(dá)。③MTT實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染miR-182、miRNA陰性對(duì)照的GBC-SD細(xì)胞以1×105/孔的濃度接種于96孔板，分為轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組，另設(shè)空白對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別于轉(zhuǎn)染0、24、48、72、96 h后棄去培養(yǎng)液，加入20 μl的MTT試劑，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h后，每孔加入150 μl的 DMSO溶解，小心振蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀490 nm波長處測(cè)定每孔OD值；另取一組轉(zhuǎn)染miR-182的GBC-SD細(xì)胞，加入SB203580，使其終濃度為75 μmol/L，設(shè)為SB203580組，實(shí)驗(yàn)過程同轉(zhuǎn)染組。計(jì)算各組的細(xì)胞抑制率，細(xì)胞抑制率(%)=(1-實(shí)驗(yàn)組OD值/空白對(duì)照組OD值)×100%。④細(xì)胞周期檢測(cè)：將GBC-SD細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于6孔板中，將miR-182、miRNA陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染GBC-SD細(xì)胞，胰酶消化后，800 r/min離心5 min后棄去上清液，加入10 μl的Annexin Ⅳ-FITC和5 μl的PI，避光室溫反應(yīng)10～15 min，加入300 μl結(jié)合緩沖液后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。另設(shè)空白對(duì)照組、SB203580組(75 μmol/L)，細(xì)胞周期檢測(cè)過程同轉(zhuǎn)染組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。⑤侵襲實(shí)驗(yàn)：GBC-SD細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，胰酶消化，DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml，上室加細(xì)胞懸液100 μl，下室加含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基400 μl，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h，棄培養(yǎng)液，95%乙醇固定20 min，0.1%結(jié)晶紫浸染30 min，顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移至Transwell小室下層的細(xì)胞個(gè)數(shù)，另設(shè)空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、SB203580組(75 μmol/L)，實(shí)驗(yàn)過程同轉(zhuǎn)染組，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

結(jié) 果

1 膽囊癌組織、癌旁組織中miR-182、p38 mRNA的表達(dá)情況 見圖1。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，膽囊癌組織中miR-182mRNA的表達(dá)高于癌旁組織(P<0.05)，p38 mRNA在膽囊癌組織中的表達(dá)亦高于癌旁組織(P<0.05)。

* P<0.05

2 miR-182對(duì)膽囊癌細(xì)胞GBC-SD侵襲能力的影響 miR-182轉(zhuǎn)染膽囊癌細(xì)胞GBC-SD后，miR-182(5.31±0.62)、p38(3.48±0.44)的表達(dá)較陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組表達(dá)升高(P<0.05)(圖2)，表明miR-182已成功轉(zhuǎn)染至GBC-SD細(xì)胞中，miR-182上調(diào)了p38的表達(dá)。轉(zhuǎn)染組GBC-SD細(xì)胞遷移數(shù)(75±8)高于陰性對(duì)照組(25±5)和空白對(duì)照組(30±6)(P<0.05)；SB203580組GBC-SD細(xì)胞的遷移數(shù)(23±5)，與轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移數(shù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

* P<0.05

* P<0.05

3 miR-182對(duì)膽囊癌細(xì)胞GBC-SD增殖的影響 miR-182轉(zhuǎn)染后促進(jìn)GBC-SD細(xì)胞的增殖，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，SB203580抑制miR-182對(duì)GBC-SD細(xì)胞的促增殖作用(圖4)。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果顯示miR-182增加GBC-SD細(xì)胞S期百分比[(68.81±7.57)%]，與陰性對(duì)照組[(14.55%±3.06)%]、空白對(duì)照組[(20.03%±2.81)%]、SB203580組[(34.49%±7.05)%]比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖5)。

轉(zhuǎn)染組與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05；轉(zhuǎn)染組與SB203580組比較, #P<0.05

*P<0.05

討 論

膽囊癌患者就診時(shí)已存在不同程度的毗鄰臟器浸潤或轉(zhuǎn)移，由于腫瘤的高度侵襲性，僅憑手術(shù)難以改善患者的遠(yuǎn)期療效[4]，尋找特異性的診斷和治療靶點(diǎn)是膽囊癌的研究熱點(diǎn)。多數(shù)腫瘤中均可檢測(cè)到miRNA的異常表達(dá)，通過轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，起“癌基因”或“抑癌基因”樣作用調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5]。Lagos-Quintana等[6]首次在小鼠的眼中發(fā)現(xiàn)了miR-182，隨后有大量的研究發(fā)現(xiàn)miR-182在胰腺癌、膽管癌、結(jié)直腸癌、肝癌中發(fā)揮著類似癌基因的作用[3]。袁源[7]發(fā)現(xiàn)miR-182在膽囊癌組織中表達(dá)上調(diào)，但其在膽囊癌發(fā)生發(fā)展中的具體機(jī)制不詳，我們的研究也發(fā)現(xiàn)了miR-182在膽囊癌組織、癌旁組織中的差異表達(dá)，miR-182在膽囊癌組織中的高表達(dá)參與了膽囊癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控過程。

p38 MAPK信號(hào)通路是MAPKs超家族4條平行通路之一，作用于細(xì)胞周期的各個(gè)檢驗(yàn)點(diǎn)，參與調(diào)控細(xì)胞增殖過程[8]。文獻(xiàn)報(bào)道p38 MAPK在多種腫瘤組織中持續(xù)高表達(dá)[9]，我們的研究也發(fā)現(xiàn)了p38在膽囊癌組織中高表達(dá)，通過miR-182轉(zhuǎn)染膽囊癌細(xì)胞GBC-SD后，p38呈高表達(dá)水平，細(xì)胞的增殖、侵襲能力也增強(qiáng)，S期細(xì)胞所占比例增多，使用p38 MAPK信號(hào)通路特異性阻滯劑SB203580后，細(xì)胞的增殖、侵襲能力也隨之降低，表明了miR-182可能通過上調(diào)p38 MAPK信號(hào)通路參與膽囊癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控。

miR-182類似癌基因樣作用多見于乳腺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌，Chen等[10]檢測(cè)109例胰腺癌患者血清中循環(huán)型miR-182的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)腫瘤患者循環(huán)型miR-182的表達(dá)高于胰腺炎、正常對(duì)照患者，診斷的敏感性和特異性均高于CA19-9，Kaplan-Meier生存曲線分析亦提示miR-182與患者預(yù)后明顯相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)僅檢測(cè)了膽囊癌組織中miR-182的表達(dá)，未檢測(cè)循環(huán)型miR-182的表達(dá)，臨床樣本量只有10例，因此未分析患者預(yù)后與miR-182表達(dá)水平的相關(guān)性。劉慧等[11]檢測(cè)了86例直腸癌組織中miR-182的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-182的表達(dá)水平與腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移和分期顯著相關(guān)，結(jié)果提示miR-182與腫瘤轉(zhuǎn)移有關(guān)。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-182后GBC-SD細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)，而這種增殖、侵襲能力的增強(qiáng)與p38 MAPK信號(hào)通路有關(guān)。然而，miR-182的表達(dá)與膽囊癌臨床病理特征、預(yù)后是否相關(guān)有待于進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，也有文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-182通過抑制腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因1的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移[12]?，F(xiàn)有對(duì)miR-182靶基因的研究大多建立在miR-182與靶基因3'UTR互補(bǔ)配對(duì)，最新的關(guān)于miRNA探索領(lǐng)域是ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)假說[13]，而miR-182及其基因簇在ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的確切機(jī)制仍有待進(jìn)一步加以探索。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-182在膽囊癌組織中高表達(dá)，miR-182轉(zhuǎn)染膽囊癌細(xì)胞GBC-SD 后細(xì)胞的增殖、侵襲能力增強(qiáng)，其分子機(jī)制可能是通過上調(diào)p38 MAPK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的，miR-182調(diào)控膽囊癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

[1] 慎浩鑫,宋虎偉,王 林,等.西北五省17家醫(yī)院2379例膽囊癌臨床分析[J].中華外科雜志,2015,53(10):747-751.

[2] Bartel DP. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions [J].Cell, 2009, 136(2): 215-233.

[3] 蔣金艷,謝海龍.MiR-182研究進(jìn)展[J].中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志,2015,33(5):584-588.

[4] 俞文隆,張永杰. 膽囊癌根治性切除術(shù)的關(guān)鍵問題[J].外科理論與實(shí)踐,2013,15(2)：104-107.

[5] Brennecke J,Hipfner DR,Stark A,etal.Bantam encodes a developmentally regulated miRNA that controls cell proliferation and regulates the proapoptotic gene hid in drosophila[J].Cell,2003,113(1)：25-36.

[6] Lagos-Quintana M, Rauhut R, Meyer J,etal. New microRNAs from mouse and human [J].RNA,2003,9(2)：175-179.

[7] 袁 源. miRNA-145在膽囊癌發(fā)病過程中的調(diào)控作用及機(jī)制研究[D].中南大學(xué),2014.

[8] 黃 川.JNK、p38MAPK信號(hào)通路與腫瘤細(xì)胞凋亡[J].實(shí)驗(yàn)與檢驗(yàn)醫(yī)學(xué),2012,30(5):447-452.

[9] 邱建武,郭 薇,申麗娟. p38MAPK在肝細(xì)胞癌中的研究進(jìn)展[J]. 世界華人消化雜志,2008,21(5)：503-509.

[10] Chen QL, Yang LJ, Xiao YL,etal. Circulating microRNA-182 in plasma and its potential diagnostic and prognostic value for pancreatic cancer[J]. Medical Oncology,2014,31(11)：225.

[11] 劉 慧,杜魯濤,楊詠梅,等.MiR-182在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移能力的影響[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版,2013,51(12)：70-74.

[12] Ng EK,Chong WW,Jin H,etal. Differential expression of microRNAs in plasma of patients with colorectal cancer: a potential marker for colorectal cancer screening[J].Gut,2009,58(10):1375-1381.

[13] Salmena L,Poliseno L,Tay Y,etal.A ceRNA hypothesis: the Rosetta Stone of a hidden RNA language[J].Cell,2011,146(3)：353-358.

(收稿：2016-12-01)

The expression of miR-182 in gallbladder carcinoma and its effect on cell proliferation and migration of GBC-SD cells

Zhang Zhiyong,Zheng Wei,Chang Hulin,et al.

Department of Hepatobiliary Surgery, Shaanxi Provincial People’s Hospital (Xi’an 710068)

Objective: To detect the expression of miR-182 in gallbladder carcinoma, and explore its effect on cell proliferation and migration of GBC-SD cells in vitro. Methods: The expressions of miR-182, p38 in 10 pairs of gallbladder carcinoma and pericarcinomatous tissues were detected by Real-time PCR; the cell proliferation and migration of GBC-SD cells, which were transiently transfected with miR-182 mimics, and treated by p38 MAPK signaling pathway blocker SB203580, were tested by MTT, cell cycle analysis and Transwell chamber. Results: The expressions of miR-182, p38 were significantly higher in gallbladder carcinoma tissues compared with pericarcinomatous tissues; the expressions of p38(P<0.05), proliferation ability, cell migration(75±8) and S-phase fraction[(68.81±7.57)%]increased after GBC-SD cells were transfected with miR-182 mimics; proliferation ability, cell migration(23±5)and S-phase fraction [(34.49±7.05)%]decreased after the transfected GBC-SD cells were treated by SB203580. Conclusion: miR-182 is over expressed in gallbladder carcinoma, and up-regulates p38 MAPK signaling pathway to enhance the capacity of cell proliferation and migration in vitro, suggesting miR-182 may play an important role in the tumorigenesis and development of gallbladder carcinoma.

Gallbladder neoplasm/pathology MicroRNAs Cell proliferation Neoplasm metastasis

*陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2015JM8389)

膽囊腫瘤/病理學(xué) 微RNAs 細(xì)胞增殖 腫瘤轉(zhuǎn)移

R735.8

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.06.003

△通訊作者