寧波市耐三代頭孢菌素志賀菌攜帶β-內(nèi)酰胺酶與基因分型

周偉艷，鄭 劍，葉 碩，沈玄藝，徐景野，許小敏

?

寧波市耐三代頭孢菌素志賀菌攜帶β-內(nèi)酰胺酶與基因分型

周偉艷1，鄭 劍1，葉 碩1，沈玄藝1，徐景野1，許小敏2

目的 了解本市耐三代頭孢菌素志賀菌攜帶ESBLs及其基因型，為疾病防控提供依據(jù)。方法 采用直接和增菌培養(yǎng)法，分離患者標本中志賀菌；藥敏采用K-B法，ESBLs志賀菌表型確證采用紙片法；CTX-M、OXA、TEM和SHV耐藥基因采用PCR法；耐藥基因分型采用核苷酸序列法，用BLAST分析比較確定基因型別。結果 藥敏篩檢出69株耐三代頭孢菌素志賀菌，占ESBLs志賀菌的74.19%。檢出CTX-M(CTX-M-1群和CTX-M-9群)、OXA和TEM耐藥基因，檢出率分別為79.71%、79.01%和26.09%，未檢出CTX-M-2群和SHV耐藥基因。DNA序列比對CTX-M-1群以CTX-M-15 型為主，還檢出7個其它型；CTX-M-9群則以CTX-M-14型多，其它型檢出6個；49株OXA和18株TEM耐藥基因測序后均為1型(OXA-1型和TEM-1型)。攜帶2種以上耐藥基因的志賀菌21株，占30.43%。結論 本市志賀菌對頭孢曲松等三代頭孢菌素耐藥率較高，檢出的ESBLs酶型種類多，CTX-M(CTX-M-1群的CTX-M-15 型和CTX-M-9群的CTX-M-14型)是主流酶型，且可同時攜帶多種耐藥基因，給疾病防控帶來困難。OXA-1型的高攜帶率，提示我們應加強分析。B群志賀菌無論是表型的耐藥性，還是耐藥基因檢出率均高于D群志賀菌，該發(fā)現(xiàn)有助志賀菌的擴散與流行研究。

志賀菌；耐三代頭孢菌素；超廣譜β-內(nèi)酰胺酶；基因分型

志賀菌是細菌性痢疾(以下簡稱菌痢)的病原，國內(nèi)外常見的腸道傳染病。由于人群普遍易感,全球每年約有1.65億人發(fā)生該菌感染，危害嚴重[1]。我國和發(fā)展中國家是菌痢的高發(fā)地區(qū)，嚴重危害人們的健康與生命。志賀菌的超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended spectrumβ-lactamases, ESBLs)有眾多的酶基因型，是ESBLs志賀菌在全球擴散與流行的原因[2]。隨著頭孢菌素類抗菌藥物在治療菌痢的增加，耐三代頭孢菌素的ESBLs志賀菌呈上升趨勢。ESBLs主要有TEM、SHV、CTX-M和OXA等4大類耐藥基因，及數(shù)百個酶型，且在不規(guī)則使用該類抗菌藥物和抗菌藥物選擇性壓力下產(chǎn)生的酶基因型在不斷增加[3]，給治療帶來困難。為了解寧波市ESBLs志賀菌耐三代頭孢菌素情況和攜帶耐藥基因種類，我們對分離和收集到的志賀菌進行耐藥性篩選和耐藥基因檢測與測序分析，現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 253株志賀菌由寧波市感染性腹瀉病監(jiān)測網(wǎng)絡實驗室從病人標本中分離或縣級以上醫(yī)院分離后上送，其中男性135例，女性118例，年齡10月齡～92歲，<10歲兒童占61.74%。

1.2 培養(yǎng)基和儀器 GN、SS瓊脂、麥康凱瓊脂、伊紅-美藍瓊脂為北京陸橋技術有限公司產(chǎn)品，顯色培養(yǎng)基為鄭州博賽生物制品研究所產(chǎn)品，志賀菌診斷血清為衛(wèi)生部蘭州生物制品研究所產(chǎn)品；MH瓊脂及抗生素藥敏紙片為英國OXOID公司產(chǎn)品；20E生化鑒定試劑條為法國生物梅里埃公司產(chǎn)品。DNA提取試劑為大連寶生物TaKaRa MiniBEST 細菌基因組提取試劑盒3.0，均在有效期內(nèi)使用。PCR反應試劑均購自大連寶生物公司，PCR擴增儀為德國Eppendorf公司的Mastercycler梯度PCR。

1.3 細菌分離與鑒定 志賀菌檢測采用文獻方法[4-5]進行。1)直接分離培養(yǎng): 標本接種于SS平板和麥康凱平板或顯色培養(yǎng)基，36±1 ℃培養(yǎng)24 h；2)增菌分離培養(yǎng): 標本接種于GN肉湯，36±1 ℃增菌培養(yǎng)8 h,再用上述平板分離。挑取可疑菌落接種于克氏雙糖瓊脂36±1 ℃培養(yǎng)24 h，雙糖管為-/+、H2S-似可疑菌，用營養(yǎng)瓊脂分純，API進行系統(tǒng)生化鑒定。符合志賀菌生化的菌株，再用診斷血清作玻片凝集，確定血清型。253株志賀菌分為福氏志賀菌(B群)170株，占67.19%、宋內(nèi)志賀菌(D群)83株，占32.81%。

1.4 藥敏篩查ESBLs志賀菌與耐藥基因檢測

1.4.1 藥敏篩查 用K-B紙片法檢測21種常用抗菌藥物篩查耐三代頭孢菌素的志賀菌，質控方法和結果判定參照CLSI(2014)抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標準[6]；ESBLs表型確證采用CLSI推薦的紙片法[7]。質控菌株為大場埃希氏菌(ATCC25922)。

1.4.2 耐藥基因檢測 1)引物合成 CTX(CTX-M-1型、CTX-M-2型和CTX-M-9型)、OXA、TEM、SHV的引物序列根據(jù)GenBank，使用軟件Primer 5. 0進行設計，由上海塞百盛生物工程公司合成。所用引物見表1。2) DNA提取 待檢菌接種營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)過夜，采用TaKaRa公司的MiniBEST細菌基因組提取試劑盒(3.0)。按說明書操作提取志賀菌基因組DNA。3)PCR擴增 采用Premix TapTM試劑盒(2.0)按說明書配置PCR反應體系，擴增志賀菌耐藥基因。CTX-M(1、2、9群)、SHV、TEM和OXA等耐藥基因的PCR反應條件：95 ℃預變性5 min，94 ℃摸板變性1 min，55 ℃退火45 s(SHV為60 ℃退火45 s)，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。反應結束后，取PCR產(chǎn)物5 μL點樣于1%瓊脂糖凝膠(內(nèi)含0.5 μg/mL溴化乙錠)電壓10V/cm，電泳30 min，BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察標準分子量條帶與檢測預期條帶的分子量大小。

表1 志賀菌耐藥基因PCR引物及產(chǎn)物長度
Tab.1 PCR primers and the length of products for resistance genes ofShigella

基因名稱Gene序列(5'-3')Sequence(5'-3')產(chǎn)物長度(bp)lengthofproductsOXA[8]F:TTTTCTGTTGTTTGGGTTTT610R:TTTCTTGGCTTTTATGCT-TGTEM[9]TEM[9]F:ATAAAATTCTTGAAGACGAAA851R:GACAGTTACCAATGCTTAATCASHV[10]SHV[10]F:ATGCGTTATATTCGCCTGTG477R:GTTAGCGTTGCCAGTGCTCGCTX-M-1群[11]F:ACGCTGTTGTTAGGAAGTGT862R:TTGAGGCTGGGTGAAGTAAGCTX-M-2群[11]F:ACGCTACCCCTGCTATTTAG868R:CAGAAACCGTGGGTTACCTX-M-9群[11]F:AGTGCAACGGATGATGTTC870R:GGCTGGGTAAAATAGGT-CAC

1.4.3 測序與基因分型 PCR擴增陽性產(chǎn)物送上海英駿公司，用ABI3730全自動基因分析儀對測序引物擴增片段進行正反方向核苷酸序列測定，測序結果進行consed拼接，在GenBank(www.ncb.inlm.nih.gov) 用BLAST分析比較后確定擴增產(chǎn)物基因型別。

2 結 果

2.1 藥敏結果 253株志賀菌經(jīng)9類20種抗菌藥物耐藥性檢測，除2株B群志賀菌對抗菌藥物全部敏感外，有233株志賀菌耐藥在4～13種之間，以耐4～6類為多，按多重耐藥性定義(同時耐抗菌藥物≥3類)為多重耐藥菌。耐三代頭孢菌素前三的是頭孢噻肟、頭孢曲松和頭孢他啶，耐藥率分別為53.57%、25.69%和21.74%，未檢出耐碳青霉烯類抗生素的志賀菌。見表2。

表2 B群志賀菌和D群志賀菌耐藥情況
Tab.2 Resistance of group B and group DShigella

抗生素類別AntibioticsCategory抗菌藥物AntimicrobialsB群志賀菌N=170GroupBShigellaN=170D群志賀菌N=83GroupDShigellaN=83志賀菌N=253ShigellaN=253耐藥菌株數(shù)Numberofresistantstrains耐藥率(%)Rateofresistance(%)耐藥菌株數(shù)Numberofresistantstrains耐藥率(%)Rateofresistance(%)耐藥菌株數(shù)Numberofresistantstrains耐藥率(%)Rateofresistance(%)青霉素類Penicillins氨芐西林Ampicillin15088.246072.2921083.00哌拉西林Piperacillin10762.945768.6716464.82酶復合制劑Enzymeinhibitorcomplex氨芐西林/舒巴坦Ampicillin/sulbactam4425.8811.203614.22頭孢類Cephalosporins頭孢吡肟Cefepime2615.291012.05239.09頭孢曲松Ceftriaxone10561.764959.0415460.87頭孢他啶Ceftazidime8348.823542.1711846.64頭孢噻吩Cephalosporin14786.476881.9221584.98頭孢噻肟Cefotaxime13881.186578.3120380.24頭孢哌酮Cefoperazone7745.292125.309838.74頭孢唑林Cefazolin14685.884655.4219235.89單環(huán)內(nèi)酯胺類Monobactams氨曲南Aztreonam6638.823238.559838.74四環(huán)素類Tetracyclines四環(huán)素Tetracycline15691.765667.5021283.79強力霉素Doxycycline14484.714351.8118874.31喹諾酮類Quinolones萘啶酸Nalidixicacid16094.117387.9523392.09環(huán)丙沙星Ciprofloxacin4325.2944.824718.58諾氟沙星Norfloxacin6135.8833.616425.30氧氟沙星Ofloxacin4928.8211.205019.76氯霉素類Chloramphenicols氯霉素Chloramphenicol11366.47910.8412147.83碳青霉烯類Carbapenems亞胺培南Imipenem000000葉酸代謝抑制劑Folatemetabolisminhibitor復方SMZCompoundsulfamethoxazole11467.066375.9017769.96

2.2 產(chǎn)酶情況 對233株多重耐藥志賀菌經(jīng)紙片確認，證實93株為產(chǎn)ESBLs志賀菌，檢出率為39.91%，其中B群志賀菌76株，占32.62%，D群志賀菌17株，占7.30%。屬耐三代頭孢菌素的69株，占ESBLs志賀菌的74.19%。

2.3 耐藥基因分布 69株耐三代頭孢菌素志賀菌中檢出CTX-M(CTX-M-1群和CTX-M-9群)、OXA和TEM耐藥基因，未檢出CTX-M-2群和SHV耐藥基因，攜帶率以CTX-M基因(CTX-M-1群和CTX-M-9群)最高，占79.71%；OXA耐藥基因次之。見表3。耐藥基因陽性產(chǎn)物測序后, 與GenBank的blast比對，CTX-M-1群以CTX-M-15 型為主(26/69)，其它酶型包括CTX-M-3型(7株)、CTX-M-55型(5株)、CTX-M-79型(4株)、CTX-M-22型(4株)、CTX-M-5型(3株)、CTX-M-64型(3株)、CTX-M-123型(1株)；CTX-M-9群以CTX-M-14型為主(32/69)，其它酶型包括CTX-M-24型(15株)、CTX-M-27型(4株)、CTX-M-19型和CTX-M-21型(各2株)、 CTX-M-16型和CTX-M-13型(各1株)。49株OXA和18株TEM耐藥基因測序后均為1型(OXA-1型和TEM-1型)。攜帶兩種以上耐藥基因的志賀菌21株，占30.43%，分別是CTX-M-1群(CTX-M-15型)+TEM-1型5株，占7.25%；OXA-1型+CTX-M-1群(CTX-M-15型)4株，占5.80%；CTX-M-9群(CTX-M-14型)+TEM-1型7株，占10.14%；OXA-1型+CTX-M-9群 (CTX-M-14型) 5株，占7.25%。

表3 69株耐三代頭孢菌素志賀菌檢出耐藥性基因情況
Table 3 The detection of resistance genes from 69 strains of the third-generation cephalosporins-resistantShigella

血清群Sero-group檢測株數(shù)No.ofdetectedstrainsCTX-M-1CTX-M-2CTX-M-9OXATEMSHV+%+%+%+%+%+%B群GroupB552036.36002743.644276.361730.9100D群GroupD14321.4300535.71750.0017.1400合計692333.33003246.374979.011826.0900

3 討 論

國內(nèi)外細菌耐藥性監(jiān)測顯示志賀菌的耐藥性在增強，多重耐藥菌ESBLs株越來越多，耐第三代頭孢菌素志賀菌明顯增多[12]，這可能是不規(guī)則用藥和各領域廣泛使用抗菌藥物的結果，而志賀菌通過自身多機制協(xié)同獲得耐藥也是增強的原因。藥敏檢測顯示有92.09%(233/253)的志賀菌為多重耐藥菌，菌株對抗菌藥物的耐藥性較強，對頭孢曲松等三代頭孢菌素耐藥率高達53.57%(133/253),其中ESBLs株36.76%(93/253)，產(chǎn)酶率74.19%(69/93)，耐藥譜幾乎覆蓋了除耐碳青霉烯以外的所有抗生素,其耐藥性有超過大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌等腸桿菌科細菌的趨勢[13]，由此可見我市志賀菌耐藥的嚴重性，應引起我們的高度重視。此外，還發(fā)現(xiàn)耐藥性與菌株的血清型存在關聯(lián)，D群志賀菌無論是耐藥種類，還是ESBLs株數(shù)均明顯低于B群志賀菌，其原因有待進一步探討。

志賀菌對三代頭孢菌素的耐藥是由質粒介導產(chǎn)生，可水解滅活頭孢菌素類等多種抗生素，其ESBLs流行酶型與各地使用抗生素種類有關，且耐藥基因的種類在增加中[14]。從69株耐三代頭孢菌素志賀菌中檢出了CTX-M(CTX-M-1群、CTX-M-9群)、TEM和OXA三類耐藥基因，檢出率分別為79.71%、79.01%和26.09%，其中有30.43%(21/69)的志賀菌攜帶二種以上耐藥基因，表明本市志賀菌具有攜帶多種耐藥基因能力,可通過多種耐藥傳播機制或渠道獲得，其復雜性有待進一步研究。CTX-M耐藥基因自1995年擴散以來，迅速成為全球流行最廣的ESBLs基因型。在我國以CTX-M-9群最為多見，并從北京、河北等地的志賀菌中分離到多種CTX-M。檢測顯示本市志賀菌耐藥流行優(yōu)勢酶型以CTX-M(CTX-M-1群、CTX-M-9群)為主，OXA為輔，與國內(nèi)外報道的以CTX-M 為主結論一致，但不同于TEM 和SHV為輔的結論[15]。陽性產(chǎn)物測序與GenBank Blast比對顯示，CTX-M-1群以CTX-M-15型為主，還檢出了CTX-M-3等其它7個型；CTX-M-9群以CTX-M-14型為主，檢出了CTX-M-24等其它6個型。前者與北京地區(qū)報道相同[16]，后者亞型與俞云松等一致[17]，是我市志賀菌中流行優(yōu)勢酶基因型的代表型。同時，有30.43%(21/69)耐三代頭孢菌素志賀菌攜帶兩種及以上耐藥基因，反映了我市志賀菌的攜帶耐藥基因的多樣性與復雜性，合理、規(guī)范地使用抗菌藥物，是減少志賀菌耐藥性的關鍵。耐藥基因比較結果顯示CTX-M-15型與CTX-M-3型的序列僅有一個氨基酸的差別(Asp240→Gly的替換)，卻能增強志賀菌對頭孢他啶的催化能力；CTX-M-64型是CTX-M-14型和CTX-M-15型的嵌合體，對三代頭孢菌素增加了水解活性[18]，提高了志賀菌的耐藥性。

OXA耐藥基因具有較強的擴散能力，也是引起頭孢類抗菌藥物耐藥的重要原因，有些亞型對碳青霉烯類抗菌藥物有較高的活性，更引起人們的關注。以往該基因很少從產(chǎn)ESBLs志賀菌中檢出，主要存在于銅綠假單胞菌和鮑曼不動桿菌中[19]。檢測發(fā)現(xiàn)產(chǎn)ESBLs志賀菌攜帶OXA-1型耐藥基因高達79.01%，高于苗元等報道的25.3%志賀菌攜帶OXA-1型耐藥基因[20]，且對氨芐西林等青霉素類抗菌藥物的耐藥性較高，符合OXA耐藥特征。其檢出率僅次于CTX-M，也是本地志賀菌主要的流行耐藥酶型，與OXA不屬于志賀菌主要耐藥酶型的結論不同[21]，在國內(nèi)較少見報道，我們應加強檢測與分析，有利于發(fā)現(xiàn)耐碳青霉烯類的新亞型。在分子水平上OXA耐藥基因可分為五個組，志賀菌的OXA耐藥基因屬第III組，主要包括OXA-1、OXA-4、OXA-30和OXA-31等型。42株攜帶OXA耐藥基因志賀菌的陽性產(chǎn)物經(jīng)測序分析均為OXA-1型，無其它型別，顯示本市攜帶OXA耐藥基因志賀菌的主要流行型是OXA-1，與文獻報道一致[22]。此外，存在不同血清群志賀菌攜帶OXA耐藥基因有所差別的現(xiàn)象。B群志賀菌有76.36%(42/55)的菌株攜帶率，高于D群志賀菌的50.00%(7/14)，應進一步探討血清學與耐藥性的相關性。

本次檢測的TEM耐藥基因是產(chǎn)ESBLs志賀菌中檢出率最低的(18/69)，經(jīng)測序分型全部為TEM-1型，與國內(nèi)TEM耐藥基因流行型一致[23]。其耐藥性是通過酶活性中心附近的編碼基因發(fā)生1個或多個氨基酸突變，形成一系列酶蛋白衍生物，影響底物識別和形成速率，進而影響到?；傅乃?，從而拓展了對頭孢類抗菌藥物的特異性，突變所在的活性位點不同，造成不同的耐藥譜，仍有待我們繼續(xù)關注與檢測。TEM-1型耐藥基因雖不是導致志賀菌對三代頭孢菌素耐藥的主要原因，但可協(xié)助菌株增強耐藥性。并且該耐藥基因是革蘭陰性菌中最常見的傳統(tǒng)β-內(nèi)酰胺酶，也是引起醫(yī)院感染細菌暴發(fā)疫情的主要酶型，應引起我們的關注。SHV耐藥基因的特征與TEM耐藥基因相似，都是傳統(tǒng)的β-內(nèi)酰胺酶，有許多亞型，曾在國內(nèi)仍至亞洲發(fā)生過流行，本次雖未檢出，尚須加強檢測與防范。

總之，本市志賀菌攜帶多種產(chǎn)ESBLs耐藥基因，在表型上表現(xiàn)出較強耐藥性。共檢出CTX-M(CTX-M-1群和CTX-M-9群)、OAX、TEM三群耐藥基因，檢出率較高。測序發(fā)現(xiàn)CTX-M(CTX-M-1群和CTX-M-9群)耐藥基因的型別多樣，以CTX-M-15型和CTX-M-14型為主流酶型，其菌株的耐藥基因是在質粒上編碼，可通過轉化、轉導、轉座和接合轉移等多種方式在志賀菌內(nèi)或不同細菌間傳遞，造成產(chǎn)ESBLs志賀菌的擴散與流行。不同血清群志賀菌無論是表型的耐藥性，還是攜帶耐藥基因，均為B群高于D群志賀菌，這對細菌耐藥的流行防控具有重要意義。因此，在日常檢測中應加強對志賀菌的耐藥性監(jiān)測，及時分析，為臨床合理治療、科學用藥提供幫助，杜絕不規(guī)范用藥，以減少菌痢的發(fā)生。

[1] Mandomando I, Jaintilal D, Pons MJ, et al. Antimicrobial susceptibility and mechanisms of resistance inShigellaandSalmonellaisolates from children under five years of age with diarrhea in rural Mozambique[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2009, 5(6): 2450-2454. DOI: 10.1128/AAC.01282-08

[2] Nguyen TV, Le PV, Le CH, et al. Antibiotic resistance in diarrheagenicEscherichiacoliandShigellastrains isolated from children in Hanoi, Vietnam[J]. Antinicrob Agents Chanother, 2005, 49(2): 816-819. DOI: 10.1128/AAC.49.2.816-819.2005

[3] Tan WB. Advances in genetic mechanism of bacteria resistance[J]. J Patho Biol, 2009, 4(7):543-544.(in Chinese)

譚文彬. 細菌耐藥的基因機制研究進展[J].中國病原生物雜志,2009,4(7):543-544.

[4] Ye YW, Wang YS, Shen ZY. National Guide To Clinical Laboratory Procedures[M].The third edition. Nanjing: Southeast University Press, 2003:822-823.(in Chinese)

葉應嫵,王毓三,申子喻.全國臨床檢驗操作規(guī)程[M].3版.南京:東南大學出版社, 2003: 822-823.

[5] Ministry of Health of the PRC. WS 287-2008 The diagnostic criteria of bacterial and amebic dysentery[S]. Beijing: People’s Medical Publishing House, 2009. (in Chinese)

中華人民共和國衛(wèi)生部. WS 287-2008細菌性和阿米巴性痢疾診斷標準[S]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2009.

[6] CLSI. Performance standards for antimicrobial disk susceptibility tests; Approved standard[S]. 14th ed. Wayne: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2014.

[7] Clinical and Laboratory Standards Institute.M100-S20 Performance standards for antimicrobial susceptibility testing；twentieth informational supplement[S].Wayne: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2014.

[8] Ashraf M, Furuta AK, Shimomura K, et al. Genetic characterization of multidrug resistance inShigellaspp. from Japan[J]. J Med Microbiol, 2006, 55(pt12): 1685-1691. DOI: 10.1099/jmm.0.46725-0

[9] Wang Y, Xu YC, Yang QW, et al. The research on TEM-type-β-lactamases among clinical isolates ofEscherichiacoliandKlebsiellapneumoniain nineteen hospitals[J]. J Clinic Lab Sci,2008,26(2)：85-89.(in Chinese)

王瑤,徐英春,楊啟文,等.19家醫(yī)院大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中TEM型β-內(nèi)酰胺酶的研究[J].臨床檢驗雜志,2008,26(2)：85-89.

[10] Woodfond N. Rapid characterization of beta-lactamases by multiplex PCR[J]. Methods Mol Biol, 2010, 64(2): 181-192.

[11] Eckert C, GautierV, Saladin-Allard M, et al. Dissemination of CTX-M-type-lactamases among clinical isolates of Enterobacteriaceae in Paris, France[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2004, 48(4): 1249-1255. DOI: 10.1007/978-1-60327-279-7_14

[12] Fu YM, Zhang WL, Xu JF, et al. Analysis of CTX-M genotype and resistance of extended-spectrum β-lactamase-producing isolates ofKlebsiellapneumonia[J]. J Harbin Medical Univ, 2006,40(6):433-436.(in Chinese)

付英梅,張文莉,許建豐,等. 產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌CTX-M基因型和耐藥性分析[J].哈爾濱醫(yī)科大學學報, 2006,40(6):433-436.

[13] Zhu DA, Sun JY, Fan HQ, et al. The resistance ofShigellaand the genotype screening of extended-spectrum β-lactamase in Shanghai[J]. Chin J Infect Chemother, 2009, 9(2): 126-129.(in Chinese)

朱東安,孫景勇,范惠清,等.上海地區(qū)志賀菌耐藥性及超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的基因分型[J].中國感染與化療雜志,2009,9(2):126-129.

[14] Mandomando I, Jaintilal D, Pons MJ, et al. Antimicrobial susceptibility and mechanisms of resistance inShigellaandSalmonellaisolates from children under five years of age with diarrhea in rural Mozambique[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2009, 53(6): 2450-2454. DOI: 10.1128/AAC.01282-08

[15] Fankhauser C, Zingg W, Francois P, et al. Surveillance of extended spectrum deta lactamase producingEnterobacteriaceaein a Swiss tertiary care hospirtal[J]. Swiss Med Wkly, 2009, 139(51-52): 747-751.

[16] Bao CM, Guo TS, Cui EB, et al. The research for the distribution of resistant genes of ESBLs-producing isolates ofShigellasonnei[J]. Military Med, 2011, 35(2):122-127.(in Chinese)

鮑春梅,郭桐生,崔恩博,等,產(chǎn)ESBLs宋內(nèi)志賀菌耐藥基因分布研究[J]．軍事醫(yī)學,2011,35(2):122-127.

[17] Yu YS, Ji SJ, Chen YG. Advances of producing CTX-type extended spectrum beta-lactamase[J]. Clinic Microbiol Anti-infect Forum, 2004, 10.(in Chinese)

俞云松,季淑娟,陳亞崗. 產(chǎn)CTX-M型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶研究進展. 臨床微生物與抗感染論壇, 2004, 10.

[18] Nagano Y, Nagano N, Wachino J, et al. Novel chimeric beta-lactamase CTX-M-64, a hybrid of CTX-M-15-Like and CTX-M-14 beta-lactamases, found in aShigellasonneistrain resistant to various oxyimino-cephalosporins, including ceftazidime[J]. Antinicrob Agents Chemother, 2009, 53(1): 69-74. DOI: 10.1128/AAC.00227-08

[19] Weldhagen G, Poirel L, Nordmann P. Ambler class A extended-spectrum beta-lactamases inPseudomonasaeruginosa: novel developments and clinical impact[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2003, 47: 2385-2392

[20] Miao Y, Lu LX, Wu BH, et al. The research on resistant characteristics of OXA-1-type extended-spectrum beta-lactamase-carrying isolates ofShigellain Beijing[J]. Hebei Med, 2014, 36(7): 1081-1082.(in Chinese)

苗元,盧立新,吳本和,等.北京地區(qū)攜帶OXA-1型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶志賀菌耐藥特點研究[J].河北醫(yī)藥,2014,36(7):1081-1082.

[21] Ji WJ, Xu XW, Dong F. The research on genotype and resistance of extended-spectrum beta-lactamase-producing isolates ofShigellafrom pediatric [J]. J Microbiol Immunol, 2010, 30(5): 472-476.(in Chinese)

紀文靜，徐樨巍，董方．兒科產(chǎn)超廣譜 β-內(nèi)酰胺酶志賀菌的基因型和耐藥性研究．中華微生物和免疫學雜志,2010,30(5): 472-476.

[22] Zhang CL, Liu QZ, Wang J, et al. Epidemic and virulence characteristic ofShigellaspp. with extended-spectrum cephalosporin resistance in Xiaoshan District, Hangzhou, China[J]. BMC Infect Dis,2014,14:260.DOI: 10.1186/1471-2334-14-260

[23] Guo P, He XS, Mei CZ, et al. Detection of Beta lactamase and integron genes in 242 strains ofKlebsiellapneumoniaisolated in a hospital from 2012 to 2013[J]. Chin J Zoonoses, 2015, 31(5): 437-440. (in Chinese)

郭普, 賀曉珊, 梅傳忠,等. 某醫(yī)院2012-2013年242株肺炎克雷伯菌β-內(nèi)酰胺酶及整合子耐藥基因檢測[J]. 中國人獸共患病學報2015, 31(5): 437-440.

Gene typing of ESBLs-producing third-generation cephalosporins-resistantShigellain Ningbo, China

ZHOU Wei-yan, ZHENG Jian, YE Shuo, SHEN Xuan-yi, XU Jing-ye, XU Xiao-min

(NingboMunicipalCenterforDiseasesPreventionandControl,Ningbo315010,China)

We investigated the third-generation cephalosporins-resistantShigellaand its genotype in Ningbo, China, providing a basis for disease prevention and control. Pathogenic bacteria were analyzed by direct isolation combined with enrichment culture isolation. Antimicrobial susceptibility was determined by K-B disk diffusion method and PCR was used for detecting multidrug resistance genes likeCTX-M,OXA,TEMandSHV. BLAST analysis was used to determine the genotype. Results showed that 69 strains of third-generation cephalosporins-resistantShigellawere detected by drug sensitivity screening, accounting for 74.19% of ESBLsShigella. Drug resistance geneCTX-M(CTM-M-1 andCTM-M-9),OXAandTEMwere detected. The detection rate were 79.71%, 79.01% and 26.09% respectively.With noCTX-M-2 andSHV, DNA sequence alignment showedCTX-M-1 group were mainly ofCTX-M-15 type besides seven other types;CTX-M-9 group were mainly ofCTX-M-14 type besides six other types; 49 strains ofOXAand 18 strains of TEM were sequenced to be type 1 (OXA-1 andTEM-1 type). The 21Shigellastrains carrying more than two drug resistance genes accounts for 30.43%.Shigellain Ningbo has high third-generation cephalosporins-resistance rate and many kinds of ESBLs enzymes were detected. The mainstream enzyme type was CTX-M，meanwhile they also carried a variety of drug resistance genes, which could bring difficulties to disease prevention and control. The high carrying rate of OXA-1 type suggests that we should pay more attention. The detection rate of group B was higher than that of group D, including not only the phenotype resistance but also the drug-resistance genes; these findings will be useful in the study of the drug resistance prevalence ofShigella.

Shigella; third-generation cephalosporins-resistant; ESBLs; gene typing

Xu Xiao-min Email: xjl19990802@sina.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.06.014

許小敏，Email：xjl19990802@sina.com

1.寧波市疾病預防控制中心，寧波 315010； 2.寧波市第二醫(yī)院，寧波 315010

R378

A

1002-2694(2017)06-0542-06

2017-01-12 編輯：李友松

寧波市重大(重點)項目(No.2013C51014)和寧波市優(yōu)秀中青年衛(wèi)生技術人才項目(No.2011145)聯(lián)合資助

Supported by the Major (Key) Project of Ningbo (No.2013C51014);and the health Technical Personnel Project of Excellent Young and Middle-aged in Ningbo(No.2011145)