手工計數(shù)質(zhì)控不同實驗室計算機輔助精液分析檢測精子濃度的初步研究*

楊 昊張寶仁管 琳李非凡肖佳云王靈敏黃 婭范宇平黃文強陳慧芬滕曉明**

1. 同濟大學(xué)附屬第一婦嬰保健院（上海 200040）；

2. 上海市浦東新區(qū)婦幼保健院；3. 上海市閔行區(qū)婦幼保健院

手工計數(shù)質(zhì)控不同實驗室計算機輔助精液分析檢測精子濃度的初步研究*

楊 昊1△張寶仁2△管 琳3△李非凡1肖佳云1王靈敏1黃 婭1范宇平1黃文強1陳慧芬1滕曉明1**

1. 同濟大學(xué)附屬第一婦嬰保健院（上海 200040）；

2. 上海市浦東新區(qū)婦幼保健院；3. 上海市閔行區(qū)婦幼保健院

目的 研究通過手工計數(shù)精子濃度質(zhì)控不同實驗室計算機輔助精液分析（CASA）檢測精子濃度，以保證不同實驗室之間檢測的精子濃度標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一性。 方法 2016年1月1日至2016年3月31日，通過手工計數(shù)和CASA兩種方法計數(shù)3家醫(yī)院共600份精液的精子濃度，通過分析比較手工計數(shù)與CASA檢測結(jié)果的相關(guān)性。根據(jù)手工計數(shù)的結(jié)果，對于CASA的相關(guān)參數(shù)進行相應(yīng)校正。2016年4月1日至2016年6月30日，再次通過手工計數(shù)和CASA兩種方法計數(shù)3家醫(yī)院共600份精液的精子濃度，分析比較手工計數(shù)與CASA檢測的結(jié)果。結(jié)果 （1）2016年1月1日至2016年3月31日，檢測的600份精液標(biāo)本，其中同濟大學(xué)附屬第一婦嬰保健院 400份，手工計數(shù)和CASA兩種方法檢測精子濃度，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；上海市浦東新區(qū)婦幼保健院 100份，手工計數(shù)的結(jié)果高于CASA檢測的結(jié)果，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；上海市閔行區(qū)婦幼保健院100份，手工計數(shù)的結(jié)果低于CASA檢測的結(jié)果，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（2）根據(jù)以上檢測結(jié)果，對于CASA的相關(guān)參數(shù)進行相應(yīng)校正。2016年4月1日至2016年6月30日，檢測的600份精液標(biāo)本，其中同濟大學(xué)附屬第一婦嬰保健院 400份，手工計數(shù)和CASA兩種方法檢測精子濃度，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；上海市浦東新區(qū)婦幼保健院 100份，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；上海市閔行區(qū)婦幼保健院100份，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 通過對于不同實驗室手工計數(shù)精子濃度的標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一化，來定期校正CASA的檢測結(jié)果，以達到保證不同實驗室之間CASA檢測精子濃度的準(zhǔn)確性和一致性。

精子計數(shù); 診斷, 計算機輔助; 質(zhì)量控制

精子濃度指每單位體積精液中精子數(shù)目，每次射精的精子濃度與妊娠時間和妊娠率存在聯(lián)系，并且可以預(yù)測受孕。通過精子濃度與精液體積就可以計算出每次射精的精子總數(shù)。精子總數(shù)可以衡量睪丸的生精功能以及男性輸精管的暢通程度[1]。

世界衛(wèi)生組織（WHO）人類精液檢查與處理實驗室手冊（第五版）推薦使用血細胞計數(shù)板進行計數(shù)檢測精子濃度，但由于國內(nèi)各個實驗室樣本量普遍較多，絕大多數(shù)采用的是精液計算機輔助檢測系統(tǒng)（CASA），但我們認為也不能過度依賴儀器。研究認為CASA作為一種新的檢測技術(shù)具有高效客觀、高精度的特點，但也存在許多影響因素和局限性，不能盲目依賴其結(jié)果[2]，所以計算機儀器自身有局限性，容易對于檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性產(chǎn)生一定的影響。加之不同實驗室之間的CASA以及檢驗標(biāo)準(zhǔn)也是各式各樣，難免各個實驗室之間的精子濃度的標(biāo)準(zhǔn)與結(jié)果有所差異。即便是采用相同的CASA系統(tǒng)，但是如果計數(shù)板自身的差異或變化也會一定程度上影響到檢測結(jié)果。在2013年就有研究認為在精子濃度分析中，精子計數(shù)池的深度非常關(guān)鍵，使用不合格的計數(shù)板，將導(dǎo)致檢測結(jié)果產(chǎn)生誤差，這種誤差和計數(shù)板深度誤差成正比[3]。

基于CASA存在這些不定的因素，我們認為定期對CASA系統(tǒng)進行參數(shù)校正是有必要的。在2014年的一項研究表明雖然精子質(zhì)量分析系統(tǒng)經(jīng)過廠家的定標(biāo)，但在臨床使用前仍有必要進行體積和速度參數(shù)設(shè)置[4]，這也進一步支持了我們的觀點。本次研究嘗試規(guī)范和統(tǒng)一不同實驗室對于精子濃度檢測的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，通過統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的手工計數(shù)方法對CASA系統(tǒng)參數(shù)進行定期校正，以達到不同實驗室之間對于精子濃度標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一性。

材料與方法

一、研究對象

研究對象為同濟大學(xué)附屬第一婦嬰保健院、上海市浦東新區(qū)婦幼保健院和上海市閔行區(qū)婦幼保健院3家醫(yī)院生殖中心男科實驗室的精液標(biāo)本，2016年1月1日至2016年3月31日600份。

二、方法

（一）手工計數(shù)精子濃度

將充分混勻、未稀釋的液化精液滴加在載玻片上進行鏡檢，確定合適的稀釋度。然后根據(jù)確定的稀釋度，使用含有固定液的稀釋液（將50g NaHCO3和10mL 35% v/v甲醛溶液加入1 000 mL純水中配制成稀釋精液的固定液）將精液標(biāo)本稀釋到合適的濃度。在血細胞計數(shù)板的計數(shù)池上加樣，在10~15min內(nèi)評估精液樣本。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）人類精液檢查與處理實驗室手冊的標(biāo)準(zhǔn)程序，進行計數(shù)，每個重復(fù)樣本至少計數(shù)200條精子。首先評估血細胞計數(shù)板一側(cè)計數(shù)池的中央網(wǎng)格，逐排計數(shù)精子，直到至少數(shù)到200條精子。如果在中央網(wǎng)格的5排中計數(shù)不到200條精子，繼續(xù)計數(shù)兩個相鄰網(wǎng)格中每排內(nèi)的精子（4個大方格）。計數(shù)到至少200條精子，記錄下評估排數(shù)以及精子數(shù)量。并在血細胞計數(shù)板的另一個計數(shù)池中計數(shù)，使用相同的排數(shù)，無論是否計數(shù)到200條精子。將兩次計數(shù)結(jié)果進行差異分析，如果這種差異在可接受范圍內(nèi)，計算精子濃度。如果這種差異太高，重新檢驗計數(shù)[1]。

（二）CASA計數(shù)精子濃度

同濟大學(xué)附屬第一婦嬰保健院使用的是西班牙SCA精液質(zhì)量分析系統(tǒng)，上海市浦東新區(qū)婦幼保健院使用的是以色列SQA-V精液分析系統(tǒng)，上海市閔行區(qū)婦幼保健院使用的是中國北京中科恒業(yè)科技有限公司的精子自動分析檢測系統(tǒng)。按照各系統(tǒng)要求的操作規(guī)范對于每份精液的精子濃度進行檢測計數(shù)并記錄結(jié)果。

（三）CASA校正

將2016年1月1日至2016年3月31日得到的數(shù)據(jù)，3家醫(yī)院分別根據(jù)所使用的CASA系統(tǒng)參數(shù)設(shè)置里對于精子濃度相關(guān)的參數(shù)進行調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)比例按照濃度均值差別的百分比進行調(diào)節(jié)，然后使用調(diào)節(jié)后的系統(tǒng)檢測2016年4月1日至2016年6月30日期間的樣本。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)使用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異有顯著性。

結(jié) 果

一、CASA校正前與手工計數(shù)檢測精子濃度的結(jié)果比較

2016年1月1日至2016年3月31日，檢測的600份精液標(biāo)本，其中同濟大學(xué)附屬第一婦嬰保健院 400份，手工計數(shù)和CASA兩種方法檢測精子濃度，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；上海市浦東新區(qū)婦幼保健院 100份，手工計數(shù)的結(jié)果高于CASA檢測的結(jié)果，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；上海市閔行區(qū)婦幼保健院100份，手工計數(shù)的結(jié)果低于CASA檢測的結(jié)果，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見

表1。

二、CASA校正后與手工計數(shù)檢測精子濃度的結(jié)果比較

根據(jù)以上檢測結(jié)果，對于有差異的CASA的相關(guān)參數(shù)進行相應(yīng)校正，上海市浦東新區(qū)婦幼保健院的濃度相關(guān)參數(shù)校正3.6%，上海市閔行區(qū)婦幼保健院4.0%。2016年4月1日至2016年6月30日，檢測的600份精液標(biāo)本，其中同濟大學(xué)附屬第一婦嬰保健院 400份，手工計數(shù)和CASA兩種方法檢測精子濃度，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；上海市浦東新區(qū)婦幼保健院 100份，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；上海市閔行區(qū)婦幼保健院100份，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表1 CASA校正前與手工計數(shù)檢測精子濃度的結(jié)果比較

表2 CASA校正后與手工計數(shù)檢測精子濃度的結(jié)果比較

討 論

目前國內(nèi)尚無按照世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊第五版制定的適用于CASA的質(zhì)控規(guī)范和完善的男科實驗室的室間質(zhì)控工作，本次研究的推廣有利于男科實驗室的規(guī)范化發(fā)展，有利于不孕不育臨床的治療，可以改善目前醫(yī)療機構(gòu)之間精液檢查分析結(jié)果無法完全互相參考的情況。早在2005年黃宇烽就建議必須建立一個標(biāo)準(zhǔn)的操作系統(tǒng)可應(yīng)用于所有實驗室，為不同實驗室的質(zhì)控評價提供基礎(chǔ)，最終提高所有實驗室結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性以及可比較性[5]。此次研究我們聯(lián)合其他兩家醫(yī)院進行研究，首先我們采取培訓(xùn)班的模式進行手工計數(shù)精子濃度的專項授課講解以及實踐培訓(xùn)，統(tǒng)一手工計數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)操作流程，以達到3家醫(yī)院間不同的操作人員對于手工計數(shù)精子濃度的操作達到一致性，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性和統(tǒng)一性。之后3家醫(yī)院的技術(shù)人員分別按預(yù)定的要求檢驗各自醫(yī)院的標(biāo)本。

2016年1月1日至2016年3月31日，總共檢測的600份精液標(biāo)本。其中同濟大學(xué)附屬第一婦嬰保健院400份，手工計數(shù)和CASA兩種方法檢測精子濃度，并無顯著差異，這可能與該院定期進行手工計數(shù)質(zhì)控有關(guān)。而上海市浦東新區(qū)婦幼保健院手工計數(shù)的100份結(jié)果是稍高于CASA檢測的結(jié)果的，同期上海市閔行區(qū)婦幼保健院100份，手工計數(shù)的結(jié)果卻稍低于CASA檢測的結(jié)果。我們仔細分析比較發(fā)現(xiàn)，雖然這兩家醫(yī)院手工計數(shù)的結(jié)果與CASA結(jié)果比較差異并非很大，但是這種普遍性的差異還是要引起我們的重視。所以我們匯總數(shù)據(jù)后，根據(jù)均值差異的大小對于相應(yīng)的CASA檢測儀進行了參數(shù)校正，及按照高或低的百分率對應(yīng)參數(shù)進行校正。在接下來的3個月（2016年4月1日至2016年6月30日），同樣用了這3家醫(yī)院的600份精液標(biāo)本的精子濃度，都無顯著差異。如果各家醫(yī)院在之后的工作中能定期質(zhì)控，則我們可以較好的保證3家醫(yī)院之間關(guān)于精子濃度結(jié)果的一致性。

本次研究也有值得探討的地方，我們這次研究手工計數(shù)采用的是世界衛(wèi)生組織（WHO）人類精液檢查與處理實驗室手冊（第五版）推薦的方法，血細胞計數(shù)池的高度為100μm，對于精子檢測來說相對容易產(chǎn)生分層的情況。有研究認為專用的精子計數(shù)池（10μm或20μm深），可提供穩(wěn)定的精子分布，有利于精子的檢驗[6]。另外我們由于受到客觀條件因素（時間，地理位置等）的限制，不能實現(xiàn)同一份標(biāo)本在不同醫(yī)院檢驗比對，這也是我們下一步將要進行的實驗研究。通過本次研究，我們發(fā)現(xiàn)通過統(tǒng)一的培訓(xùn)規(guī)范化手工計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)后，各家醫(yī)院不僅可以自己校準(zhǔn)自身所使用的CASA儀器，而且因為標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一化也更易于達到不同醫(yī)院之間檢測結(jié)果的可參考性的目的。并且這種方法相對進行同一份標(biāo)本多家醫(yī)院室間質(zhì)控更易于操作，因為自身就可以定期對于CASA儀器進行校準(zhǔn)，更具有可行性。

我們認為按照世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊第五版里的操作規(guī)范，定期對于CASA儀器進行校準(zhǔn)有助于推進不同醫(yī)院精液檢查標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一性，有利于改善目前醫(yī)療機構(gòu)之間精液檢查分析結(jié)果無法完全互相參考的現(xiàn)狀。通過不斷地完善和改進室內(nèi)質(zhì)控與室間質(zhì)控，我們相信達到不同醫(yī)院精液檢驗結(jié)果一致性的目標(biāo)指日可待。

1 World Health Organization. WHO Laboratory manual for the examination and processing of human semen. 5th ed. Geneva: World Health Organization. 2010: 29-35

2 徐新蓉, 孟安勤, 龔國富. 計算機輔助精液分析與人工常規(guī)精液分析的比較. 國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志 2014; 35(21): 2959-2960

3 陸金春, 岳茹倩, 馮瑞詳, 等. 精子計數(shù)板深度與精子濃度的關(guān)系研究. 中國男科學(xué)雜志 2013; 27(12): 17-20

4 田曉華, 趙邦霞, 陳冬麗. 計算機輔助精液質(zhì)量分析系統(tǒng)參數(shù)調(diào)校方法. 醫(yī)療衛(wèi)生設(shè)備 2014; 35(1): 106-107

5 陸金春. 精液分析標(biāo)準(zhǔn)化與質(zhì)量控制所面臨的問題和解決措施. 臨床檢驗雜志 2016; 34(9): 641-645

6 胡毓安, 陸金春 呂年青, 等. 4種精子計數(shù)方法的比較.

中華男科學(xué)雜志 2006; 12(3): 222-224, 227

（2016-10-15收稿）

Preliminary study on quality control of CASA in different laboratories for calculating sperm concentration by manual counting*

Yang Hao1△, Zhang Baoren2△, Guan Lin3△, Li Feifan1, Xiao Jiayun1, Wang Lingmin1, Huang Ya1, Fan Yuping1, Huang Wenqiang1, Chen Huifen1, Teng Xiaoming1**
1. Shanghai First Maternity and Infant Hospital, Tongji University School of Medicine, Shanghai 20040, China;
2. Children and Women's Health Care Hospital in Pudong New Area, Shanghai; 3. Children and Women's Health Care Hospital in Minhang Area, Shanghai

Teng Xiaoming, tengxiaoming@hotmail.com

Objective To investigate quality control (QC) of Computer-aided Sperm Quality Analysis(CASA) in different laboratories for counting sperm concentration by manual counting, and ensure a standard of sperm concentration counting between different laboratories.Methods Sperm concentrations of 600 semen samples in three different hospitals were determined by manual counting and CASA from January 1, 2016 to March 31, 2016, the CASA parameters wereadjusted based on the results of manual counting. Subsequently, sperm concentrations of other 600 semen samples in three different hospitals were determined by manual counting and CASA from April 1, 2016 to June 30, 2016. The results were comparatively analyzed.Results (1) From January 1, 2016 to March 31, 2016, there was no difference in the results of sperm concentration of 400 semen samples from Shanghai First Maternity and Infant Hospital between manual counting and CASA (P>0.05); the level of sperm concentration in 100 semen samples from Children and Women's Health Care Hospital in Pudong New Area using manual counting was higher than that using CASA (P<0.05); the level of sperm concentration in 100 semen samples from Children and Women's Health Care Hospital in Minhang Area using manual counting was lower than that using CASA (P<0.05). (2) CASA parameters in different laboratories were adjusted based on the above results. from April 1, 2016 to June 30, 2016, there was no difference in the results of sperm concentration of 400 samples from Shanghai First Maternity and Infant Hospital between manual counting and CASA (P>0.05). There was no difference in the results of sperm concentration of 100 samples from Children and Women's Health Care Hospital in Pudong New Area between manual counting and CASA (P>0.05). There was no difference in the results of sperm concentration of 100 samples from Children and Women's Health Care Hospital in Minhang Area between manual counting and CASA (P>0.05).Conclusion The accuracy and consistency of sperm concentration counting between different laboratories can be signi fi cantly improved by adjusting the CASA parameters according to the results of sperm concentration by standard manual counting regularly.

sperm count; diagnosis, computer-assisted; quality control

10.3969/j.issn.1008-0848.2017.01.007

R 446.144

資助：計算機輔助精液分析手工法質(zhì)控技術(shù)的推廣（項目編號：SHDC12014223）**

，E-mail: tengxiaoming@hotmail.com

△為共同第一作者