男性不育患者精液中血管內(nèi)皮生長因子及其受體Flt-1的表達研究*

焦瑞寶唐吉斌馮恒孝劉志宏姚余有

1. 安徽省銅陵市人民醫(yī)院（銅陵 244009）；

2. 銅陵市義安區(qū)血吸蟲防治站；3. 安徽醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院

男性不育患者精液中血管內(nèi)皮生長因子及其受體Flt-1的表達研究*

焦瑞寶1唐吉斌1馮恒孝1劉志宏2姚余有3

1. 安徽省銅陵市人民醫(yī)院（銅陵 244009）；

2. 銅陵市義安區(qū)血吸蟲防治站；3. 安徽醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院

目的 研究男性不育患者精液中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及其受體1（Flt-1）的表達情況，探討兩者在精子發(fā)生和成熟中的作用。方法 在完成男性不育患者精液計算機輔助分析后，選擇性收集120例患者精液標本1mL置于-80℃冰箱保存， VEGF和Flt-1均采用ELISA試劑盒檢測。結(jié)果 研究對象中少精子癥組的VEGF為（154.16±151.46）ng/L，與對照組（253.42±60.02）ng/L比較，t =2.490，差異有顯著性（P＜0.05）；經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，F(xiàn)lt-1與VEGF呈正相關(guān)（r =0.675，P＜0.01）。結(jié)論 男性不育患者精漿中VEGF含量降低可能引起精子發(fā)生減弱，VEGF及其受體Flt-1的表達改變可影響精子運動特征。

不育, 男性; 血管內(nèi)皮生長因子類; 精子能動性

血管內(nèi)皮生長因子（Human vascular endothlial growth factor, VEGF）可由多種正常細胞和腫瘤細胞分泌，能高度特異性地作用于血管內(nèi)皮細胞，以受體介導的方式發(fā)揮其生物學作用[1]。血管內(nèi)皮生長因子受體1（VEGFR1）又稱為fms樣酪氨酸激酶（fms-like tyrosine kinase-1, Flt-1），近年來有研究顯示[2,3]：VEGF和Flt-1均可表達于包括睪丸Sertoli細胞和Leydig細胞等許多與生殖有關(guān)的細胞，并調(diào)節(jié)生殖系統(tǒng)各器官的血管生成和通透性，是體內(nèi)與生殖有關(guān)的重要生長因子之一。但兩者與精子質(zhì)量參數(shù)的關(guān)系，國內(nèi)外少有報道。本文以我院就診的男性不育患者為研究對象，分別檢測患者精液Flt-1以及精漿VEGF，探討其與精子質(zhì)量參數(shù)的關(guān)系，旨在研究其在男性不育中的作用?，F(xiàn)報道如下。

材料與方法

一、研究對象

選擇性收集中醫(yī)男科、泌尿外科門診的男性不育患者120例，年齡為21~46歲，不育時間1~25年，就診時間為2014年8月至2016年3月。排除精液部分丟失、白細胞精液癥患者，排除泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤患者資料。把120例男性不育患者分為4組：無精子癥組18例（精子濃度為0），少精子癥組25例（精子濃度＜15×106/mL），正常濃度組57例（精子濃度在15~213×106/mL），濃度過高組20例（精子濃度＞213×106/mL），診斷標準參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》（第4版）[4]和第5版《世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》[5]。涉及精子運動參數(shù)評價時，排除無精子、死精子和嚴重少、弱精子癥患者，并設(shè)正常對照組20例，均來自醫(yī)院產(chǎn)科門診、自然受孕的孕婦丈夫。

二、試劑與儀器

精液VEGF和Flt-1的ELISA法試劑盒（只限科研用）購自南京建成生物公司。精液白細胞過氧化酶正甲苯胺染色試劑盒購自深圳市華康試劑公司。洗板機、酶標儀均由深圳市匯松公司生產(chǎn)，精子質(zhì)量分析系統(tǒng)由江蘇省捷達公司生產(chǎn)。

三、實驗方法

（一）精液采集

精液標本以手淫法采集，禁欲3~7d，將一次射出的全部精液采集于干凈、帶有刻度的容器內(nèi)；容器加蓋，并標明標本采集日期、時間、禁欲天數(shù)。精液采集后立即于20℃~35℃條件下保溫，并在1h內(nèi)送檢。

（二）精液分析

實驗室收到標本后，立即置于37℃恒溫水浴箱中，定時觀察精液液化狀態(tài)。等液化后，記錄精液的液化時間和精液量，并測定pH值；混勻全份精液后，取5μL精液置于計算機輔助精子質(zhì)量分析系統(tǒng)計數(shù)盤中進行精子質(zhì)量分析，檢測參數(shù)包括精液量、精子濃度、精子總活力、前向運動率，以及反映精子運動特征參數(shù)包括平均路徑速度（VAP）、曲線速度（VCL）、直線速度（VSL）、精子頭側(cè)擺幅度（ALH）、鞭打頻率（BCF）、平均角位移（MAD）、直線性（LIN）、擺動性（WOB）、前向性（STR）[6]。白細胞過氧化酶正甲苯胺染色排除白細胞精液癥患者，完成精液分析后收集1mL精液置于-80℃低溫冰箱保存，以便集中檢測Flt-1和VEGF。

（三） Flt-1和VEGF測定

1. Flt-1測定設(shè)5個標準品，濃度分別為1.5 ng/ mL、3 ng/mL、6 ng/mL、12 ng/mL、24ng/mL；VEGF測定設(shè)5個標準品，濃度分別為75 ng/L、150 ng/L、300ng/L、600ng/L、1200ng/L；

2. Flt-1測定使用混勻后精液40μL，而VEGF測定使用離心后精漿40μL，其余操作參照試劑盒說明書。

（四） 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)處理運用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料采用x±s表示，兩組間比較采用t檢驗，組間多重比較采用單因素ANOVA方差分析，兩組資料的相關(guān)性分析采用Pearson分析，用相關(guān)系數(shù)（r）表示，采用多元線性相關(guān)回歸分析單因素與多組參數(shù)相關(guān)性，檢驗水準：α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、男性不育患者精子濃度與精液中VEGF、Flt-1的關(guān)系分析

結(jié)果見表1。病例組中少精子癥組的VEGF為（154.16±151.46）ng/L，與正常對照組（253.42±60.02）ng/L比較，t=2.490，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其他病例組與正常對照組比較，差異均沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。病例各組與正常對照組Flt-1比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 男性不育患者精子濃度與VEGF、Flt-1的關(guān)系分析（n=120）

二、 男性不育患者精子前向運動率（PR）與精液中VEGF、Flt-1的關(guān)系分析

由表2可見，排除無精子癥組和嚴重少精子癥組患者共26例，余下94例研究對象按精子前向運動率（PR）分為4組，其中PR＜20%組的VEGF低于其他3個病例組和正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。病例4組的Flt-1與正常對照組比較，差異均沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 精子前向運動率（PR）與VEGF、Flt-1的關(guān)系分析（n=94）

三、病例組的Flt-1與VEGF的線性相關(guān)和回歸分析

經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，120例病例組的Flt-1與VEGF呈正相關(guān)（r =0.675，P＜0.01），線性回歸方程為? =0.862+0.012X。

四、兩組精液中VEGF、Flt-1含量與年齡、常規(guī)參數(shù)的多元線性回歸分析

病例組分析結(jié)果見表3，排除無精子癥患者18例，VEGF與精子濃度、精子總數(shù)呈正相關(guān)（P＜0.05）；與年齡、精液量、精子總活力和PR均無相關(guān)（P＞0.05）。正常對照組分析結(jié)果見表4，VEGF、Flt-1與患者年齡、精液量、精子濃度、精子總數(shù)、精子總活力和PR均無相關(guān)（P＞0.05）。

五、兩組精液中VEGF、Flt-1與精子運動特征參數(shù)的多元線性回歸分析

病例組分析結(jié)果見表5，排除無精子癥和嚴重少弱精子癥患者26例，94例研究對象進行多元線性回歸分析顯示，VEGF與VAP和MAD呈正相關(guān)，與BCF呈負相關(guān)（P＜0.05）。

表3 病例組VEGF、Flt-1與患者年齡、精液常規(guī)參數(shù)的多元線性回歸分析（n=102）

表4 正常對照組VEGF、Flt-1與患者年齡、精液常規(guī)參數(shù)的多元線性回歸分析（n=20）

表5 病例組VEGF、Flt-1與精子運動特征參數(shù)的多元線性回歸分析（n=94）

Flt-1與VAP和MAD呈正相關(guān)，與ALH、BCF呈負相關(guān)（P＜0.05）。

正常對照組分析結(jié)果見表6，VEGF和Flt-1與VAP、VCL、VSL、ALH、BCF、MAD、WOB、LIN和STR均無相關(guān)（P＞0.05）。

表6 正常對照組VEGF、Flt-1與精子運動特征參數(shù)的多元線性回歸分析（n=20）

討 論

睪丸內(nèi)精子發(fā)生主要受下丘腦-垂體-睪丸性腺軸的調(diào)控，另外也受到睪丸和附睪內(nèi)環(huán)境以及機體一些細胞生物因子的影響。近年來，大鼠動物實驗表明[7]：在睪丸的各級生精細胞、Sertoli細胞和Leydig細胞內(nèi)，均有VEGF表達。

本研究按精子濃度分組，從少精子癥到濃度正常組，VEGF含量增多，且少精子癥組的VEGF含量與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。VEGF與患者精液常規(guī)參數(shù)的多元線性回歸分析顯示，VEGF與精子濃度、精子總數(shù)呈正相關(guān)（P＜0.05）。另外，本研究還按精子PR分4組比較，伴隨著PR增加，VEGF含量在增加，但差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），這說明精子發(fā)生可能與VEGF表達有關(guān)，而無精子癥產(chǎn)生可能是由于染色體、生精功能障礙或輸精管道梗阻等造成的[8]。

VEGF的生物學效應(yīng)是通過其特異性的膜受體介導實現(xiàn)的，其中VEGFR1又稱為Flt-1[9]。本研究顯示，F(xiàn)lt-1與VEGF呈正相關(guān)（r =0.675，P＜0.05），線性回歸方程為? =0.862+0.012X。本研究顯示：男子不育4個病例組的Flt-1與正常對照組比較，差異均沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。多元線性回歸分析顯示病例組和正常對照組的Flt-1與患者年齡、精液量、精子濃度、精子總數(shù)、精子總活力和PR均無相關(guān)（P＞0.05）。

睪丸內(nèi)產(chǎn)生的精子是在進入附睪后逐漸發(fā)育成熟的。附睪頭部的精子運動很弱，速度很慢，且直線性很差；到了附睪體部，精子運動明顯增強，表現(xiàn)為速度和直線性都有明顯增加，附睪尾部精子在體外可像正常射出的精子一樣向前運動[10]。艾慶燕等[7]對大鼠進行免疫組化染色發(fā)現(xiàn)：VEGF蛋白幾乎表達于附睪管上皮所有主細胞胞質(zhì)中，呈粗大的陽性顆粒，而主細胞可合成和分泌多種特異成分，為精子成熟及儲存提供適宜的微環(huán)境；且VEGF在附睪體部表達最強，頭部次之，尾部和始段表達較弱。本研究中在進行VEGF與精子運動特征參數(shù)的線性多元回歸分析時發(fā)現(xiàn)：男性不育患者精液中VEGF與VAP和MAD呈正相關(guān)，與BCF呈負相關(guān)（P＜0.05）；而正常對照組VEGF與精子運動特征參數(shù)均無相關(guān)（P＞0.05）；Lyibozkurt 等[11]體外實驗也發(fā)現(xiàn)：當VEGF濃度達到15ng/mL時，可顯著提高精子總活力、PR、VCL和STR運動特征參數(shù)。艾慶燕等[7]還發(fā)現(xiàn)：Flt-1蛋白表達于上皮細胞主細胞的核上部胞質(zhì)內(nèi)，陽性染色以附睪頭部最強，尾部遠段次之，近段較弱，體部上皮陰性；本研究對男性不育癥組Flt-1與精子運動特征參數(shù)進行多元線性回歸分析發(fā)現(xiàn)：Flt-1與VAP和MAD呈正相關(guān)，與ALH、BCF呈負相關(guān)（P＜0.05）；而正常對照組的Flt-1與精子運動特征參數(shù)均無相關(guān)（P＞0.05）。

因此我們認為睪丸中VEGF含量可能與精子發(fā)生有關(guān)，而附睪上皮主細胞分泌的VEGF 和Flt-1蛋白，影響著附睪管腔液的組成、精子成熟的微環(huán)境以及精子運動能力獲得等睪丸后的成熟過程。

1 艾慶燕, 趙豫鳳, 楊加周, 等. 精索靜脈曲張對青春期大鼠睪丸中VEGF和Flt-1蛋白表達的影響. 中國組織化學與細胞化學雜志 2012; 21(3): 236-239

2 Lu N, Sargent KM, Clopton DT, et al. Loss of vascular endothelial growth factor A(VEGFA) is forms in the testes of male mice causes subfertility, reduces sperm numbers, and alters expression of genes that regulate undifferentiated spermatogonia. Endocrinology 2013; 154(12): 4790-4802

3 Lee TC, Ho HC. Effects of prostaglandin E2 and vascular endothelial growth factor on sperm might lead to endometriosis-associated infertility. Fertil steril 2011; 95(1): 360-362

4 尚紅, 王毓三, 申子瑜 .全國臨床檢驗操作規(guī)程. 北京:人民衛(wèi)生出版社, 第4版, 2015; 191

5 世界衛(wèi)生組織. 世界衛(wèi)生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊. 人民衛(wèi)生出版社, 第5版, 2011; 193

6 焦瑞寶, 唐吉斌, 馮恒孝, 等.代謝綜合征與男性不育癥的關(guān)系研究. 中國男科學雜志 2015; 29(9): 37-41

7 艾慶燕, 田宏, 張潔, 等. 血管內(nèi)皮生長因子和其受體Flt-1在青春期大鼠睪丸、附睪及附睪內(nèi)精子上的表達研究. 中華男科學雜志 2008; 14(10): 871-875

8 聶群, 俞冬熠, 韓美艷, 等. 無精子及少精子癥患者染色體及生殖激素水平分析. 中國男科學雜志 2016; 30(3): 38-41

9 孫鵬, 郭玉剛, 秦文波, 等. 高脂血癥大鼠陰莖海綿體中VEGF含量變化對NOS的影響. 中國男科學雜志 2010; 24(10): 21-24

10 龔堅, 劉朝圣. 附睪微環(huán)境對精子成熟影響的研究進展.

中國男科學雜志 2016; 30(2): 69-72

11 Lyibozkurt AC, Balcik P, Bulgurcuoglu S, et al. effect of vascular endothelial growth factor on sperm motility and survival. Reprod BioMed Online 2009; 19(6): 784-788

（2016-10-28收稿）

Expressions of vascular endothelial growth factor and its receptor Flt-1 in semen of male infertility*

Jiao Ruibao1, Tang Jibin1, Feng Hengxiao1, Liu Zhihong2, Yao Yuyou3
1.Anhui Province Tongling People's Hospital, Tongling 244009, Anhui, China;
2. Tongling Yi'an Area Schistosomiasis Control Station; 3.Public Health College of Anhui Medical University

Objective To explore the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptor Flt-1 in semen of male infertility and their roles in spermatogenesis and sperm maturation.Methods Semen analysis was performed using computer-aided detection system, and then 120 semen specimens of male infertility patients were collected selectively and preserved in -80℃ refrigerator. The expressions of VEGF and Flt-1 were detected by ELISA.Results The expression of VEGF in asthenozoospermia group was (154.16±151.46)ng/L, while the expression of which in control group was (253.42±60.02) ng/L, the difference was statistically signi fi cant (P<0.05). Correlation coef fi cient r of Flt 1 and VEGF was equal to 0.675, correlation analysis showed a signi fi cant difference (P<0.01).Conclusion Lower VEGF levels in male infertility might cause less Spermatogenesis, the expression of VEGF and its receptor Flt-1 could affect the characteristics of sperm motility.

infertility, male; vascular endothelial growth factors; sperm motility

10.3969/j.issn.1008-0848.2017.01.005

R 698.2

*本課題受安徽省銅陵市衛(wèi)計委科研項目（衛(wèi)科研[2014]28號）基金資助