不育男性精液常規(guī)參數(shù)與年齡、精子DNA碎片率和精子頂體功能的相關(guān)性研究

劉樹沅，韋劍洪，許小琴，陳偉輝

(中山市博愛醫(yī)院生殖中心，廣東中山528403)

不育男性精液常規(guī)參數(shù)與年齡、精子DNA碎片率和精子頂體功能的相關(guān)性研究

劉樹沅，韋劍洪，許小琴，陳偉輝

(中山市博愛醫(yī)院生殖中心，廣東中山528403)

目的探討不育患者精液常規(guī)參數(shù)與年齡、精子DNA碎片率和精子頂體功能存在的相關(guān)性。方法選擇2015年3月-2016年2月期間在本院接受體外受精-胚胎移植（IVF-ET）治療的112例不育男性患者，按照年齡將患者進(jìn)行分組，對(duì)其實(shí)施精液常規(guī)、精子DNA碎片率和頂體功能檢測，觀察分析兩組數(shù)據(jù)中精液常規(guī)參數(shù)與精子功能參數(shù)存在的相關(guān)性。結(jié)果年齡＞40歲組患者精子DNA碎片率顯著高于年齡≤40歲組（P＜0.05）；精液常規(guī)參數(shù)與不育男性年齡負(fù)相關(guān)；兩組患者精液常規(guī)參數(shù)與其精子DNA碎片率和精子頂體功能之間均存在顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)論精子DNA碎片率及頂體功能作為精液常規(guī)以外的檢測手段，對(duì)不育男性患者精液質(zhì)量評(píng)估、不孕原因分析以及生育能力評(píng)估具有重要的指導(dǎo)意義。

不育；精液常規(guī)；精子DNA碎片率；頂體功能

對(duì)男性生育能力進(jìn)行評(píng)估的基礎(chǔ)方法為對(duì)其精液質(zhì)量進(jìn)行分析，精液質(zhì)量在不育患者臨床診斷及治療上均表現(xiàn)重要意義[1]。臨床上對(duì)患者實(shí)施精液常規(guī)檢查所得數(shù)據(jù)在大體上能夠反映精子質(zhì)量，但在該類患者不育原因分析和生育能力評(píng)估上還存在一定局限性，因?yàn)椴挥行曰颊呒s30%精液常規(guī)結(jié)果正常，但卻難以實(shí)現(xiàn)生育愿望。隨著檢測技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到精子功能存在缺陷是導(dǎo)致男性不育的一個(gè)重要原因，其檢測有助于男性不育原因的分析。因此，通過對(duì)不育男性患者實(shí)施相關(guān)檢測，對(duì)其精子功能進(jìn)行準(zhǔn)確評(píng)估，對(duì)患者治療方案的制定具有重要意義。本次研究主要探討不育患者精子常規(guī)參數(shù)與其精子DNA碎片率、精子頂體完整率、精子自發(fā)頂體反應(yīng)率和年齡之間存在的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取112例于2015年3月-2016年2月期間在我院接受IVF-ET助孕治療的不育男性作為研究對(duì)象。入選標(biāo)準(zhǔn)：無性功能障礙史者；無睪丸、附睪異常以及輸精管異常者；無染色體異常以及激素紊亂者。排除標(biāo)準(zhǔn)：由于支原體、衣原體、細(xì)菌等病原微生物感染導(dǎo)致精子質(zhì)量受到影響者；功能性、器質(zhì)性不育者；最近1個(gè)月內(nèi)有使用過對(duì)精子功能產(chǎn)生影響的相關(guān)藥物進(jìn)行治療者?；颊吣挲g：最小為23歲，最大為56歲，平均（35.64±2.51）歲，其中，年齡≤40患者為72例，年齡＞40歲患者為40例。

1.2 方法

1.2.1 精液常規(guī)檢測按照WHO實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)（第5版）采集和處理精液?；颊邫z測前均須禁欲2～7d，通過手淫法對(duì)精液標(biāo)本進(jìn)行采集。采集到的樣本放置于清潔廣口無菌塑料杯中，杯子放置于溫度為37℃的恒溫板上，待標(biāo)本液化后應(yīng)用西班牙CASA精液質(zhì)量分析系統(tǒng)實(shí)施精液常規(guī)分析，所有操作均須在采集后60min內(nèi)完成，使用Diff-Quik染色法分析精子形態(tài)。

1.2.2 精子DNA完整性檢測應(yīng)用精子核染色質(zhì)發(fā)散法（SCD），使用深圳博銳德生物科技有限公司提供的試劑盒，嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。

1.2.3 精子頂體功能檢測采用PSA-FITC熒光標(biāo)記法頂體染色（安徽安科生物工程股份有限公司試劑盒）。第一次洗滌：取0.2ml的精液標(biāo)本放置于錐形試管中，加入5ml的生理鹽水，1000r/min× 10min；第二次洗滌：棄上清，將5ml生理鹽水加入，均勻混合，1000r/min×10min；上游法：將上清棄去，保留劑量為0.2～0.4ml，輕緩將1.2ml的BWW培養(yǎng)液加入精液上方，傾斜離心管為45°，37℃，1h；緩慢豎直試管，將最上層液吸取，吸取量為1ml，放入錐形試管，將5ml生理鹽水加入，1000r/ min×10min，棄去上清，保留0.2～0.4ml；取精子懸液5μl進(jìn)行涂片，制成2張涂片，長度均為1cm左右，待其自然干燥；使用濃度為95%的乙醇進(jìn)行30min的固定；將60～100μl的PSA-FTTC工作液加入，放置于4℃環(huán)境中2～17h；使用純凈水沖片，熒光顯微鏡藍(lán)光激發(fā)，放置于400倍鏡下進(jìn)行觀察。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn)精子DNA碎片化判定標(biāo)準(zhǔn)：精子頭部有光暈，但光暈的寬度＜精子核直徑的1/3，精子頭部沒有光暈，頭部不著色，或者核形態(tài)無規(guī)則性。精子DNA碎片率為精子DNA碎片化在觀察精子總數(shù)中所占比例。頂體完整精子判斷如下，頂體完整（AI）：精子頭部有超過1/2熒光染色明亮且具有均勻性；已發(fā)生頂體反應(yīng)（AB）：精子僅在赤道帶存在熒光帶，或頂體區(qū)無熒光染色；除上述兩類精子之外的所有精子僅判定為頂體異常。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法以百分率表示研究中的計(jì)數(shù)資料，實(shí)施χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x± s）表示，實(shí)施t檢驗(yàn)。研究中數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均憑借SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行。以P＜0.05表示差異性、相關(guān)性存在顯著性，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。相關(guān)性實(shí)施Spearman分析。

2 結(jié)果

2.1 不同年齡患者精子功能參數(shù)情況2組患者精子功能檢測結(jié)果顯示，年齡＞40歲組患者的精子DNA碎片率為1.51%～9.11%，平均（3.93±1.32）%，明顯高于年齡≤40歲組，組間差異對(duì)比存在顯著性（P＜0.05），見表1。年齡＞40歲組患者的精子頂體完整率為85.84%～92.25%，平均（89.17±13.53）%，與年齡≤40歲組比較未存在顯著性差異（P＞0.05），詳見表2。年齡＞40歲組患者的精子自發(fā)頂體反應(yīng)率為1.39%～3.89%，平均（2.57±1.54）%，與年齡≤40歲組比較未存在顯著性差異（P＞0.05），詳見表3。

表1 不同年齡患者精子DNA碎片率比較

表2 不同年齡患者精子頂體完整率比較

表3 不同年齡患者精子自發(fā)頂體反應(yīng)率比較

2.2 患者年齡與精子功能參數(shù)相關(guān)性不育患者的年齡與精子DNA碎片率表現(xiàn)正相關(guān)，與精子頂體完整率和精子自發(fā)頂體反應(yīng)率均未表現(xiàn)出顯著性相關(guān)，見表4。

表4 患者年齡與精液功能參數(shù)相關(guān)性

2.3 不同年齡患者精液常規(guī)參數(shù)情況精液常規(guī)檢測結(jié)果顯示，＞40歲組、≤40歲組患者在精液濃度、前向運(yùn)動(dòng)百分率、正常形態(tài)率幾項(xiàng)精液常規(guī)參數(shù)比較上均存在顯著性差異（P＜0.05），≤40歲組患者精液濃度、前向運(yùn)動(dòng)百分率、正常形態(tài)率均明顯高于＞40歲組患者，組間差異對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表5。

表5 不同年齡患者精液常規(guī)參數(shù)情況

2.4 精液常規(guī)參數(shù)與精子DNA碎片率、精子頂體功能的相關(guān)性精子DNA碎片率與患者精液濃度、前向運(yùn)動(dòng)百分率、正常形態(tài)率均表現(xiàn)為顯著性負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；精子頂體完整率與精液濃度、前向運(yùn)動(dòng)百分率、正常形態(tài)率表現(xiàn)為顯著性正相關(guān)（P＜0.05）；精子自發(fā)頂體反應(yīng)率與前向運(yùn)動(dòng)百分率、正常形態(tài)率均表現(xiàn)為顯著性負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與精液濃度無顯著性相關(guān)（P＞0.05）；精子DNA碎片率與精子頂體完整率表現(xiàn)為顯著性負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；精子自發(fā)頂體反應(yīng)率與精子DNA碎片率表現(xiàn)為顯著性正相關(guān)，與精子頂體完整率表現(xiàn)為顯著性負(fù)相關(guān)（P＜0.05），詳情見表6。

3 討論

精子DNA的完整性是父系遺傳信息傳遞給子代的前提，當(dāng)精子在發(fā)生過程中出現(xiàn)異常，或者體外環(huán)境發(fā)生改變等相關(guān)內(nèi)源性以及外源性因素的影響下，精子DNA均有可能受到損傷。有研究表明，男性不育可能與精子DNA損傷緊密相關(guān)，不育男性的精子DNA斷裂水平高于生育男性[2]，精液指標(biāo)正常的特發(fā)性不育患者，其精子DNA碎片率也增高[3]，精子DNA損傷會(huì)對(duì)自然生育、輔助生殖技術(shù)治療結(jié)局產(chǎn)生負(fù)面影響[4]。頂體為覆蓋于精子細(xì)胞核前面的扁囊狀結(jié)構(gòu)，由高爾基體特化而來，是精子所特有的一種細(xì)胞結(jié)構(gòu)。在受精過程中，精子頂體能夠與卵子透明帶相互結(jié)合，然后通過透明帶糖蛋白受體對(duì)頂體反應(yīng)產(chǎn)生誘發(fā)作用，進(jìn)而促進(jìn)頂體內(nèi)容物得到有效釋放，這個(gè)過程是精子穿透以及精卵相互結(jié)合得以完成的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)[5]。研究表明，存在于精子頂體內(nèi)的蛋白水解酶（頂體酶）與受精過程密切相關(guān)[6]，精子頂體酶是判斷精子生育能力很有價(jià)值的指標(biāo)[7]，精子頂體酶含量降低會(huì)引起精子生育能力下降[8]，而頂體酶容易從頂體不完整的精子漏出，在受精過程中，精子必須完成頂體反應(yīng)，釋放頂體細(xì)胞溶解酶，使得精子在穿透透明帶過程中產(chǎn)生一條軌道，協(xié)助精子穿過透明帶與卵子結(jié)合[9]。當(dāng)無頂體精子無法與卵子透明帶以及卵黃膜相關(guān)融合時(shí)，精子會(huì)在與透明帶相互結(jié)合之前便發(fā)生自發(fā)頂體反應(yīng)，進(jìn)而失去受精能力[10]。所以，進(jìn)行精子DNA完整性檢測以及精子頂體功能檢測，在男性精液質(zhì)量、精子功能和生育能力評(píng)估上具有重要意義。

表6 患者精液常規(guī)參數(shù)與精子功能參數(shù)相關(guān)性

目前，臨床上主要應(yīng)用SCD法對(duì)精子DNA完整性進(jìn)行檢測，進(jìn)而對(duì)精子DNA狀態(tài)進(jìn)行評(píng)估。該種方法操作簡單，檢測結(jié)果準(zhǔn)確性及可靠性較高，且易于推廣。檢查精子頂體完整性的方法有普通光鏡染色、免疫化學(xué)染色技術(shù)以及改良巴氏技術(shù)染色，這些方法對(duì)操作者的要求較高，也較復(fù)雜，得不到很好的推廣應(yīng)用。本研究采用FITCPSA法對(duì)精子頂體功能進(jìn)行檢測，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)精子頂體完整性進(jìn)行科學(xué)評(píng)估，同時(shí)該種檢測方法能夠解決常規(guī)形態(tài)學(xué)方法不能有效判別精子自發(fā)頂體反應(yīng)問題，檢測結(jié)果更具客觀性和科學(xué)性[11]。

Garjani A[12]等臨床研究結(jié)果顯示，隨著年齡的增加，男性的生育能力表現(xiàn)出逐漸下降的趨勢，且其配偶發(fā)生自發(fā)流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)會(huì)逐漸升高。但是該方面具體作用機(jī)制目前還尚未形成一個(gè)統(tǒng)一定論，相關(guān)研究還有待于進(jìn)一步深入[13]。本次研究所得數(shù)據(jù)顯示，年齡增加會(huì)對(duì)不育男性精液濃度、前向運(yùn)動(dòng)百分率以及正常形態(tài)率等精液常規(guī)參數(shù)產(chǎn)生明顯影響，且二者表現(xiàn)為顯著性負(fù)相關(guān)。這個(gè)研究結(jié)果表明，隨著年齡的增加，男性的精液質(zhì)量會(huì)逐漸下降，年齡超過40歲時(shí)，男性相關(guān)精液參數(shù)均有明顯降低。比較檢測結(jié)果顯示，年齡＞40歲組患者的精子DNA碎片率明顯高于年齡≤40歲組，組間差異對(duì)比存在顯著性（P＜0.05），高齡男性在受精、其配偶在胚胎發(fā)育過程中發(fā)生染色體異常、基因缺陷的風(fēng)險(xiǎn)也會(huì)更大。精子DNA碎片率與患者精液濃度、前向運(yùn)動(dòng)百分率、正常形態(tài)率均表現(xiàn)為顯著性負(fù)相關(guān)（P＜0.05），這與Moskovtsev SI等[14]有一致的結(jié)論；精子DNA碎片率與精子頂體完整率、自發(fā)頂體反應(yīng)均存在顯著的相關(guān)性，這提示著精子的缺陷可能存在多個(gè)合并因素。

頂體不完整包括：精子無頂體、頂體形態(tài)異常以及頂體在未接觸卵子之前即發(fā)生自發(fā)頂體反應(yīng)，從而導(dǎo)致頂體不完整。未經(jīng)體外人為干預(yù)使用生理性或非生理性物質(zhì)誘發(fā)，精子在生理?xiàng)l件下，體內(nèi)自由基等影響因素作用下而自發(fā)發(fā)生頂體反應(yīng)，即自發(fā)頂體反應(yīng)，精子自發(fā)頂體反應(yīng)在生理學(xué)方面具有一定的意義。精子頂體缺陷與男性不育密切相關(guān)，頂體完整率是反應(yīng)頂體缺陷與否的重要指標(biāo)，本研究結(jié)果提示：精子頂體完整率與精子正常形態(tài)率之間表現(xiàn)為顯著性的正相關(guān)，兩者差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說明精子正常形態(tài)率越高，精子頂體完整性就越好，精子形態(tài)異常往往合并精子頂體的缺陷，這與Sallam HN等[15]的研究結(jié)果一致。

因此，不育男性年齡與其精液質(zhì)量存在密切關(guān)系，二者表現(xiàn)為顯著性負(fù)相關(guān)，精子DNA碎片率和精子頂體完整率等精子功能存在顯著的相關(guān)性，精子頂體完整率與精子正常形態(tài)率之間表現(xiàn)為顯著性的正相關(guān)。精液常規(guī)參數(shù)檢測和精子頂體相關(guān)功能檢測可以作為互補(bǔ)的手段，為不育男性患者查找不育原因及治療提供參考依據(jù)，而能否通過評(píng)估精子頂體功能及其反應(yīng)能力，指導(dǎo)授精方式的選擇和預(yù)測受精結(jié)局，則需要進(jìn)一步的研究和探討。

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The study of correlation between infertility male semen routine parameter，age，sperm DNA fragmentation rate and sperm acrosome function

LIU Shuyuan，WEI Jianhong，XU Xiaoqin，CHEN Weihui.
Reproductive Medical Center，Boai Hospital of Zhongshan City，Zhongshan Guangdong 528403，China.

Objective To study the correlation between infertility male semen routine parameter and some factors including age，sperm DNA fragmentation rate and sperm acrosome function.Methods A total of 112 infertile male patients who are treated by in vitro fertilization-embryo transfer（IVF-ET）in our hospital from March 2015 to February 2016 were selected，grouped according to the patients age，tested the implementation rate of semen routine，sperm DNA fragments and acrosome function，observed and analysis of two groups of data correlation between semen routine parameters and sperm function.Results Male patients more than 40 years old with sperm DNA fragments were significantly higher than age 40 years old or less group(P＜0.05)；Semen routine parameters showed a negative correlation with male age；Two groups of patients semen routine parameters and its rate of sperm DNA fragments and there were significant differences between sperm acrosome function(P＜0.05).Conclusion the rate of sperm DNA fragments and acrosome functions as semen routine detection means，in patients with infertility male semen quality assessment，analyzing the causes of infertility，and fertility assessment has important guiding significance.

∶Infertility；Semen routine；Sperm DNA fragmentation rate；Top body function

R446.19，R698+.2，R711.6

A

1674-1129(2017)03-0333-04

2016-12-26；

2017-05-08)

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.03.012

廣東省中山市科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2015B1170）

劉樹沅，男，1981年生，主管技師，大學(xué)本科，研究方向：主要從事輔助生殖及生殖醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。