精子發(fā)生相關(guān)基因SOX30基因在人前列腺癌組織中的表達及其臨床意義*

王 翰唐愛發(fā)

1. 安徽醫(yī)科大學（安徽合肥 230031）；2. 深圳市第二人民醫(yī)院

精子發(fā)生相關(guān)基因SOX30基因在人前列腺癌組織中的表達及其臨床意義*

王 翰1,2唐愛發(fā)2**

1. 安徽醫(yī)科大學（安徽合肥 230031）；2. 深圳市第二人民醫(yī)院

目的 研究SRY box containing gene 30（SOX30）基因在前列腺癌組織中表達情況，并且分析SOX30的表達與前列腺癌臨床病理特征之間的相關(guān)性；并檢測SOX30在前列腺癌細胞PC3、DU145、LNCaP以及正常人前列腺上皮細胞RWPE-1中的表達情況。方法 采用免疫組織化學方法檢測SOX30在前列腺癌組織中表達特點，采用逆轉(zhuǎn)錄實時定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）和蛋白印跡法（Western Blotting）分析SOX30在PC3、DU145、LNCaP以及正常人前列腺上皮細胞RWPE-1中的表達情況，運用統(tǒng)計學方法分析SOX30蛋白表達量與前列腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果 在123例前列腺癌中，68例（55.28%）發(fā)生SOX30表達缺失，并且SOX30表達缺失與前列腺分期（P=0.001）、Gleason評分（P＜0.001）有明顯的相關(guān)性；與正常人前列腺上皮細胞RWPE-1相比，SOX30在PC3、DU145、LNCaP中表達明顯降低。結(jié)論 SOX30可能是作為一個腫瘤抑制基因在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

前列腺腫瘤; 免疫組織化學; 基因, 腫瘤抑制

SOX30基因是SOX基因家族成員之一，最早是在人和小鼠體內(nèi)被分離出來并廣泛存在于自然界動物體內(nèi)，隸屬于SOX基因家族H類，也是H類唯一的基因。SOX基因家族基于基因結(jié)構(gòu)層次的不同和組織相似性等特點可以分為10組， 分別以A~J字母命名[1]。SOX30參與哺乳動物精原干細胞分化和精子發(fā)生[2,3]。在小鼠睪丸早期發(fā)育時SOX30開始表達，在睪丸發(fā)育成熟時SOX30表達明顯增加，并且SOX30表達受DNA甲基化水平調(diào)控，并且這種調(diào)控表達模式與小鼠的精子發(fā)生及睪丸發(fā)育相關(guān)[4]，因此是一種精子發(fā)生相關(guān)基因。但目前尚未見有關(guān)SOX30基因在人前列腺癌中的研究報道。本研究應用免疫組織化學方法檢測SOX30在123例前列腺癌中的表達特點并分析其表達與前列腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系，分析SOX30在前列腺癌細胞中的表達特點，為研究前列腺癌發(fā)生機制提供一定的理論依據(jù)。

材料與方法

一、材料

本實驗前列腺癌細胞PC3、DU145、LNCaP以及正常人前列腺上皮細胞RWPE-1均購置于美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection，ATCC），胎牛血清、RMPI-1640、DMEM購自GIBCO公司，RNA提取試劑盒購自日本Takara公司，SOX30基因以及內(nèi)參引物均購自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自QIAGEN公司，SYBR Premix Taq Ⅱ購置于中國的寶生物工程（大連）有限公司，SOX30抗體、Tubulin抗體以及二抗均購置于Abcam。免疫組化芯片購自美國Biomax，其中可用前列腺癌組織123例。

二、實驗步驟

（一）免疫組織化學染色

實驗所用組織芯片首先經(jīng)過100%的二甲苯浸泡進行脫蠟，之后依次浸泡于100%、95%、85%和80%的乙醇中，時間分別為15min、5min、5min、5min，接著將芯片浸泡于0.3%H2O2甲醇中封閉25min，0.01mol/L枸櫞酸緩沖液進行抗原修復，PBS緩沖液清洗2min滴加BSA封閉，室溫孵育25min，洗掉BSA封閉液加SOX30抗體（1:500）4℃過夜，PBS緩沖液清洗加羊抗兔IgG，37℃孵育1h，蘇木精染色鏡下觀察。

（二）RNA提取和cDNA合成

依照總RNA提取試劑盒使用說明書分別提取PC3、DU145、LNCaP、RWPE-1 4株細胞的總RNA，之后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的gDNA去除液去除基因組DNA，總RNA反轉(zhuǎn)成體系為20μL單鏈cDNA。

（三）實時熒光定量聚合酶鏈式反應

反應總體系20μL：10μL的SYBR Premix，2μL的cDNA，7μL的水，0.5μL的上游引物以及0.5μL的下游引物，加好后混勻上機。設(shè)置程序：95℃預變性30s，95℃變性5s，40個循環(huán)，60℃退火1min，72℃延伸30s。引物序列見表1。

表1 引物序列

（四）Western Blotting

使用蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑按照100:1的比例分別提取4株細胞的蛋白，測量蛋白濃度后每個樣品含蛋白20μg，配置10 %的凝膠進行SDS-PAGE電泳，在目的蛋白泳動至距膠下緣1 cm以上結(jié)束。使用PVDF膜半干轉(zhuǎn)，110 V 1.5h，5 %的脫脂牛奶封閉1h，TBST清洗3遍，每遍5 min，后加一抗SOX30抗體（1:2000，兔抗），4℃孵育過夜，而后吸掉一抗用PBST或TBST漂洗膜后再浸洗3次，5~10min/次，根據(jù)一抗來源選擇合適的二抗（鼠抗兔），根據(jù)鑒定方法選擇HRP或AP標記的抗體，按相應比例稀釋（1:1000~1:10000），室溫輕搖1h，加二抗常溫孵育1h，二抗孵育結(jié)束后，用PBST或TBST漂洗膜后再浸洗3次，5~10min/次。

結(jié) 果

一、SOX30在前列腺癌組織中的表達

石蠟包埋的前列腺癌組織芯片123例，利用免疫組化分析SOX30在前列腺癌組織中的表達，使用正常前列腺組織切片作為SOX30陽性表達對照（圖1，圖2，圖3），發(fā)現(xiàn)在123例前列腺癌組織中，有68例（55.28%）SOX30表達缺失，55例呈弱陽性表達，SOX30表達缺失與臨床病理分期的關(guān)系：Ⅰ期為33.3%（4/12），Ⅱ期為37.5%（18/48），Ⅲ期為74.4%（32/43），Ⅳ期為70.0%（14/20），Ⅰ、Ⅱ期與Ⅲ、Ⅳ期比較，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.001）；與Gleason評分的關(guān)系：＜6分為0（0/8），=7分為49.2%（32/65），≥8分為72.0%（36/50），組間差異明顯（P＜0.001）。而SOX30表達缺失與年齡、淋巴轉(zhuǎn)移無明顯相關(guān)性（P＞0.05），（表2）。

圖1SOX30在前列腺組織中陽性表達（DAB×20），標尺：200μm

圖2SOX30在前列腺癌組織中的弱陽性表達（DAB×20），標尺：200μm

圖3SOX30在前列腺癌組織中的陰性表達（DAB×20），標尺：200μm

表2 SOX30蛋白表達與前列腺癌臨床病理特征關(guān)系

二、SOX30在細胞系中的表達水平

實時熒光定量聚合酶鏈式反應結(jié)果顯示，采用比較 Ct 值方法（2-△△Ct）計算SOX30在4株細胞系中的表達量，與RWPE-1相比，SOX30在PC3、DU145、LNCaP明顯降低，在RWPE-1、PC3、DU145、LNCaP中SOX30表達量分別為1±0.042；0.109±0.038；0.192±0.019；0.378±0.024（圖4）。在Western blot實驗中，SOX30蛋白表達與mRNA水平表達一致，與RWPE-1相比，SOX30在PC3、DU145、LNCaP明顯降低（圖5）。

圖4SOX30在RWPE-1、PC3、DU145、LNCaP細胞中的mRNA表達水平

圖5SOX30在RWPE-1、PC3、DU145、LNCaP細胞中的蛋白表達水平

討 論

前列腺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其致死率在美國居男性腫瘤第二位。2016年美國大約有180 890例新發(fā)病例，約26 120例男性前列腺癌患者死亡[5-7]。前列腺癌早期并無明顯癥狀，但是后期會轉(zhuǎn)移到其他部位例如肝臟、淋巴結(jié)以及最常見的骨轉(zhuǎn)移。臨床上常用的治療方法是手術(shù)切除前列腺癌組織、放療以及臨床觀察，這些治療方法通常適合原位癌并且需要考慮到許多因素，包括年齡、預期壽命、Gleason評分、PSA和腫瘤大小[8]。而轉(zhuǎn)移性前列腺癌必要時需要進行去勢手術(shù)，或者合并使用促黃體激素釋放激素或者拮抗劑，然而這樣的治療措施也只是暫時緩解癥狀，后期都將發(fā)展成去勢抵抗性前列腺癌而死亡[9]。因此，探究前列腺癌的發(fā)病機制，尋找有效的前列腺癌早期診斷方法和治療方法是當前迫切需要解決的問題。SOX30基因是SOX基因家族成員之一，SOX基因是指基因結(jié)構(gòu)含有高遷移率組結(jié)構(gòu)域（HMG）與哺乳動物睪丸決定性基因（Sry）類似的基因[10,11]。目前SOX基因家族約有30個成員，基于不同層次的結(jié)構(gòu)和組織相似性等特征，將30個基因分成A~J 10個組別，同一組別的基因含有相似的HMG-box[11,12]。部分SOX蛋白如SOX2、SOX3、SOX11等只有一個外顯子編碼區(qū)域，而SOX6、SOX9、SOX30含有多個外顯子[14-16]，而且SOX基因并不是集中在同一條染色體上而是在不同的染色體上。除了Sry和SOX3分別位于Y染色體和X染色體上，其他SOX基因都位于常染色體。SOX30是H組唯一的一個基因，目前已在人和多種動物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)該基因，編碼的蛋白質(zhì)作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子調(diào)控胚胎發(fā)育。它可以激活p53基因的轉(zhuǎn)錄促進肺癌細胞凋亡，該蛋白還可能參與發(fā)育雄性生殖細胞的分化，該基因的選擇性剪接可產(chǎn)生多個轉(zhuǎn)錄變異體[13]。目前SOX30在腫瘤的研究報道很少，Han等發(fā)現(xiàn)SOX30作為一種新型的選擇性甲基化基因在肺癌中起著重要作用，SOX30轉(zhuǎn)錄缺失與甲基化有關(guān)，在肺癌中過表達SOX30基因抑制腫瘤細胞的增殖促進凋亡，p53基因是SOX30在肺癌中的下游的靶基因，SOX30可能與P53啟動子區(qū)域CACTTTG（+115~+121）結(jié)合產(chǎn)生作用[17]，而在前列腺癌中未見報道。本實驗結(jié)果顯示，在前列腺癌細胞中SOX30表達明顯降低，SOX30在前列腺癌組織中表達明顯缺失或降低，并且與前列腺癌的臨床病理分期相關(guān)，Ⅲ期、Ⅳ期的SOX30的表達缺失明顯高于Ⅰ期、Ⅱ期，差異具統(tǒng)計學意義（P=0.001），也與Gleason評分相關(guān)（P＜0.001），這提示SOX30的表達缺失可能與前列腺癌的臨床進展有關(guān)；隨著Gleason評分的升高，SOX30表達缺失也呈上升趨勢，提示SOX30表達缺失可能與前列腺癌臨床分化程度有關(guān)，提示SOX30在前列腺癌中可能起著抑制前列腺癌進展的角色，但其具體機制有待進一步研究證實。

本研究首次證實SOX30在前列腺癌細胞和組織中表達下降或缺失，并且與臨床病理分期和組織分級密切相關(guān)，提示SOX30可能與前列腺癌臨床進展有關(guān)，而本實驗只是初步驗證SOX30在前列腺癌中的表達，其在前列腺癌癌中的功能以及具體作用機制有待進一步研究。

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（2016-12-22收稿）

Expression of spermatogenesis related gene SOX30 in human prostate cancer and its clinical signi fi cance*

Wang Han1,2, Tang Aifa2**
1. Anhui Medical University, Hefei 230031 Anhui, China; 2. Shenzhen Second People's Hospital Shenzhen Corresponding author: Tang Aifa, E-mail: tangaifa2004@163.com

Objective To investigate the expression of SRY box containing gene 30 (SOX30) gene in prostate cancer tissues and analyze the relationship between SOX30 expression and clinicopathological characteristics; the expressions of SOX30 were detected in prostate cancer cells PC3, DU145, LNCaP and prostate epithelial cell RWPE-1;Methods Immunohistochemical was used to detect the expression of SOX30 in prostate cancer tissues; Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction and Western blotting were used to analyze SOX30 expressions in prostate cancer cells PC3, DU145, LNCaP and prostate epithelial cells RWPE-1; The relationship between the expression of SOX30 protein and clinicopathological features was analyzed by statistical methods.Results The expressions of SOX30 were absent in 68 cases (55.28%), and the expression of SOX30 was signi fi cantly correlated with the stage of prostate (P=0.001) and Gleason score (P<0.001) in 123 cases of prostate cancer; the expressions of SOX30 in PC3, DU145 and LNCaP were signi fi cantly lower than that in RWPE-1.Conclusion SOX30 may be a tumor suppressor gene, which plays an important role in the development of prostate cancer.

prostatic neoplasms; immunohistochemistry; gene, tumor suppressor

10.3969/j.issn.1008-0848.2017.01.003

R 737.25

項目： 本課題受深圳市科技計劃項目（No.JSGG 201603011 62913 683和JCYJ20130329104732074）和深圳市高水平大學醫(yī)學學科建設(shè)專項資金資助**

,E-mail: tangaifa2004@163.com