DC-CIK與CIK體外培養(yǎng)對包含HBV基因的HepAD38細(xì)胞的殺傷效果研究*

龔 覓 舒 丹

DC-CIK與CIK體外培養(yǎng)對包含HBV基因的HepAD38細(xì)胞的殺傷效果研究*

龔 覓①舒 丹①

目的：研究乙型肝炎病毒抗原致敏的樹突狀細(xì)胞（DC）和CIK細(xì)胞共同培養(yǎng)后對HepAD38細(xì)胞（含整合HBV基因組）的殺傷作用。方法：從乙肝患者外周血中提取外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），平均分為兩組，研究組培養(yǎng)DC，培養(yǎng)DC第5天加入乙肝抗原并收獲DC，然后加入CIK細(xì)胞，培養(yǎng)出DC-CIK細(xì)胞；對照組單獨(dú)培養(yǎng)CIK細(xì)胞。兩組在培養(yǎng)15 d后分別收獲DC-CIK細(xì)胞與CIK細(xì)胞，同時作為效應(yīng)細(xì)胞，把含有乙肝病毒的HepAD38細(xì)胞作為靶細(xì)胞，分別在5∶1、10∶1的效靶比時進(jìn)行殺傷試驗(yàn)，使用LDH釋放法測定殺傷活性，并用熒光擴(kuò)增法檢測殺傷試驗(yàn)后培養(yǎng)基內(nèi)HBV-DNA水平。結(jié)果：研究組的DC-CIK細(xì)胞的5∶1效靶比時的平均殺傷率為（54.4±6.3）%、10∶1效靶比時的平均殺傷率為（71.5±4.5）%，均明顯高于對照組CIK細(xì)胞的（42.4±3.0）%、（59.4±4.5）%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。研究組的DC-CIK細(xì)胞5∶1效靶比時的培養(yǎng)基內(nèi)的HBV-DNA平均為（1.20±0.30）×106/mL、10：1效靶比時的培養(yǎng)基內(nèi)的HBV-DNA平均為（1.64±0.60）×107/mL，均明顯高于對照組CIK細(xì)胞的（0.90±0.23）×106/mL、（1.28±0.23）×107/mL，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：CIK細(xì)胞與DC-CIK細(xì)胞對HepAD38細(xì)胞均具有殺傷效果，而且隨著效靶比的升高，殺傷效果增強(qiáng)。同時，乙肝抗原致敏的DC誘導(dǎo)出的特異性CIK細(xì)胞（DC-CIK細(xì)胞），能夠有效提高CIK細(xì)胞對乙肝病毒感染的HepAD38細(xì)胞的殺傷作用，其殺傷作用可能與DC被乙肝抗原致敏后誘導(dǎo)出特異性CIK，增強(qiáng)各自療效有關(guān)。

DC； CIK； HepAD38； 效果

慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是世界范圍性質(zhì)的疾病問題，其中我國是HBV感染的主要國家之一[1]，HBV容易發(fā)展成為慢性乙型病毒性肝炎（chronic hepatitis B virus，CHB），而CHB則會發(fā)展為肝硬化或者肝癌，一直以來是我國乃至世界人民生命威脅的傳染病之一。國內(nèi)HBV感染多數(shù)在圍產(chǎn)期或幼年時期發(fā)生，因此易產(chǎn)生免疫耐受，體內(nèi)病毒清除困難，長期的慢性感染還會導(dǎo)致出現(xiàn)各種并發(fā)癥，因此如何清除HBV是CHB治療的重難點(diǎn)。目前國內(nèi)外常規(guī)的治療方法以藥物治療為主，臨床上主要采用核苷酸類似物（NAs）與干擾素（IFN）進(jìn)行抗病毒治療，這種藥物治療能夠有效抑制病毒的復(fù)制，但是治療過程中容易出現(xiàn)病毒耐藥、停藥復(fù)發(fā)等情況，難以確定治療終點(diǎn)[2-3]。

HepAD38細(xì)胞是一種可以分泌HBV病毒顆粒的細(xì)胞系，因此，理論上對HepAD38細(xì)胞進(jìn)行殺傷可以有效抑制HBV-DNA，達(dá)到良好的臨床療效。而CIK細(xì)胞對HepAD38具有一定的殺傷力，對CHB具有良好的療效，患者治療后其HBV-DNA滴度下降[4]，因此如何誘導(dǎo)針對HBV的特異性CIK細(xì)胞來提高對HepAD38細(xì)胞的殺傷力是一個研究方向。本文根據(jù)大量文獻(xiàn)，通過體外培養(yǎng)，以樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）誘導(dǎo)出特異性CIK細(xì)胞（DC-CIK細(xì)胞），來探討DC-CIK對HepAD38細(xì)胞的殺傷及HBV-DNA的抑制效果，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 外周血選自2016年5-12月本院收治的符合文獻(xiàn)[5]中慢性乙型肝炎防治指南的HBeAg陽性CHB患者，采用深圳市金佳禾生物醫(yī)藥有限公司提供的專用培養(yǎng)DC試劑，離心機(jī)為貝克曼公司生產(chǎn)提供。

1.2 DC-CIK及CIK培養(yǎng)方法 提取外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），平均分為兩組，每組15份，研究組培養(yǎng)DC細(xì)胞，培養(yǎng)DC第5天加入乙肝抗原并收獲DC，然后加入CIK細(xì)胞，培養(yǎng)出DC-CIK細(xì)胞；對照組單獨(dú)培養(yǎng)CIK細(xì)胞。具體方法如下：（1）采集20 mL外周血，密度梯度離心分離PBMC，用AIMV（CTS）培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為（4～6）×106個細(xì)胞/mL，接種于6孔板內(nèi)，1 mL/孔，放入培養(yǎng)箱中（37 ℃，CO2濃度為5%）貼壁培養(yǎng)2.5 h。（2）配置DC培養(yǎng)基，DF-01為30X，吸出自然融化的DF-01 400 μL用AIMV（CTS）培養(yǎng)基定容至12 mL備用。（3）取出6孔板，輕搖后將孔內(nèi)的培養(yǎng)基吸出加入至培養(yǎng)瓶內(nèi)做CIK培養(yǎng)。用1 mL的CIK培養(yǎng)基滴洗孔板，每孔重復(fù)2次，直至顯微鏡下觀察懸浮細(xì)胞比例低于5%，將收集的懸浮細(xì)胞加入CIK因子（第1天加入γ因子，第2天加入IL-1α、IL-2、CD3），放入培養(yǎng)箱中（37 ℃，CO2濃度為5%）培養(yǎng)CIK細(xì)胞，然后每3天換液并補(bǔ)加IL-2因子。（4）每孔加入1 mL的DC培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中，記為第0天。（5）第3天，按照步驟2準(zhǔn)備DC培養(yǎng)基，每孔補(bǔ)充1 mL。（6）第5天，每孔分別加入50 μL乙肝表面抗原和乙肝e抗原、100 μL DF-02、100 μL DF-03、10 μL DF-04，誘導(dǎo)刺激40～48 h。（7）第7天，吹打6孔板，將懸浮的細(xì)胞收集在離心管中，再用預(yù)冷的鹽水每孔洗滌2次，收集懸浮細(xì)胞與CIK混合并繼續(xù)培養(yǎng)，每3天換培養(yǎng)液并補(bǔ)加IL-2，第14天收獲CIK和DC-CIK細(xì)胞。

1.3 LDH釋放法測定殺傷活性 用96孔板，每孔加入100 μL濃度為1×106/mL的HepAD38細(xì)胞，取培養(yǎng)好的CIK和DC-CIK計數(shù)，分別配成含量為5×106/mL和1×107/mL的細(xì)胞懸液，各加100 μL（效靶比為5∶1、10∶1），放置培養(yǎng)箱中（37 ℃，CO2濃度為5%）培養(yǎng)4 h，離心，吸上清到另一個96孔板內(nèi)，每孔加試劑盒底物，放培養(yǎng)箱中（37 ℃，CO2濃度為5%），顯色30 min，492 nm吸光度測OD值。細(xì)胞殺傷率=（檢測值-陰性對照/陽性對照-陰性對照）×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用（x－±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組不同效靶比時的殺傷效果比較 研究組的DC-CIK細(xì)胞的5∶1、10∶1效靶比時的平均殺傷率均明顯高于對照組的CIK細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組不同效靶比時的殺傷效果比較 %

2.2 兩組不同效靶比時的培養(yǎng)基內(nèi)HBV-DNA數(shù)比較 研究組的DC-CIK細(xì)胞5∶1、10∶1效靶比時的培養(yǎng)基內(nèi)的HBV-DNA均明顯高于對照組的CIK細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組不同效靶比時的培養(yǎng)基內(nèi)HBV-DNA數(shù)

3 討論

DC及CIK已被應(yīng)用在諸多腫瘤疾病中[6-7]，王斌等[8]報道稱DC與CIK對于結(jié)腸癌細(xì)胞SW1116均具有良好的殺傷效果，殺傷活性能夠達(dá)到64.1%與67.7%。楊曉亞等[9]則利用DC誘導(dǎo)CIK特異性細(xì)胞對肝癌患者HuH-7細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷活性，而且在相同效靶比時，DC-CIK細(xì)胞的殺傷效果明顯優(yōu)于單獨(dú)CIK細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。李可等[10]也表示誘導(dǎo)后的DC-CIK細(xì)胞對肺癌細(xì)胞的殺傷效果較CIK高，而且報告中比較了10∶1、20∶1、50∶1三種效靶比，隨著效靶比時的增高，DC-CIK的殺傷效果增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。CIK細(xì)胞是患者外周血單核細(xì)胞（PBMC）在體外用多種細(xì)胞因子共同培養(yǎng)一段時間后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞[11-12]，其中CD3+、CD56+T細(xì)胞群是抗病毒、直接殺傷腫瘤細(xì)胞的主要免疫細(xì)胞，很早時應(yīng)用在抗腫瘤過繼細(xì)胞免疫治療中[13-14]。應(yīng)用CIK細(xì)胞治療HBV發(fā)現(xiàn)其對HBV-DNA的應(yīng)答效果很好，CIK對CHB具有良好的臨床效果，患者使用這種治療方法可使HBV-DNA滴度明顯降低[4]，而且對一些肝硬化患者自體回輸CIK細(xì)胞后，其HBV-DNA抑制效果明顯變好。因此，CIK細(xì)胞對HepAD38具有一定的殺傷力，對于CHB具有效果顯著的HBVDNA抑制效果。DC則是人體最重要、功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，能夠激發(fā)T細(xì)胞復(fù)制增殖，同時產(chǎn)生免疫應(yīng)答能力[15-16]。DC捕獲HBV后，提呈給CD4+、CD8+T細(xì)胞，CD8+T細(xì)胞能夠?qū)Π琀BV的肝細(xì)胞中的抗原肽進(jìn)行識別、活化并與之結(jié)合，從而溶解肝細(xì)胞進(jìn)而使肝細(xì)胞凋亡。但是DC也能夠同時識別并活化機(jī)體的NK以及抗體依賴性細(xì)胞毒性細(xì)胞，從而對CHB患者的肝細(xì)胞造成損害[17-18]。因此CHB患者體內(nèi)的HBV會造成DC數(shù)量減少，抗原提呈功能降低，使其分泌細(xì)胞因子的能力減弱，T細(xì)胞無法起到應(yīng)答效果。因此，對于CHB患者來說，提高DC的數(shù)量對于清除HBV也是非常重要的。

從本文表1中可知，經(jīng)過誘導(dǎo)后的研究組特異性CIK細(xì)胞（DC-CIK）在5∶1效靶比及10∶1效靶比時的殺傷效果為（54.4±6.3）%與（71.5±4.5）%，均比對照組單獨(dú)CIK的殺傷率高（P＜0.05），而且研究組與對照組的10∶1效靶比相對5∶1效靶比時的殺傷活性更高，這表示隨著效靶比的升高，CIK細(xì)胞的殺傷效果增強(qiáng)。表2中顯示研究組的培養(yǎng)基內(nèi)檢測到的HBV-DNA數(shù)明顯高于對照組，同時研究組與對照組的10∶1效靶比相對5∶1效靶比時的HBV-DNA檢測量多，這是因?yàn)槊庖呒?xì)胞殺傷性越強(qiáng)，HepAD38細(xì)胞裂解越多，HepAD38細(xì)胞內(nèi)HBV釋放到培養(yǎng)基就越多，所以檢測出的HBVDNA水平就越高，因此可以說明DC-CIK較CIK有更好的殺傷活性，對HepAD38細(xì)胞殺傷效果更好。筆者認(rèn)為這主要是因?yàn)镈C-CIK細(xì)胞相對于單獨(dú)的CIK細(xì)胞具有更強(qiáng)的免疫活性。DC與CIK細(xì)胞共同培養(yǎng)后，DC能夠發(fā)揮其最大的優(yōu)勢-激活T細(xì)胞增殖并建立免疫應(yīng)答，因此增強(qiáng)了CIK細(xì)胞的免疫活性，使其對HepAD38細(xì)胞中的HBV-DNA抑制效果更好。而且隨著效靶比的增多，殺傷效果增強(qiáng)，這也可以說明當(dāng)患者體內(nèi)DC-CIK細(xì)胞增多或者HBV-DNA降低時，效果更好，不會有耐性反應(yīng)。

綜上所述，筆者認(rèn)為HBsAg致敏的DC跟CIK共同培養(yǎng)后誘導(dǎo)出HBsAg的特異性CIK對于HepAD38細(xì)胞的殺傷效果更好，其殺傷作用可能與DC被乙肝抗原致敏后誘導(dǎo)出特異性CIK，增強(qiáng)各自療效有關(guān)。

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Study the Killing Effect of DC-CIK and CIK in Vitro on HepAD38 Cells Containing HBV Gene/

GONG Mi，SHU Dan.//
Medical Innovation of China，2017，14（18）：127-130

Objective：To study the killing effect of hepatitis B virus antigen sensitized dendritic cells (DC) and CIK cells on HepAD38 cells (including the integrated HBV genome) after co culture.Method：PBMC was extracted from peripheral blood of hepatitis B patients and divided into two groups，the study group cultured DC，cultured DC for fifth days，added hepatitis B antigen and harvested DC，then added CIK cells to culture DC-CIK cells；the CIK cells were cultured alone in the control group.In the two groups，DC-CIK cells and CIK cells were harvested after 15 d culture，and as the effector cells，the HepAD38 cells containing HBV were used as target cells，in effect the target 5∶1，10∶1 ratio was measured using LDH cytotoxicity assay，cytotoxicity release assay and fluorescence amplification method to detect cytotoxicity after HBV-DNA in the culture medium.Result：The mean killing rate of DC-CIK cells at 5:1，10:1 target ratio in study group were (54.4±6.3)% and （71.5±4.5）%，higher than（42.4±3.0）% and （59.4±4.5）% of control group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.The level of HBV-DNA culture medium of 5∶1 cells and 10∶1 cells in the target ratio of DC-CIK in study group were （1.20±0.30）×106/mL and （1.64±0.60）×107/mL，higher than （0.90±0.23）×106/mL and （1.28±0.23）×107/mL of control group，the differences were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion：CIK cells and DC-CIK cells have a lethal effect on HepAD38 cells，and the effect target ratio increased，the killing effect is enhanced.At the same time，the hepatitis B antigen sensitized DC induced specific CIK cells （DC-CIK cells），can effectively improve the killing effect of CIK cells on hepatitis B virus infection of HepAD38 cells and its cytotoxicity DC and hepatitis B antigen sensitization induced specific CIK， enhance their curative effect.

DC； CIK； HepAD38； Effect

The Third People’s Hospital of Shenzhen，Shenzhen 518000，China

10.3969/j.issn.1674-4985.2017.18.036

2017-04-12） （本文編輯：張爽）

2015年深圳市科技計劃項(xiàng)目

（JCYJ20150402111430634）

①廣東省深圳市第三人民醫(yī)院 廣東 深圳 518000

龔覓