重金屬Cr(VI)、Pb及Cu脅迫對(duì)雙齒圍沙蠶體腔細(xì)胞的DNA損傷

張來軍,陳永敢,杭瑜瑜

海南熱帶海洋學(xué)院生命科學(xué)與生態(tài)學(xué)院，三亞 572022

重金屬Cr(VI)、Pb及Cu脅迫對(duì)雙齒圍沙蠶體腔細(xì)胞的DNA損傷

張來軍*,陳永敢,杭瑜瑜

海南熱帶海洋學(xué)院生命科學(xué)與生態(tài)學(xué)院，三亞 572022

為探討重金屬Cr(VI)、Pb以及Cu對(duì)沙蠶體腔細(xì)胞DNA的毒性效應(yīng)，以雙齒圍沙蠶為受試動(dòng)物，重金屬按不同劑量水平，Cr(VI)：10、100和200 mg·L-1，Pb：5、50和100 mg·L-1，Cu：1、10和20 mg·L-1，分別脅迫沙蠶24 h，以不加任何重金屬離子的海水為對(duì)照，采用單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)，檢測(cè)其體腔細(xì)胞DNA損傷程度。結(jié)果表明，與空白對(duì)照組相比，3種重金屬離子的各濃度組都能引起沙蠶體腔細(xì)胞DNA損傷，且3種重金屬脅迫濃度與細(xì)胞DNA損傷程度之間存在顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。雙齒圍沙蠶可以作為單細(xì)胞凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)材料用于重金屬所致環(huán)境污染的生物監(jiān)測(cè)指示生物。

重金屬；雙齒圍沙蠶；遺傳毒性；DNA損傷；體腔細(xì)胞；彗星實(shí)驗(yàn)

重金屬污染，是指由重金屬或其化合物造成的環(huán)境污染。隨著我國沿海經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展和城市化進(jìn)程的加劇，大量含重金屬等有毒物質(zhì)的廢水排放，使河口生態(tài)環(huán)境遭到嚴(yán)重破壞。重金屬污染物不易降解，能迅速由水相轉(zhuǎn)入固相(懸浮物和沉積物)，進(jìn)入沉積物中蓄積，使沉積物成為重金屬等化學(xué)物質(zhì)的主要存儲(chǔ)庫。這些污染物或因環(huán)境變化再釋放到水體中，對(duì)水體造成“二次污染”[1]。海洋生物通過攝食、呼吸或其體表與水體的滲透交換作用，使水體中重金屬進(jìn)入其體內(nèi)，導(dǎo)致其功能蛋白質(zhì)、DNA等結(jié)構(gòu)受到破壞和失活，使代謝、遺傳等功能遭到破壞。為了能準(zhǔn)確、及時(shí)、全面地反映海洋環(huán)境質(zhì)量現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢(shì)，需要隨時(shí)進(jìn)行環(huán)境檢測(cè)，傳統(tǒng)的環(huán)境檢測(cè)方法，物理監(jiān)測(cè)和化學(xué)監(jiān)測(cè)，能對(duì)環(huán)境中的化學(xué)物質(zhì)精確定量，卻不能反映其對(duì)生物體的效應(yīng)。因此近年來，生物監(jiān)測(cè)的應(yīng)用越來越廣泛，逐漸成為環(huán)境監(jiān)測(cè)的重要組成部分。

單細(xì)胞凝膠電泳(single cell gel eletrophoresis, SCGE)，或彗星電泳(comet assay)，是用于各種動(dòng)物細(xì)胞DNA損傷檢測(cè)的一種較為成熟的技術(shù)，具有簡便、快速、靈敏等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于毒理學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境生物監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。環(huán)境污染中的生物、物理、化學(xué)因素都能導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷，引起基因突變和細(xì)胞癌變。所以判斷細(xì)胞DNA是否出現(xiàn)損傷情況在環(huán)境監(jiān)測(cè)方面尤為重要。SCGE能夠檢測(cè)不同生物不同細(xì)胞的不同類型的遺傳毒理損傷情況。有研究表明，SCGE與其他常用的遺傳生態(tài)毒理學(xué)生物標(biāo)志物相比，在對(duì)水生生物遺傳毒理檢測(cè)中更具敏感性[2]。目前SCGE已被廣泛用于魚和貽貝細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)中[3-5]。

沙蠶，又名海蟲，海蛆，屬環(huán)節(jié)動(dòng)物門多毛綱動(dòng)物。棲息于水-陸交錯(cuò)帶特別是沉積物中，在海洋生態(tài)系統(tǒng)食物鏈物質(zhì)傳遞中擔(dān)負(fù)著重要功能，是最易受到環(huán)境有毒有害物質(zhì)傷害的生物之一。國內(nèi)外已有一些研究報(bào)道在環(huán)境污染物作用下，沙蠶體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)變化，也有用其乙酰膽堿酯酶活性評(píng)價(jià)污染物的毒性效應(yīng)[6-9]，但以沙蠶為材料應(yīng)用SCGE研究DNA損傷指數(shù)并用來評(píng)價(jià)環(huán)境污染情況的報(bào)道并不多見[10]。本文采用SCGE技術(shù),以雙齒圍沙蠶(Perinereis aibuhitensis)為試驗(yàn)動(dòng)物，研究重金屬脅迫對(duì)沙蠶體腔細(xì)胞DNA損傷的影響,探討SCGE技術(shù)在沙蠶中的應(yīng)用，旨在找出除貽貝、牡蠣等軟體動(dòng)物和少數(shù)魚類之外適宜于海洋環(huán)境污染生物監(jiān)測(cè)的指示動(dòng)物,也進(jìn)一步闡明Cr(VI)、Cu與Pb的毒理學(xué)作用機(jī)制,為海洋水環(huán)境污染評(píng)價(jià)等提供更多的參考。

1 材料與方法 (Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用雙齒圍沙蠶購買于三亞五洲漁具店，將購買的沙蠶放入培養(yǎng)皿中，清洗體表，進(jìn)行初步篩選，選擇大小相似的個(gè)體，放入塑料箱中，加入滅菌的海沙和天然海水暫養(yǎng)3 d。暫養(yǎng)期間，每天更換一次海水，水溫為25 ℃，鹽度為31～32，pH值為8.5，3 d后再用于重金屬脅迫實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重金屬鹽溶液的配制和沙蠶暴露實(shí)驗(yàn)

參考國家漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)GB11607—89，鉻、鉛和銅3種離子濃度分別小于等于0.1、0.05和0.01 mg·L-1，3種重金屬鹽選用重鉻酸鉀(K2Cr2O7)、醋酸鉛(C4H6O4Pb·3H2O)、硫酸銅(CuSO4·5H2O),以滅菌海水配制成低、中和高3個(gè)濃度組，濃度分別為標(biāo)準(zhǔn)濃度的100倍、1 000倍和2 000倍，脅迫濃度則分別為Cr(VI)：10、100和200 mg·L-1，Pb：5、50和100 mg·L-1，Cu：1、10和20 mg·L-1溶液。

選擇體表健康無傷痕的沙蠶，稱重，分為4組，平均體質(zhì)量為(3.29±0.46) g，將沙蠶1只/瓶置于150 mL三角瓶中。瓶內(nèi)加入5 mL不同濃度梯度Cr(VI)的海水，室溫25 ℃下進(jìn)行暴露實(shí)驗(yàn)，每24 h更換相同Cr(VI)濃度的海水，并清理排出的廢物，同一濃度梯度脅迫沙蠶5只?？瞻讓?duì)照組不加任何重金屬離子。同樣方法處理Pb、Cu脅迫沙蠶，24 h后用于彗星電泳。

1.2.2 體腔細(xì)胞的提取

根據(jù)Eyambe等的方法[11]提取體腔細(xì)胞，稍有改動(dòng)。脅迫結(jié)束后，將不同濃度組的沙蠶每組隨機(jī)選取2條，剪取其身體中后部約1 cm長的軀干，移入2 mL離心管中，加入4 ℃體腔細(xì)胞提取液(簡稱EM，無水乙醇與生理鹽水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7%)的體積比為5∶95，2.5 mg·mL-1Na2EDTA，10 mg·mL-1愈瘡木酚甘油醚，pH 7.3)400 μL，1 min后。再加入4 ℃磷酸緩沖液(簡稱PBS，組成為NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO41.44 g，KH2PO40.24 g，定容至1 000 mL，pH 7.4)1.5 mL，棄沙蠶，得到體腔細(xì)胞。800～1 000 r·min-1，離心3 min，棄上清，兩管合為一管，重新加入1 mL PBS。顯微鏡下觀察細(xì)胞活力，調(diào)整細(xì)胞密度，準(zhǔn)備電泳。

1.3 SCGE檢測(cè)

按Zhang等[12]的方法并加以改良進(jìn)行彗星電泳。將潔凈的載玻片在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%的常熔點(diǎn)瓊脂糖中浸沒后取出，置37 ℃烘箱烘干，以備電泳。將細(xì)胞懸液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的低熔點(diǎn)膠按1∶1體積混合均勻，鋪在預(yù)處理后的載玻片上，4 ℃放置5 min，使瓊脂糖完全固化。將鋪好膠的載玻片放入新鮮配制的裂解液(2.5 mol·L-1NaCl、0.1 mol·L-1Na2EDTA、0.01 mol·L-1Tris-HCl、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的肌氨酸鈉，pH 10，體積分?jǐn)?shù)為1%的Triton X-100，體積分?jǐn)?shù)為10%的二甲基亞砜(DMSO))中，裂解90 min。蒸餾水沖洗后，將載玻片放入電泳緩沖液(0.3 mol·L-1NaOH、1 mmol·L-1Na2EDTA，pH>13)中，變性解旋20 min，電泳20 min (26 V、300 mA)。用400 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)中和3次，每次5 min，從裂解到中和的所有過程需在4 ℃下進(jìn)行。將載玻片置于溴化乙錠(20 μg·mL-1)中染色20 min后，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)處理隨機(jī)取約50個(gè)細(xì)胞，用CASP軟件進(jìn)行分析，可得到尾部DNA含量(TDNA%)、尾矩(Tail Moment, TM)和Olive尾矩(Olive Tail Moment, OTM)等諸多參數(shù)。本實(shí)驗(yàn)選用TDNA%作為衡量細(xì)胞DNA損傷程度的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

用SPSS13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，分析比較各濃度組之間及其與對(duì)照組之間TDNA%差異的顯著性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果(Results)

2.1 沙蠶的體腔細(xì)胞

將細(xì)胞均勻分散在PBS中，經(jīng)吹打、稀釋后，在顯微鏡下直接觀察(×200)，見(圖1)，可以看到沙蠶體腔細(xì)胞呈均勻的圓形，數(shù)量多，純度高，雜質(zhì)少。再將細(xì)胞用甲醇固定，瑞氏染液染色后(圖2)，發(fā)現(xiàn)黃細(xì)胞數(shù)量最多，其細(xì)胞個(gè)體大，但細(xì)胞核較小，這類細(xì)胞構(gòu)成沙蠶細(xì)胞免疫的重要組成部分。少量嗜中性細(xì)胞，有較大核質(zhì)比(圖中未顯示)，以及個(gè)體較小但數(shù)量多的嗜堿性細(xì)胞。

圖1 雙齒圍沙蠶的體腔細(xì)胞(×200)Fig. 1 The coelomocytes of Perinereis aibuhitensis (×200)

圖2 雙齒圍沙蠶體腔細(xì)胞中的組織黃細(xì)胞(×200)Fig. 2 The chlorogogen cells of Perinereis aibuhitensis coelomocytes (×200)

2.2 重金屬對(duì)沙蠶體腔細(xì)胞彗星電泳TDNA%的影響

圖3為不同濃度Cu脅迫沙蠶24 h后，幾種典型的體腔細(xì)胞彗星電泳圖像。

圖3 暴露于不同濃度Cu 24 h后沙蠶體腔細(xì)胞的彗星電泳圖(×400)注：A—對(duì)照組；B—1 mg·L-1組；C—10 mg·L-1組；D—20 mg·L-1組。Fig. 3 Comet assay of Perinereis aibuhitensis coelomocytes after 24 h-exposure to different concentrations of Cu (×400)Note: A-control; B-1 mg·L-1; C-10 mg·L-1; D-20 mg·L-1.

用CASP軟件分析各個(gè)處理組拍攝的彗星圖像，所得到的TDNA%與3種重金屬及其濃度之間的關(guān)系如圖4、圖5、圖6所示。3種濃度梯度Cr(VI)離子脅迫后得到的TDNA%值均大于對(duì)照組值，但是僅濃度為200 mg·L-1的高濃度組與對(duì)照組比較達(dá)到顯著性水平(P<0.05)(圖4)，且高濃度組相比10、100 mg·L-1低、中濃度組也有顯著差異。Pb各處理組TDNA%值均顯著大于對(duì)照組(P<0.05)，且100 mg·L-1高濃度組TDNA%相比對(duì)照組差異顯著(P<0.01)，與5、50 mg·L-1低、中濃度組相比也有顯著差異(P<0.05)(圖5)。3種濃度Cu脅迫所得到的TDNA%顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，10 mg·L-1和20 mg·L-1的中濃度組和高濃度組的TDNA%相比對(duì)照組差異顯著性水平更高(P<0.01)，相比1 mg·L-1的低濃度組也具有顯著差異(P<0.05)(圖6)。Cr(VI)、Pb、Cu這3種重金屬離子脅迫沙蠶，經(jīng)彗星電泳后所得到的TDNA%值隨脅迫濃度的升高而升高，脅迫濃度與TDNA%之間存在著明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

圖4 Cr(VI)對(duì)雙齒圍沙蠶體腔細(xì)胞彗尾DNA百分含量的影響注：與對(duì)照組比，*差異顯著，0.01

圖5 Pb對(duì)雙齒圍沙蠶體腔細(xì)胞彗尾DNA百分含量的影響注：與對(duì)照組比，*差異顯著，0.01

上述結(jié)果表明，重金屬Cr(VI)、Pb、Cu污染下，沙蠶體腔細(xì)胞DNA出現(xiàn)了損傷。損傷的程度與重金屬的濃度呈正相關(guān)。

圖6 Cu對(duì)雙齒圍沙蠶體腔細(xì)胞彗尾DNA百分含量的影響注：與對(duì)照組比，*差異顯著，0.01

3 討論(Discussion)

本文采用的實(shí)驗(yàn)材料雙齒圍沙蠶，廣泛分布于我國沿海潮間帶和河口區(qū)，是最大高潮線附近底棲生物中的優(yōu)勢(shì)種[13]。適宜養(yǎng)殖，在實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)容易，飼養(yǎng)的條件及設(shè)備都極為簡單。其體腔中充滿體腔液，體腔液中的細(xì)胞均不同程度地與免疫過程有關(guān)，或其代謝作用和分泌作用與體液免疫相關(guān)[14]，體腔中的黃細(xì)胞吸收血液中的代謝廢物后，溶解或整個(gè)細(xì)胞脫離細(xì)胞群，落入體腔液中，經(jīng)由腎管排出體外。沙蠶體腔細(xì)胞的提取方法操作簡單，得到的細(xì)胞數(shù)量多，存活率高，能夠滿足SCGE實(shí)驗(yàn)的需要。這為以沙蠶為材料應(yīng)用SCGE技術(shù)進(jìn)行海洋環(huán)境污染生物監(jiān)測(cè)創(chuàng)造了理想條件。

選擇3種重金屬離子Cr(VI)、Pb、Cu作用于沙蠶，提取其體腔細(xì)胞，利用SCGE檢測(cè)重金屬對(duì)雙齒圍沙蠶的遺傳毒性。在一定的濃度范圍內(nèi)，隨3種離子脅迫濃度的提高，TDNA%值均分別隨之增加，即離子的濃度與沙蠶體腔細(xì)胞DNA的損傷程度之間存在著明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。SCGE技術(shù)靈敏地檢測(cè)出了重金屬對(duì)沙蠶體腔細(xì)胞的損傷程度，也在一定程度上反映出水體或沉積物中重金屬的污染情況。由此揭示了沙蠶對(duì)重金屬所致的毒性效應(yīng)極為敏感，可以將沙蠶應(yīng)用于SCGE技術(shù)，對(duì)重金屬污染物進(jìn)行遺傳毒理分析。

重金屬是近岸海域最主要的污染物之一，由于其在環(huán)境中不易代謝、分解、轉(zhuǎn)變，且易于沉降，所以沉積物被認(rèn)為是海洋環(huán)境中重金屬最終的蓄積地。唐博等[1]對(duì)珠江口和北部灣2個(gè)海域海底沉積物的Zn、Pb、Cu、Cr這4種重金屬元素污染程度和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，Cu在2個(gè)區(qū)域均達(dá)嚴(yán)重污染程度，Zn、Pb、Cr在珠江口沿岸均達(dá)到中等污染程度，在北部灣的部分區(qū)域達(dá)到中等污染程度。目前常采用底棲生活的貝類和游泳生物中的魚類做為監(jiān)測(cè)生物進(jìn)行海洋生物監(jiān)測(cè)。將這2類海洋生物與SCGE技術(shù)結(jié)合對(duì)海洋環(huán)境中的各種污染物，如有機(jī)物[4-5,15]、重金屬[16-17]和農(nóng)藥[18-20]等進(jìn)行遺傳毒理學(xué)研究已有大量報(bào)道。Nagarani等[21]以氯化汞脅迫Therapon jarbua，利用SCGE技術(shù)檢測(cè)了腮、腎及血細(xì)胞的DNA損傷，揭示了同種生物不同細(xì)胞類型對(duì)重金屬脅迫的敏感性不同。Al-Subiai等[22]以Mytilus edulis L.為材料，以不同濃度的銅脅迫，用SCGE評(píng)價(jià)其遺傳損傷的同時(shí)，結(jié)合組織病理學(xué)檢查，用多種生物標(biāo)志物的方法綜合評(píng)價(jià)重金屬銅對(duì)這種生物的影響，認(rèn)為這種綜合評(píng)估方法適宜于評(píng)估污染物的短期及長期毒性效應(yīng)。將沙蠶作為SCGE實(shí)驗(yàn)材料的報(bào)道相對(duì)較少，Lewis和Galloway[10]用甲磺酸甲酯(MMS)脅迫3種沙蠶Arenicola marina, Nereis diversicolor和Nereis virens，用SCGE檢測(cè)不同種及不同的細(xì)胞類型對(duì)污染物的敏感性差異，后來又用納米二氧化鈦脅迫沙蠶，并認(rèn)為高濃度的納米二氧化鈦引起了體腔細(xì)胞及其DNA的損傷[23]。Catalano等[24]用PAHs脅迫一種沙蠶Hediste diversicolor，檢測(cè)了過氧化氫酶、谷胱甘肽還原酶，并進(jìn)行了SCGE和微核實(shí)驗(yàn)等，認(rèn)為這種沙蠶是理想的有機(jī)污染的生物指示物。我國沙蠶常被用做抗氧化防御系統(tǒng)、乙酰膽堿酯酶等檢測(cè)的研究材料，用其DNA損傷參數(shù)評(píng)價(jià)環(huán)境毒物遺傳毒性的報(bào)道極少。隨著海洋環(huán)境污染監(jiān)測(cè)越來越受到重視，雙齒圍沙蠶在近岸海域污染的生物監(jiān)測(cè)和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中將會(huì)發(fā)揮重要的作用。

致謝：感謝海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心的大力支持。

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DNA Damage of Coelomocyte inPerinereisaibuhitensisInduced by Chromium(VI), Lead and Copper

Zhang Laijun*, Chen Yonggan, Hang Yuyu

College of Life Sciences and Ecology, Tropical Ocean College of Hainan, Sanya 572022, China

8 April 2016 accepted 5 September 2016

To investigate the toxic effect of heavy metal on marine organisms, Perinereis aibuhitensis were exposed to heavy metal Cr(VI), Pb and Cu at three different concentrations, Cr(VI): 10, 100 and 200 mg·L-1, Pb: 5, 50 and 100 mg·L-1, Cu: 1, 10 and 20 mg·L-1for 24 h. The DNA damage of coelomocyte cells in Perinereis aibuhitensis was detected by single cell gel electrophoresis (comet assay). The result showed that every concentration group of three kinds of heavy metals can cause the DNA damage, compared with the blank group. There was a significant relationship between the concentration of heavy metal and the degree of DNA damage in cells. Perinereis aibuhitensis can be used as experimental material for single cell gel electrophoresis experiments, and then it can be used as indicator for monitoring marine environmental pollution caused by heavy metals using the comet assay method.

heavy metal; Perinereis aibuhitensis; genotoxicity; DNA damage; coelomocyte; single cell gel electrophoresis

國家自然科學(xué)基金(31260139)；海南省自然科學(xué)基金(313050)

張來軍(1968-), 女, 博士, 研究方向?yàn)榧?xì)胞生物學(xué), E-mail: ldxyzhlj@126.com

10.7524/AJE.1673-5897.20160408002

2016-04-08 錄用日期：2016-09-05

1673-5897(2017)2-216-06

X171.5

A

張來軍(1968—)，女，副教授，主要從事細(xì)胞生物學(xué)教學(xué)及遺傳毒理學(xué)研究，發(fā)表學(xué)術(shù)論文20余篇。

張來軍, 陳永敢, 杭瑜瑜. 重金屬Cr(VI)、Pb及Cu脅迫對(duì)雙齒圍沙蠶體腔細(xì)胞的DNA損傷[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2017, 12(2): 216-221

Zhang L J, Chen Y G, Hang Y Y. DNA damage of coelomocyte in Perinereis aibuhitensis induced by chromium(VI), lead and copper [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(2): 216-221 (in Chinese)