水體低氧的早期暴露對青鳉(Oryzias latipes)后期的生長、性別比和繁殖能力的影響

穆景利，靳非，趙化德，鄭楠，臧鯤鵬，王菊英

國家海洋局近岸海洋生態(tài)環(huán)境重點實驗室，國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心，大連116023

水體低氧的早期暴露對青鳉(Oryzias latipes)后期的生長、性別比和繁殖能力的影響

穆景利#，靳非，趙化德，鄭楠，臧鯤鵬，王菊英*

國家海洋局近岸海洋生態(tài)環(huán)境重點實驗室，國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心，大連116023

水體低氧已是全球性生態(tài)問題，常以季節(jié)性、偶發(fā)性和晝夜間等不同形式存在于不同的水體中。長期低氧可影響魚類正常的生長和繁殖，但魚類早期生活階段暴露于不同形式的低氧后，后期的生長和繁殖是否會受到不利影響，目前研究甚少。本研究在實驗室模擬了連續(xù)低氧(2.8 mg·L-1DO)(H1)、晝夜低氧(H2)和發(fā)生在胚胎器官形成時期的偶發(fā)性低氧(H3)等3種情景對青鳉胚胎的發(fā)育影響，評估了這一早期暴露對青鳉后期的生長、存活和繁殖的影響。我們發(fā)現(xiàn)，3種低氧方式都可以顯著延長青鳉胚胎的孵化周期，引起胚胎卵黃囊吸收和魚鰾發(fā)育異常；暴露結(jié)束120 d后，H1組青鳉成魚的畸形率顯著升高、存活率和生長速度都顯著下降；H1、H2和H3組中成魚的雌雄比都發(fā)生了改變，魚群中以雄魚為主，且產(chǎn)卵量和受精率都顯著下降。結(jié)果表明，魚類早期胚胎發(fā)育階段所受到的低氧暴露可對后期生長和繁殖產(chǎn)生不利影響，對子代補充和種群穩(wěn)定產(chǎn)生重要影響；魚類關(guān)鍵發(fā)育期所經(jīng)歷的低氧事件，以及晝夜低氧事件所產(chǎn)生的生態(tài)后果不容忽視。

低氧；青鳉魚；早期生活階段暴露；繁殖毒性；性別差異；子代影響

當(dāng)前，季節(jié)性或偶發(fā)性的近岸海域缺氧(溶解氧DO < 2.0 mg·L-1)現(xiàn)象已在世界范圍內(nèi)蔓延，超過400個的近岸海域被報道有缺氧區(qū)的存在[1]，這引起科學(xué)界、政府官員和公眾的高度重視和廣泛關(guān)注。隨著氣候變化和陸源排污加劇，水體層化和富營養(yǎng)化隨之增強，缺氧問題將更加嚴重[2-3]。近年來，我國科學(xué)家在長江口[4-6]、珠江口[7]、渤海[8]、大鵬灣[9]、遼東灣、杭州灣、萊州灣等近岸區(qū)域都發(fā)現(xiàn)有缺氧或低氧的現(xiàn)象。例如，長江口外缺氧區(qū)面積可達20 000 km2[5]，與墨西哥灣的缺氧區(qū)面積相近[10]；渤海水體中溶解氧呈逐漸下降的趨勢[11]，2011年的調(diào)查結(jié)果已經(jīng)很接近缺氧的標(biāo)準(zhǔn)(DO: 3.3 ～ 3.6 mg·L-1)[8]。總體來講，這些近岸海域目前大多處在接近缺氧的低氧狀態(tài)(DO ≈ 3 mg·L-1)。因此，探討水體低氧條件對水生生物的潛在影響具有重要的生態(tài)意義。

季節(jié)性低氧多發(fā)生在魚類產(chǎn)卵和早期發(fā)育時期。一方面，早期生活階段是海洋動物生活史中最脆弱的時期，這一階段對外界脅迫(例如，有毒有害污染物和低pH、高溫、低氧等環(huán)境因子的影響)最為敏感；另一方面，早期生活階段受到的不利影響可傳遞至后期生活史、甚至子代，導(dǎo)致發(fā)育潛能、健康狀況、存活能力和繁殖力等下降[12]?，F(xiàn)有研究顯示，缺氧可延遲或改變胚胎和幼體的正常發(fā)育，引起死亡率升高和繁殖能力下降等生態(tài)問題[13]。但目前在水生生態(tài)領(lǐng)域，有關(guān)魚類經(jīng)低氧的早期暴露后對其后生活史影響的研究甚少[14-15]。同樣，針對低氧的研究，魚類早期生活階段經(jīng)低氧暴露后，后期和子代是否會對其產(chǎn)生適應(yīng)性是值得探討的議題。因此，評估魚類經(jīng)過不同低氧事件的早期暴露后，其后期的生長、發(fā)育和繁殖等受到的影響是本研究的另一個主要目的。

本研究以青鳉魚(Oryzias latipes)為受試生物，在實驗室模擬連續(xù)低氧、晝夜變化低氧和青鳉魚器官形成關(guān)鍵時期的偶發(fā)性低氧等3種情景下對青鳉的早期生活階段進行暴露實驗。暴露結(jié)束后，將成活仔魚轉(zhuǎn)移至正常條件下水體中，直至性成熟和成魚穩(wěn)定產(chǎn)卵，通過分析成魚的性別比、體長、畸形比例和產(chǎn)卵量等指標(biāo)，評估早期暴露對青鳉后期生長和繁殖等影響，為深入揭示河口和近岸中度低氧的生態(tài)影響提供參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 受試魚種

青鳉魚(O. latipes)源于杜克大學(xué)David Hinton實驗室，品系為Orange-red (OR) medaka。成魚飼養(yǎng)于Aquatic Habitats流水式養(yǎng)殖系統(tǒng)中，溫度為25 ℃，光周期為14 h/10 h(光照/黑暗)，每天投喂2次鹵蟲無節(jié)幼體(Artemia nauplii)和3次專用飼料(Otohime β1 200～360 μm)，系統(tǒng)每天自動更新總水量的十分之一。正常情況下，雌魚每天產(chǎn)卵30余枚，為保證魚卵的同步性，在產(chǎn)卵后3～5 h內(nèi)收集，并利用體視鏡對魚卵進行篩查，確保其受精和發(fā)育正常。

1.2 低氧條件控制和暴露設(shè)置

低氧暴露在三氣培養(yǎng)箱(150 Tris-Gas, Thermo Scientific, MA)內(nèi)進行，溫度為27 ℃。通過注入氮氣來調(diào)整培養(yǎng)箱空氣中氧氣含量，從而實現(xiàn)對低氧條件的控制。本實驗培養(yǎng)箱空氣中氧氣含量設(shè)置為7.4%(實際環(huán)境空氣中氧氣含量約為21%)，在此條件下，實測水體中DO為(2.8±0.12) mg·L-1，以此代表中度低氧水平。實驗設(shè)計示意圖如圖1所示，低氧暴露分別模擬3種情景：

1)模擬青鳉早期生活階段的全部暴露，即連續(xù)中度低氧暴露(H1)，暴露周期從受精1 d后(1 dpf)開始至孵化后1 d(1 dph)結(jié)束。

2)模擬晝夜變化情況下的低氧暴露(H2)，即晝夜低氧(晚上9點至第2日早9點)、白天正常，暴露周期同1)。

3)模擬青鳉胚胎器官形成期時開始低氧暴露(H3)，當(dāng)受精卵發(fā)育至Stage 30(約4 dpf)時開始暴露，該階段是體內(nèi)各器官和血液循環(huán)系統(tǒng)開始形成時期，暴露周期從這一時期開始至1 dph結(jié)束，期間晝夜均為低氧條件。

圖1 早期暴露對青鳉后期影響的實驗設(shè)計示意圖(青鳉魚輪廓圖源于Bhandari等[16])Fig. 1 A schematic diagram showing later-life consequences of medaka after early-life exposure to hypoxia (The contour of medaka is referred to Bhandari et al[16])

1.3 實驗設(shè)計

隨機選取一定數(shù)量、發(fā)育階段為1dpf的受精卵，置于20 mL閃爍瓶中，溶液體積為5 mL，受精卵數(shù)量為10枚，設(shè)置H1、H2、H3和正常含氧對照等4種暴露組，各暴露組均設(shè)5個平行。暴露期間，每日記錄胚胎的存活和孵化情況。暴露結(jié)束后將存活的仔魚轉(zhuǎn)移至正常含氧水體中，置于培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)2周，待個體較大后將各暴露組幼魚分為2平行組轉(zhuǎn)移至Aquatic Habitats流水式養(yǎng)殖系統(tǒng)中，正常含氧條件(8.0 mg·L-1)下飼養(yǎng)14周，此時仔魚已性成熟并可每日穩(wěn)定產(chǎn)卵，飼養(yǎng)溫度為25 ℃，光周期14 h∶10 h(光照/黑暗)，pH 6.9～7.1，溶解氧為8.0～8.2 mg·L-1。期間詳細記錄和統(tǒng)計仔魚和成魚的存活和孵化時間等。

1.4 低氧對青鳉胚胎發(fā)育的影響

除計算暴露期間胚胎的存活率外，將詳細對自由胚胎階段(eleutheroembryo stage)的胚胎發(fā)育及形態(tài)變化進行分析，方法參考Chernick等的[17]。概況如下：在暴露后，隨機選取15條2 dph初孵仔魚(處于自由胚胎階段)的存活胚胎置于體式顯微鏡(Nikon SMZ1500)下進行觀察，將以下表型變化進行頻次(有/無)分析，包括顱面畸形(craniofacial abnormality)、圍心腔和腹部水腫(pericardial and abdominal edema, Pc/Ab)、卵黃囊發(fā)育水腫或異常(yolk sac edema/abnormality)、脊索畸形(notochord malformation)、魚鰾發(fā)育異常(swim bladder noninflation)、膽囊著色異常(gall bladder color)、淤血或循環(huán)降低(blood pooling)和其他異常變化等。同時通過測定魚鰾、圍心腔和卵黃囊面積以及胚胎的體長等參數(shù)，以此評估各畸形或異常變化的程度。胚胎成活率是初孵仔魚(1dph)的數(shù)量與受精卵暴露總數(shù)(n= 35)的百分數(shù)，畸形率是在上述表型變化特征中，至少出現(xiàn)一種表型變化的幼魚數(shù)量與總初孵仔魚數(shù)量的百分數(shù)。

1.5 早期暴露對青鳉后期的生長、性別和繁殖的影響

在早期暴露結(jié)束120 d(即孵化后120 d，120 dph)時，通過第二性征對每條成魚的雌雄進行識別和記錄，即與雌魚相比，雄魚背鰭有一個明顯的缺口，并且臀鰭末端呈鋸齒狀。經(jīng)MS-222麻醉后，對每條成魚進行拍照，并對體長進行測量，同時根據(jù)體形和脊柱彎曲情況對成魚的骨骼畸形進行記錄和分析。

在120 dph，各組分別隨機選取3對雌雄成魚進行配對和產(chǎn)卵，連續(xù)7 d每日待青鳉魚產(chǎn)卵結(jié)束后，收集各組和對照組的魚卵，分別記錄各組的產(chǎn)卵量和受精率，并計算各組中每對青鳉魚的日平均產(chǎn)卵量和受精率。

1.6 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

實驗結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析。在做差異性分析前，數(shù)據(jù)先經(jīng)Shappiro-Wilk’s進行正態(tài)和方差齊檢驗，若數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布或方差齊要求后再用單因素方差分析，Bonferroni方法進行多重比較檢驗；若經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)仍不滿足正態(tài)分布或方差齊要求，則用非參數(shù)Kruskal-Wallis方法進行方差分析，P< 0.05則結(jié)果具有顯著性差異。

2 結(jié)果(Results)

2.1 低氧暴露對青鳉胚胎發(fā)育的影響

3種低氧情景對青鳉胚胎存活并未產(chǎn)生顯著的影響，但明顯延長了青鳉胚胎的孵化周期(圖2)。與正常含氧對照組比較，慢性中度低氧(H1)暴露可使青鳉胚胎的孵化周期從9～10 d延至13～15 d，且與H2相比也具有顯著差異(圖2)。

圖2 3種低氧情景早期暴露對青鳉胚胎存活和孵化時間的影響注: (A)存活率(n=35)；(B)孵化周期(n= 26～34)。H1連續(xù)中度低氧(DO為(2.8 ± 0.12) mg·L-1)暴露，暴露周期從受精1 d后(1 dpf)開始至孵化后1 d(1 dph)結(jié)束；H2表示晝夜低氧(晚上9點至第2日早9點)，暴露周期1 dpf～1 dph；H3晝夜低氧，暴露周期4 dpf～1 dph?！癮”表示與對照組相比具有顯著差異(P< 0.05)，“b”表示與H1相比具有顯著差異(P< 0.05)。Fig. 2 Survival and hatch period of medaka embryos after exposure to different hypoxia scenariosNote: (A) survival rate (n =35); (B) hatching period (n= 26 to 34). H1 stands for continuous hypoxia exposure with DO (2.8 ± 0.12) mg·L-1 from 1 dpf to 1dph; H2 stands for diel cycling hypoxia exposure (9:00 PM 1st day to 9:00 AM 2nd day) from 1 dpf to 1dph; H3 stands for temporary hypoxia exposure (9:00 PM 1st day to 9:00 AM 2nd day) from 4dpf to 1dph.“a” indicates a significant difference compared with the control (P< 0.05). “b” indicates a significant difference compared with H1 (P< 0.05).

圖3 青鳉胚胎發(fā)育異常的代表性圖片F(xiàn)ig. 3 Examples of medaka eleutheroembryos on 2 dph following the early-life hypoxia exposure

3種低氧情景均可引起青鳉胚胎發(fā)育異常(圖3)，H1暴露引起的畸形率最高，其次為H2和H3(圖4-A)，表型變化最明顯的特征是卵黃囊吸收異常和魚鰾縮小或未充氣(圖4-B)。H1暴露可引起胚胎體長明顯小于對照組(圖5-A)，且頭部長度顯著變短(圖5-B)。

2.2 早期低氧暴露對青鳉后期存活、生長、性別、繁殖和F1子代的影響

早期暴露結(jié)束120 d，H1組的存活率顯著下降，由對照組的96.5% ± 0.7%下降至79.4%±4.5%(P< 0.05)，H2組和H3組也略有下降，但與對照無顯著差異。H1和H2的畸形率也顯著上升，尤其是H1組中成魚的畸形率約是對照組的3倍，H2組則約為對照的2倍，青鳉成魚的畸形主要表現(xiàn)為骨骼彎曲和游泳行為異常。同時，H1組中成魚的體長也顯著小于對照組(表1)。

除對存活和生長的影響外，早期暴露后還可以顯著影響青鳉后期的性別比，如表1所示，3種低氧暴露均可顯著降低雌雄比，成魚以雄性為主，與對照相比，H1組中雌性成魚在魚群中所占的比例由61.8%±1.1%下降至39.6%±2.9%，H2和H3則分別下降至43.0 %±4.4%和48.1% ±2.7%?？梢?，H1低氧情景影響最為明顯。

3種情景的早期低氧暴露還可顯著降低雌性成魚的產(chǎn)卵量，H1組每條雌魚每天產(chǎn)卵量為(12.4±1.2)枚，與對照相比下降約為37.4%±1.9%，H2組和H3組則分別下降28.3%±1.6%和30.3%±3.2%，H1、H2和H3之間無顯著差異。此外，F(xiàn)1子代的受精率明顯下降，與對照組相比，H1組的F1子代受精率下降約29.1%±4.9%，H2組和H3組則分別下降約23.9%±8.1 %和18.9%±7.0%，H1組要顯著低于H3組。

圖4 3種低氧情景早期暴露對青鳉胚胎(2 dph)發(fā)育異常的影響(n=15)注：(A)各表現(xiàn)變化發(fā)生的頻次；(B)卵黃囊、魚鰾和圍心腔的面積變化情況?！癮”表示與對照組相比具有顯著差異(P< 0.05)，“b”表示與H1相比具有顯著差異(P< 0.05)。Fig. 4 Alterations observed in medaka eleutheroembryos on 2 dph after exposure to different hypoxia scenarios (n=15)Note:“a” indicates a significant difference compared with the control (P< 0.05); “b” indicates a significant difference compared with H1 (P< 0.05).

圖5 3種低氧情景早期暴露對青鳉胚胎(2 dph)體長的影響(n = 15)注： “a”表示與對照組相比具有顯著差異(P< 0.05)，“b”表示與H1相比具有顯著差異(P< 0.05)。Fig. 5 Body length and the ratio of head length to body length observed in medaka eleutheroembryos on 2 dph after exposure to different hypoxia scenariosNote: “a” indicates a significant difference compared with the control (P< 0.05); “b” indicates a significant difference compared with H1 (P< 0.05).

表1 早期低氧暴露后青鳉成魚的存活率、畸形率、性別比和體長(n=15 ～ 32)Table 1 Survival, deformity, sex ratio, and length in adult fish after embryo exposure to different hypoxia scenarios (n=15 to 32)

注：*畸形率包括骨骼畸形和游泳行為異常；“a”表示與對照組相比具有顯著差異(P< 0.05)。

Note: * The incidences of deformity are reported as the incidence of fish having at least one skeletal abnormality or swimming abnormality. “a” indicates a significant difference compared with the control (P< 0.05).

圖6 3種低氧情景早期暴露對青鳉后期繁殖能力和F1子代受精卵的影響注：(A)每條雌魚每日產(chǎn)卵量(n=21)；(B)F1受精率(n=7)；“a”表示與對照組相比具有顯著差異(P<0.05)；“b”表示與H1相比具有顯著差異(P< 0.05)。Fig. 6 Reproduction capacity in adult fish and fertilization rate of F1 offspring after embryo exposure to different hypoxia scenariosNote: (A) Egg released per female each day (n=21); (B) F1 egg fertilization rate (n=7).“a” indicates a significant difference compared with the control (P< 0.05); “b” indicates a significant difference compared with H1(P< 0.05).

3 討論(Discussion)

3.1 中度低氧暴露對青鳉胚胎發(fā)育的影響

本研究中，3種不同方式的中度低氧可延長青鳉胚胎孵化周期2～4 d，但對其存活并未產(chǎn)生顯著的影響。相關(guān)前期的研究表明，低氧對多種魚類的胚胎發(fā)育具有明顯的抑制作用，當(dāng)通過絨毛膜的氧擴散速率下降至不足以維持胚胎正常消耗時，其發(fā)育速率將會降低，導(dǎo)致孵化時間延長[18-19]。在缺氧(anoxia)情況下，魚類的胚胎發(fā)育可被完全抑制，導(dǎo)致孵化失敗，如對伏爾加軟口魚(Chondrostoma nasus)、褐鱒魚(Salmo trutta)和大鱗大麻哈魚(Oncorhynchus tshawytscha)的研究顯示，在1.2 ～ 2.0 mg·L-1DO短期(2～7 d)暴露后，上述魚種胚胎的孵化周期明顯延長，孵化率顯著下降8% ～ 20%[20-22]。Cheung等[23]對青鳉的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)青鳉受精卵在1.5 mg·L-1DO暴露12 d后，孵化周期被延長2.5 d。這一結(jié)果與本研究的結(jié)果基本一致，但本研究的前期預(yù)實驗發(fā)現(xiàn)(結(jié)果未列出)，當(dāng)青鳉受精卵暴露于1.8 mg·L-1DO 15 d后，孵化周期被平均延長5.2 d，胚胎的存活率僅為46.7% ± 10.6%，這一結(jié)果要比Cheung等[23]的結(jié)果嚴重。可見，低氧水平和暴露時間都可以明顯影響魚類胚胎的發(fā)育，對于青鳉而言，暴露時間可能是更為重要的因素。除延長青鳉胚胎的孵化周期外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在2.8 mg·L-1DO暴露下，3種低氧方式都可以改變青鳉胚胎的正常發(fā)育，引起初孵仔魚的畸形率顯著升高，其中最為明顯的變化特征是魚鰾未充氣或體積縮小、卵黃囊吸收減緩和個體變小(圖3～圖5)，其中H1的影響最為明顯，即暴露時間從受精卵1 dpf至1 dph(13 d)，而H2和H3對青鳉胚胎的影響主要表現(xiàn)為卵黃囊吸收減緩。卵黃囊是魚類胚胎和自由胚胎階段的主要營養(yǎng)來源。低氧情況青鳉胚胎卵黃囊吸收減緩或被抑制將可能會降低體內(nèi)的蛋白合成，引起生長和發(fā)育速率降低，H1組體長明顯小于對照組這一結(jié)果證實了這一推論。同時，這一結(jié)果與Bianchini和Wright[12]對虹鱒魚(Oncorhynchus mykiss)中度低氧(DO≈ 2.4 mg·L-1)暴露的結(jié)果也一致。Bianchini和Wright[12]發(fā)現(xiàn)，中度低氧可降低虹鱒胚胎的造血功能，降低了血液中血紅蛋白和紅細胞的濃度和周轉(zhuǎn)率，引起虹鱒胚胎發(fā)育的延緩。中度慢性低氧(H1)導(dǎo)致青鳉胚胎卵黃囊吸收異?；驕p緩以及個體變小的結(jié)果表明，低氧環(huán)境下，青鳉胚胎的代謝速率、營養(yǎng)供給和內(nèi)分泌系統(tǒng)可能都受到了影響。其原因可能為：一是中度低氧使細胞中蛋白合成受限，減低了其代謝速率，并引起血液循環(huán)系統(tǒng)中血紅蛋白含量降低，能力供給也相應(yīng)降低[24-25]；其二可能是中度低氧誘導(dǎo)了胚胎和仔魚適應(yīng)機制的啟動，通過降低體內(nèi)代謝速率的方式來保存能量，從而引起卵黃囊吸收減緩[23]；其三可能是低氧干擾了魚類早期階段的內(nèi)分泌系統(tǒng)，引起發(fā)育紊亂，從而對后期生長和繁殖都產(chǎn)生影響[26-27]。

3.2 中度低氧早期暴露后對青鳉后期生長和存活的影響

低氧對魚類早期發(fā)育影響以及長期低氧對魚類發(fā)育和繁殖的影響已有相關(guān)報道，早期中度低氧暴露對胚胎產(chǎn)生的不利影響是否會影響后期生活史以及子代，這一研究目前鮮有報道，僅有的報道目前多集中于持久性有機污染物(多氯聯(lián)苯，2,3,7,8-四氯二苯并對二惡英和多環(huán)芳烴)的研究。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，中度低氧對青鳉胚胎早期暴露結(jié)束后，青鳉后期的存活、生長和發(fā)育都受到了一定影響，尤其經(jīng)長時間早期暴露(H1)后這一影響更為顯著，明顯降低了青鳉成魚的存活、減緩了個體生長，并引起骨骼發(fā)育和游泳行為異常等(表1)。上述結(jié)果表明，早期低氧暴露會對魚類后期的生長產(chǎn)生影響，這一影響程度與暴露時間有關(guān)。魚類早期發(fā)育階段是機體各器官和功能形成期，不同器官具有不同的“敏感窗口期”，一旦低氧發(fā)生在某個器官的“敏感窗口期”時，且時間達到一定程度，其影響可能是深遠的，并影響其后期和子代[10]。Vanderplancke等[28]對孵化后30 d的歐洲海鱸(Dicentrarchus labrax)的研究顯示，歐洲海鱸幼魚經(jīng)中度低氧暴露8 d后，15 d后幼魚的死亡率并未明顯升高，但生長率和能量代謝率明顯下降，同時腸道的酶活性也顯著下降。其原因可能是暴露期間低氧干擾了歐洲海鱸幼魚呼吸代謝系統(tǒng)的正常發(fā)育，對代謝率、攝食率和健康狀況產(chǎn)生了不利影響。因此，相對于歐洲海鱸幼魚，青鳉胚胎發(fā)育階段可能更為敏感，本研究結(jié)果證實了青鳉胚胎早期所受的不利影響可傳遞至后期生活史，導(dǎo)致其生長速率、健康狀況和存活能力等下降。近期，Brown等[29]對底鳉(Fundulus heteroclitus)的研究發(fā)現(xiàn)，PAHs混合物對底鳉的早期暴露可以引起該成魚的游泳能力，降低其捕食能力，并增加其被捕食的風(fēng)險；除草劑百草對線蟲(C. elegans)的早期暴露，可引起其后生活階段的DNA甲基化水平升高和組織微觀結(jié)構(gòu)改變[30]。TCDD對斑馬魚(Danio rerio)早期暴露后，可引起隔代毒性效應(yīng)，在F1和F1代的胚胎發(fā)育過程中畸形率顯著升高[31]。大底鳉魚(Fundulus grandis)暴露于(1.35 ± 0.45) mg·L-1DO一個月后，其繁殖能力和生長率被顯著降低，雌魚體內(nèi)的類固醇性激素(E2)下降50%，雄魚體內(nèi)的11KT也下降50%[32]。同時，對鯉魚(Cyprinus carpio)、斑馬魚和蝦虎魚(Pomatoschistus microps)等魚類的研究也都顯示，水體低氧具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，可損害魚類的生長和繁殖[23,26-27]。

3.3 中度低氧早期暴露后對青鳉成魚性別比的影響

中度低氧早期暴露后，不僅對青鳉后期的生長和存活產(chǎn)生了明顯影響，而且對成魚的雌雄比也具有顯著影響。我們發(fā)現(xiàn)，在3種不同暴露方式下，成魚的性別比都發(fā)生了顯著變化，魚群中以雄性成魚為主，且在H1暴露方式中雄魚和雌魚在魚群中所占比例達1.4∶1，明顯高于正常水平下的0.6∶1。在前期預(yù)實驗中當(dāng)青鳉胚胎暴露于1.8 mg·L-1DO后，這一比例高達4∶1(未列出)。環(huán)境因素(溫度、pH和低氧)可影響雌雄異體魚類的性別比在多種魚類研究中都有所報道，如對斑馬魚的研究顯示，斑馬魚胚胎經(jīng)0.8 mg·L-1DO暴露120 d后，魚群中雄魚的比例由對照組中61.9%升至74.4%，同時魚體的重量和體長都明顯降低[33]。對青鳉的研究顯示，當(dāng)青鳉受精卵暴露于1.5 mg·L-1DO 90 d后，77%的XX雌性表現(xiàn)出雄性第二性征，54%的這些雌魚性腺中出現(xiàn)雄性睪丸，魚群中的雌雄比發(fā)生了顯著變化，以雄性為主[23]。上述結(jié)果與我們的研究較為相似，但上述研究多是基于長期的低氧暴露，而本研究的低氧水平要略輕于以往研究，且暴露時間也較短，但后期結(jié)果卻較為相似。這一結(jié)果進一步支持了前人有關(guān)低氧可引起魚類性逆轉(zhuǎn)的結(jié)論，也表明早期階段的中度低氧暴露就可對青鳉后期的性別形成產(chǎn)生明顯影響，且影響程度與暴露時間和低氧水平有關(guān)。低氧改變魚類性別比可能與性荷爾蒙的水平和平衡被干擾或打亂有關(guān)，包括睪酮、雌二醇、三碘甲狀腺氨酸、酮睪丸激素和β-雌二醇等[33-35]。此外，低氧還可以通過改變原始生殖細胞的轉(zhuǎn)移方式引起性別差異[36]。在硬骨魚類中，性別決定一般是由遺傳因素(遺傳性別決定)和環(huán)境因素(環(huán)境性別決定)共同作用的結(jié)果，且這種作用是一個可塑性過程。多種環(huán)境因素如激素、溫度、pH、密度、光照強度、低氧等都可能影響性別決定途徑。在大多數(shù)兩性魚類中，遺傳性別決定的作用機制通常是由位于性染色體或常染色體上的單基因或多基因所決定[37]。魚類的性染色體決定型主要表現(xiàn)為XX/XY和ZZ/ZW兩大系統(tǒng)。青鳉的性決定性是表現(xiàn)為XX/XY，其性腺發(fā)育過程是從未分化的原始生殖細胞分化成卵原細胞或精原細胞，然后未分化的性腺再分化成卵巢和精巢[23]。在胚胎發(fā)育期間，細胞增殖和后續(xù)的減數(shù)分裂是分別由雌性生殖細胞和雄性生殖細胞有絲分裂阻滯所啟動。本研究的低氧暴露從胚胎階段起，后期成魚性別比發(fā)生明顯變化的原因可能是低氧改變了原始生殖細胞向卵原細胞分化的方向，從而使精原細胞增加。

3.4 中度低氧早期暴露后對青鳉成魚繁殖力的影響

繁殖力或產(chǎn)卵量是魚類毒理學(xué)中一個綜合性的終點指標(biāo)，也是水生生態(tài)系統(tǒng)風(fēng)險評估中非常重要的內(nèi)容。繁殖能力受損對于子代補充量和維持種群穩(wěn)定具有關(guān)鍵影響[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，3種低氧暴露方式均明顯降低了青鳉成魚的日產(chǎn)卵量，且受精率也顯著下降。這表明早期胚胎階段的中度低氧暴露，可降低后期成魚的能量消耗，調(diào)控配子生產(chǎn)的生殖系統(tǒng)或內(nèi)分泌系統(tǒng)發(fā)生了改變。對其他魚類的低氧研究中，也多次發(fā)現(xiàn)低氧可顯著降低其繁殖能力、延遲產(chǎn)卵時間和損害精子質(zhì)量等。如大底鳉魚成魚經(jīng)1.34 mg·L-1DO長期暴露(30 d)后，其產(chǎn)卵時間比對照組延遲4 d，每日產(chǎn)卵量顯著下降[34]。鯉魚成魚暴露于1.0 mg·L-1DO 12周后，成魚的產(chǎn)卵量、精子活力、受精率、孵化率和仔魚成活率都顯著下降[26]。呆鰷魚(Pimephales promelas)經(jīng)3.5 ～ 5.5 mg·L-1DO暴露21 d后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)DO低于4.5 mg·L-1時就可以顯著降低呆鰷魚的產(chǎn)卵量[36]。本研究低氧對青鳉繁殖能力的影響與前人研究基本一致，但最大的區(qū)別在于本研究低氧暴露僅發(fā)生在早期階段，而上述研究均是長期暴露，且低氧程度要嚴重于本研究。其原因一方面與低氧導(dǎo)致青鳉后期的生長率和存活率下降有關(guān)，另外一個重要因素可能與性別比發(fā)生明顯變化有關(guān)。如同3.3所述，內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂導(dǎo)致性別比發(fā)生了改變，從可能引起繁殖能力和精子與卵子的質(zhì)量下降。在脊椎動物中，類固醇生成是受需氧酶來精心調(diào)控的，當(dāng)斑馬魚性發(fā)育期，長期(40 d)低氧(0.8 mg·L-1)暴露抑制了類固醇合成相關(guān)酶的表達，影響了性腺中類固醇合成酶的活性，從而導(dǎo)致性腺功能異常[35]。TCDD對斑馬魚的早期暴露可影響其后期的繁殖能力和性別比，原因與雌激素合成途徑中的酶被下調(diào)，降低了睪酮和精子濃度，導(dǎo)致產(chǎn)卵量和受精率下降[38]。盡管目前針對低氧早期暴露的這一影響機制還不清楚，但TCDD的研究結(jié)果為我們?nèi)蘸筮M一步工作提供了參考。

3.5 3種低氧暴露方式的影響

多項研究已表明，長期連續(xù)低氧可改變魚類胚胎正常發(fā)育、減緩生長速率、延遲孵化、改變性別比和降低繁殖能力等。我們的結(jié)果顯示，早期胚胎發(fā)育階段的連續(xù)低氧暴露(H1)、晝夜低氧暴露(H2)和器官形成發(fā)育期低氧暴露(H3)等3種方式都可影響青鳉的胚胎正常發(fā)育，從胚胎的畸形率和個體長度看，H1方式最為嚴重，其次為H2和H3。從青鳉后期生長和性別比改變程度看，同樣存在H1>H2> H3的順序，但對繁殖能力的影響看，3種基本一致。這些結(jié)果表明：1)從短期效應(yīng)看，低氧對胚胎發(fā)育影響的程度與暴露時間的長短有關(guān)，暴露時間越長，影響越嚴重；2)從長期效應(yīng)看，3種暴露方式都可對后期繁殖產(chǎn)生不利影響，且影響程度與暴露時間長短不太一致，與低氧發(fā)生的時期可能更相關(guān)；3)晝夜式低氧與長期連續(xù)式低氧所產(chǎn)生的長期效應(yīng)相似。Cheek[39]通過模擬實驗研究晝夜低氧對底鳉的影響時發(fā)現(xiàn)，連續(xù)低氧可降低底鳉雄魚體內(nèi)雄性激素受體和雌魚體內(nèi)E2的濃度，其程度要強于晝夜低氧，但對性腺大小的影響2種低氧方式卻非常相似，其原因可能與晝夜低氧所產(chǎn)生的影響具有累積效應(yīng)有關(guān)。因此，實際環(huán)境水體中的間歇式、波動式和晝夜式的低氧事件可能與長期連續(xù)低氧具有相似的生態(tài)影響，其潛在的生態(tài)意義值得關(guān)注。

本研究結(jié)果證實了早期中度低氧暴露可影響魚類后期生長和繁殖的假設(shè)，盡管目前數(shù)據(jù)不能解釋這一機制，但至少我們可以了解這一事件的生態(tài)后果。此外，本研究模擬了實際環(huán)境中的低氧情景，并發(fā)現(xiàn)晝夜低氧和連續(xù)低氧所造成的生殖損害具有相似性，這對科學(xué)評估環(huán)境中多樣式的低氧事件所潛在的生態(tài)危害具有重要參考價值。

致謝：感謝幾位審稿人提出的建設(shè)性修改意見，感謝國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心叢藝博士在英文摘要修改中的幫助。

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Early-life Exposure to Hypoxia Altered Growth, Sex Ratio, and Reproduction in Medaka (Oryzias latipes)

Mu Jingli#, Jin Fei, Zhao Huade, Zheng Nan, Zang Kunpeng, Wang Juying*

Key Laboratory for Ecological Environment in Coastal Areas (State Oceanic Administration, SOA), National Marine Environmental Monitoring Center, Dalian 116023, China

8 May 2016 accepted 26 May 2016

Hypoxia is amongst the most pressing global problem in aquatic system. Seasonal hypoxia, temporary hypoxia, and diel cycling hypoxia are the commonly occurring hypoxia in different water bodies. The long-term hypoxia can affect fish normal growth and reproduction, but few studies have been conducted to evaluate how early-life exposure to different types of moderate hypoxia impacts later life growth and reproduction in fish. In this study, three hypoxia (2.8 mg·L-1dissolved oxygen, DO) scenarios including long-term and continuous hypoxia (H1), diel cycling hypoxia (H2), and temporary hypoxia (H3) were designed under laboratory condition to investigate the effects of hypoxia on embryonic development of medaka (Oryzias latipes), and to further evaluate effects of early-life exposure on adult fish growth, survival, and reproduction. The present study found that the three hypoxia exposure can cause abnormal development in swimming bladder inflation and yolk sac absorption of embryos. After hypoxia exposure for 120 dph, H1 early-life exposure increased the skeletal and swimming malformation, decreased the survival and growth rate in adult fish. Furthermore, the three hypoxia exposure scenarios all led to changes in sex ratios and produced a significantly higher male to female ratio in adult fish. Meanwhile, the reductions in egg release and fertilization success were observed in medaka F0 generation following early-life hypoxia exposure. Our present observations suggest that hypoxia exposure during embryonic development can result in adverse growth and reproductionin fish, thereby threaten the offspring recruitment and the sustainability of the natural population of fish. As a long-term response to hypoxia, the potentially ecological consequences caused from diel cycling hypoxia and temporary hypoxia should be paid more attention.

hypoxia; medaka; early-life exposure; reproductive toxicity; sex differentiation; offspring outcomes

國家自然科學(xué)基金(41476096；41106089)；國家海洋局專項: 全球變化與海氣相互作用

穆景利(1979-)，博士，副研究員，研究方向為污染物與環(huán)境因子相互作用的生態(tài)效應(yīng)、海洋生態(tài)毒理學(xué)和海洋環(huán)境質(zhì)量基準(zhǔn)，E-mail: jlmu@nmemc.org.cn

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: jywang@nmemc.org.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20160508002

2016-05-08 錄用日期：2016-05-26

1673-5897(2017)2-137-10

X171.5

A

王菊英(1967-)，女，博士，研究員，研究方向為海洋環(huán)境化學(xué)，重點關(guān)注海洋環(huán)境中污染物的環(huán)境效應(yīng)及環(huán)境質(zhì)量基準(zhǔn)、海洋環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測與評價方法學(xué)研究。

# 共同通訊作者(Co-corresponding author)， E-mail: jlmu@nmemc.org.cn

穆景利, 靳非, 趙化德, 等. 水體低氧的早期暴露對青鳉(Oryzias latipes)后期的生長、性別比和繁殖能力的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2017, 12(2): 137-146

Mu J L, Jin F, Zhao H D, et al. Early-life exposure to hypoxia altered growth, sex ratio, and reproduction in medaka (Oryzias latipes) [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(2): 137-146 (in Chinese)