苧麻脫膠果膠復(fù)合酶的優(yōu)選及其效果分析

成莉鳳， 劉正初， 馮湘沅， 汪啟明， 李 琦，3，鄭 科， 楊 琦， 段盛文

苧麻脫膠果膠復(fù)合酶的優(yōu)選及其效果分析

成莉鳳1， 劉正初1， 馮湘沅1， 汪啟明2， 李 琦1，3，鄭 科1， 楊 琦1， 段盛文1

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 麻類研究所， 湖南 長(zhǎng)沙 410205； 2. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128； 3. 湖南利爾康生物股份有限公司， 湖南 岳陽 414100)

為研發(fā)高效苧麻脫膠酶制劑，對(duì)篩選并保藏的苧麻脫膠高效菌種進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵，測(cè)定胞外酶的果膠酶活力、甘露聚糖酶活力和蛋白質(zhì)含量等特征參數(shù)。通過苧麻酶法脫膠，從纖維表觀形態(tài)學(xué)、質(zhì)量損失率、殘膠率等方面綜合分析苧麻脫膠效果。結(jié)果表明：第N組和第G組的果膠酶活力較優(yōu)，分別為61.79、13.69 IU/mL，比酶活力分別為4.47、0.93 IU/mg；第N組和第G組的纖維素酶活力僅為0.01、0.02 IU/mL；第N組和第G組苧麻質(zhì)量損失率分別為20.30%和18.69%，殘膠率分別為2.52%和4.21%，均接近實(shí)際工業(yè)化應(yīng)用水平；第N組的單纖維線密度為5.31 dtex，束纖維斷裂強(qiáng)度為4.8 cN/dtex，屬于優(yōu)質(zhì)脫膠苧麻纖維。

苧麻； 脫膠； 果膠酶； 半纖維素； 纖維形態(tài)

苧麻纖維是世界上重要的天然纖維來源之一[1]。農(nóng)產(chǎn)品苧麻除含有大量纖維素纖維外，還包含有4%～8%果膠、12%～18%半纖維素、0.8%～1.5%木質(zhì)素等膠質(zhì)成分[2]。無論利用苧麻開發(fā)何種紡織產(chǎn)品，都必須經(jīng)過“脫膠”這道關(guān)鍵工序，除去非纖維素物質(zhì)。傳統(tǒng)的漚麻存在生產(chǎn)環(huán)境惡劣，勞動(dòng)強(qiáng)度大，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等明顯不足[3]?；瘜W(xué)脫膠存在成本高，纖維品質(zhì)易受損傷和環(huán)境污染嚴(yán)重等突出問題，制約了麻類加工業(yè)的發(fā)展[4]。生物脫膠可克服上述缺點(diǎn)，具有高效、節(jié)能、降耗、減排等優(yōu)點(diǎn)，是苧麻加工行業(yè)的發(fā)展方向[5]。

NY/T 1537—2007《苧麻生物脫膠技術(shù)規(guī)范》指出，苧麻膠質(zhì)復(fù)合體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其生物降解需果膠酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶等非纖維素降解酶在內(nèi)的關(guān)鍵復(fù)合酶系協(xié)同作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，脫膠前期果膠酶對(duì)苧麻膠質(zhì)的降解效率遠(yuǎn)高于木聚糖酶，并證實(shí)果膠酶降解苧麻原麻起“黏合”作用的果膠質(zhì)，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散，促進(jìn)半纖維素酶類和其他脫膠因子的有效滲透，從而提高脫膠復(fù)合酶體系的降解效率[6]。因此，果膠酶作為苧麻生物脫膠的“引發(fā)酶”被認(rèn)為是最關(guān)鍵的因子，通常將果膠酶活力高低作為脫膠酶制劑優(yōu)劣的一個(gè)重要指標(biāo)[7]。本文擬采用苧麻脫膠高效菌種分泌的胞外果膠復(fù)合酶進(jìn)行苧麻酶法脫膠，以期獲得脫膠效果優(yōu)良的果膠復(fù)合酶，為脫膠酶制劑制備提供科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌 種：8種苧麻脫膠菌種(組號(hào)分別為11、21、32、12、22、31、G和N)，均為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工微生物菌種保藏庫保存。

苧麻原料：苧麻原麻(中苧1號(hào))由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所苧麻育種研究室提供。

培養(yǎng)基：肉湯改良培養(yǎng)基，1%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.5%牛肉膏和0.5% NaCl。發(fā)酵培養(yǎng)基：1.5%蛋白胨、0.2%酵母膏、0.3%牛肉膏、0.4% NaCl、0.05% MgSO4和0.05% KH2PO4。果膠選擇培養(yǎng)基：0.5%橘子果膠、0.5%酵母提取物、1%胰蛋白胨、1% NaCl和2%瓊脂粉。

主要試劑：魔芋膠，成都路特生物公司；樺木木聚糖、羧甲基纖維素鈉鹽(CMC·Na)、橘子果膠和聚半乳糖醛酸鈉(PGA·Na)，美國(guó)Sigma公司；其他常規(guī)試劑，國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 主要儀器設(shè)備

Vivaflow小型超濾裝置，德國(guó)Sartorius公司；SH-5000M電子顯微鏡，日本Hirox公司；酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Scientific公司；高壓滅菌鍋，中國(guó)致微儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 果膠復(fù)合酶液的制備

從菌種庫保藏的斜面挑取一環(huán)菌種接種至試管液(5 mL肉湯改良培養(yǎng)基)，充分混勻，在生化培養(yǎng)箱35 ℃培養(yǎng)5～6 h。稀釋涂果膠選擇培養(yǎng)基平板，35 ℃倒置培養(yǎng)18～20 h，獲得單菌落。挑選透明圈大的菌落接種于試管液，35 ℃，180 r/min培養(yǎng)6～7 h。按2%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，35 ℃，180 r/min培養(yǎng)9～10 h，獲得成熟發(fā)酵液。取成熟發(fā)酵液，用孔徑為0.2 μm的膜包進(jìn)行超濾，濾過液即為果膠復(fù)合酶原液。

1.3.2 果膠酶活力的測(cè)定

參照Roy方法進(jìn)行[8]。用pH值為9.0，濃度為 0.05 mol/L 的Gly-NaOH緩沖液配制5 g/L PGA·Na溶液。取1 mL適當(dāng)稀釋倍數(shù)的酶液加入到2 mL預(yù)熱的底物中，再添加6 μL 1 mol/L CaCl2溶液，立即混勻，45 ℃條件下準(zhǔn)確反應(yīng)20 min后，終止酶活。用充分滅活的酶液，作相同反應(yīng)處理的溶液作對(duì)照，在235 nm波長(zhǎng)下測(cè)定光吸收值(OD)。果膠酶活力定義為：底物每分鐘釋放出相當(dāng)于1 μmol不飽和半乳糖醛酸酐所需的酶量為1個(gè)酶活力單位(以IU表示)，235 nm波長(zhǎng)下消光系數(shù)為4 600。

1.3.3 半纖維素酶活力的測(cè)定

采用DNS法測(cè)定木聚糖酶活力和甘露聚糖酶活力[9]。

1.3.4 纖維素酶活力的測(cè)定

以CMC·Na為底物，用DNS法測(cè)定纖維素酶活力[10]。

1.3.5 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[11]。

1.3.6 苧麻酶法脫膠工藝

準(zhǔn)確稱取無殼苧麻20 g于500 mL搖瓶。將復(fù)合果膠酶原液與自來水按1∶1 000稀釋，添加終濃度為1 mmol/L的CaCl2，調(diào)節(jié)溫度至45 ℃。取200 mL稀釋的果膠復(fù)合酶液浸泡苧麻，即苧麻與果膠復(fù)合酶稀釋液的浴比為1∶10。45 ℃條件下，90 r/min振蕩反應(yīng)4 h后，105 ℃滅活20 min終止脫膠。1.3.7 酶法脫膠綜合指標(biāo)的測(cè)定

纖維形態(tài)學(xué)觀察：取苧麻原麻和酶法脫膠后的苧麻纖維，噴金處理后，用掃描電子顯微鏡觀察其纖維縱截面的表面形貌。

還原糖含量測(cè)定：采用DNS法測(cè)定還原糖的光吸收值OD540，用葡萄糖做標(biāo)準(zhǔn)曲線，換算還原糖含量。

質(zhì)量損失率測(cè)定：設(shè)原料麻的質(zhì)量為Gm，發(fā)酵麻的質(zhì)量為Gf，質(zhì)量損失率(w)的計(jì)算公式[12]為

殘膠率測(cè)定：參照GB 5889—1986《苧麻化學(xué)成分定量分析方法》進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 果膠復(fù)合酶中關(guān)鍵酶活力分析

2.1.1 果膠酶活力分析

表1示出各復(fù)合酶原液中中果膠酶活力。由表可看出：第N組的果膠酶活力最高達(dá)61.79 IU/mL，比酶活力為4.47 IU/mg；第G組的果膠酶活力為13.69 IU/mL，比酶活力為0.93 IU/mg，因此，第N組和第G組的果膠酶具有明顯優(yōu)勢(shì)。

表1 各復(fù)合酶原液中的果膠酶活力比較

2.1.2 半纖維素酶和纖維素酶活力分析

表2示出各復(fù)合酶液原液中的半纖維素酶活力和纖維素酶活力。由表可看出：第N組的甘露聚糖酶活力和木聚糖酶活力具有明顯優(yōu)勢(shì)，并且其纖維素酶活力僅為0.01 IU/mL。

2.2 酶法脫膠綜合指標(biāo)分析

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征

表3示出酶法脫膠后的苧麻外觀形態(tài)定性分析。由表可看出：第N組果膠復(fù)合酶處理后的苧麻纖維無論在柔軟程度、纖維分散程度還是纖維潔白度上都顯示出最佳效果，預(yù)示著其為苧麻脫膠最佳酶組。

表2 半纖維素酶和纖維素酶活力比較

表3 酶法脫膠后的苧麻外觀形態(tài)

注：“+”越多，表明苧麻纖維越柔軟、越分散、越潔白，脫膠效果越好。

圖1示出第N組酶法脫膠前后的苧麻纖維表面形貌。由圖可看出：與苧麻原麻相比，脫膠后的苧麻纖維分散，且表面光滑。

圖1 脫膠前后苧麻纖維的SEM照片F(xiàn)ig.1 Pre-degummed and bio-degummed ramie photoes taken by electron microscope. (a) Ramie material; (b) Ramie fiber bio-degummed

2.2.2 還原糖含量分析

圖2示出發(fā)酵液的還原糖含量變化規(guī)律。由圖可看出：第N組果膠復(fù)合酶處理后的苧麻脫膠液中還原糖含量最高為0.121 mg/mL，其次為第G組(0.113 mg/mL)，依次減少的組號(hào)為32、31、21、12、22和11。

圖2 苧麻脫膠液的還原糖含量Fig.2 Reducing sugar content in the liquid of ramie degummed

2.2.3 質(zhì)量損失率與殘膠率比較

表4示出各組苧麻脫膠的質(zhì)量損失率和殘膠率。由表可看出，第N組的質(zhì)量損失率最高，達(dá)20.30%，殘膠率僅2.52%；其次第G組的質(zhì)量損失率為18.69%，殘膠率為4.21%。第N組和第G組的苧麻膠質(zhì)去除效果具有明顯優(yōu)勢(shì)，并且接近現(xiàn)有報(bào)道的高效菌種[13-15]。

表4 苧麻質(zhì)量損失率與殘膠率比較

2.2.4 纖維特征參數(shù)比較

表5示出各組脫膠苧麻的重要纖維特征參數(shù)，由表可看出，第N組的單纖維線密度為5.31 dtex；束纖維斷裂強(qiáng)度為4.8 cN/dtex，屬于優(yōu)質(zhì)脫膠苧麻纖維[16]。

表5 脫膠苧麻的纖維特征參數(shù)比較

3 結(jié) 語

通過比較苧麻脫膠菌種分泌的胞外酶中的果膠酶活力，獲得了2組優(yōu)勢(shì)果膠復(fù)合酶，最高果膠酶活力分別為13.69、61.79 IU/mL；通過苧麻酶法脫膠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，第N組的苧麻酶法脫膠效果最佳，其次為第G組。從這2組苧麻的質(zhì)量損失率、殘膠率及纖維的特征參數(shù)來看，均接近現(xiàn)有苧麻脫膠的實(shí)際應(yīng)用效果，值得進(jìn)一步研究。

FZXB

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Screening on compound pectinase for ramie degumming and its effect analysis

CHENG Lifeng1, LIU Zhengchu1, FENG Xiangyuan1, WANG Qiming2, LI Qi1,3, ZHENG Ke1, YANG Qi1, DUAN Shengwen1

(1.InstituteofBastFiberCrops,ChineseAcademyofAgricultureSciences,Changsha,Hunan410205,China; 2.CollegeofLifeScience,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan410128,China; 3.HunanLerkamBiologyCo.,Ltd.,Yueyang,Hunan414100,China)

To develop efficient enzyme preparation used in ramie degumming, the efficient strains used in ramie bio-degumming subjected to liquid state fermentation, which were screened and accessed. The characteristic parameters of extracellular enzymes including pectinase activity, mannanase activity and protein content, etc. were further determined, and the comprehensive indexes of the ramie degumming system, such as fiber morphology, mass loss rate, residual gum rate, etc., were analyzed. The results show that pectinase activities of the group N and the group G were 61.79 IU/mL and 13.69 IU/mL, respectively, and their special enzyme activities were 4.47 IU/mg and 0.93 IU/mg, respectively. Cellulase activities of the group N and the group G were only 0.01 IU/mL and 0.02 IU/mL, respectively. Their mass loss rate and residual gum rate of the group N and the group G were 20.30% and 18.69%, and 2.52% and 4.21%, respectively, which are close to those of strains in practical industry application. The single fiber fineness of the group N was 5.31 dtex, and the fracture strength of the bundle fiber was 4.8 cN/dtex, which belonged to high-quality degummed ramie fiber.

ramie; degumming; pectinase; hemi-cellulose; fiber morphology

10.13475/j.fzxb.20160601505

2016-06-07

2017-03-08

湖南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2016jj3126)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程(ASTIP-IBFC08)；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-19-E24)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(Y2016PT36)；湖南省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)科技攻關(guān)和重大科技成果轉(zhuǎn)化項(xiàng)目(2014GK1041)

成莉鳳(1981—)，女，助理研究員，博士。主要研究微生物基因工程等。段盛文，通信作者，E-mail：hunandsw@163.com。

TS 121； TS 123.2

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