梯型板和全自動加樣儀在疑難配血中的應用

鐘展華，孫愛農(nóng)

(1、惠州市中心血站，廣東惠州516000；2、中山市中心血站，廣東中山528403)

梯型板和全自動加樣儀在疑難配血中的應用

鐘展華1，孫愛農(nóng)2

(1、惠州市中心血站，廣東惠州516000；2、中山市中心血站，廣東中山528403)

目的建立一種應用于采供血機構(gòu)的快速篩選除ABO血型以外特定紅細胞抗原血源的方法。方法血站檢驗科在日常做ABO血型檢測時，將稀釋紅細胞的生理鹽水改為紅細胞保養(yǎng)液，檢測后將稀釋板標示后保存，編寫智能化全自動加樣程序，利用全自動加樣器將混合的血型抗體液和供者的紅細胞加入Olympus梯形板，篩選出相同血型抗原陰性供者。結(jié)果梯形板聯(lián)合全自動加樣器的方法和傳統(tǒng)的試管法均能全部篩選出相同血型抗原陰性供者，但梯形板聯(lián)合全自動加樣器法所需時間大大低于傳統(tǒng)的試管法。結(jié)論梯形板和自動加樣器的聯(lián)合應用，為特殊患者篩選合適血源，具有快速、準確和低成本的效果，適合在采供血系統(tǒng)推廣。

Olympus梯形板；血源篩選；全自動加樣器；疑難配血

不規(guī)則抗體一般指ABO血型系統(tǒng)以外的其他血型系統(tǒng)抗體，主要經(jīng)輸血或妊娠等免疫產(chǎn)生，不規(guī)則抗體會導致輸血反應；輕者引起寒戰(zhàn)、發(fā)熱，影響治療效果；重者破壞輸入的不配合的紅細胞或縮短其壽命，產(chǎn)生溶血性輸血反應，危及病人生命；根據(jù)相關的文獻報道，最易產(chǎn)生血型不規(guī)則抗體的為Rh血型系統(tǒng)，MNS血型系和kidd血型系統(tǒng)[1，2]，對于有不規(guī)則抗體或者含溫自身抗體且難于鑒定抗體類型的患者，上述血型系統(tǒng)表型相同的輸血可以避免溶血性輸血反應的發(fā)生，為此我們建立一種用Olympus梯型板和全自動加樣器智能化技術聯(lián)合應用的方法，可以為此類特殊的受血者從血站的血庫中快速篩選出相合血液，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要硬件STAR全自動加樣器，瑞士Hamilton公司生產(chǎn)，配套英文控制軟件版本為4.30；恒溫振蕩器(上海微百科技公司)；CT6D平板離心機(日本日立公司)；DK-600S三用水浴箱(廣東環(huán)凱科技公司)；KA-2200離心機(日本久保田公司)；anthos ht3酶標儀(奧地利anthos公司)；10～100μl、20～200μl可調(diào)量程微量移液器(美國熱電公司)；120孔梯形微孔板，由日本奧林巴斯公司生產(chǎn)；96孔普通微量塑料平底板。

1.2 主要試劑單克隆IgM的抗-D、抗-E、抗-e、抗-C、抗-c試劑均由上海血液生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)；單克隆IgM的抗M，N，S，s Jka，Jkb試劑由加拿大Dominion公司生產(chǎn)、血袋用的紅細胞保養(yǎng)液由山東威高公司生產(chǎn)，生理鹽水。以上試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.3 方法

1.3.1 本實驗室的ABO血型檢測的正定型和Rh血型的檢測采用通用的微板法[3]，平時實驗后稀釋板中的紅細胞未用完放2～6℃冰箱保存，稀釋液為采血袋用的紅細胞保養(yǎng)液，稀釋板跟其他酶標板同時進行條碼標記，并打印微板布局，以確定每個微孔的獻血者編碼。

1.3.2 使用STAR加樣器上，參考文獻[3，4]的方法和參數(shù)，編寫的加樣方法實現(xiàn)了和站內(nèi)信息系統(tǒng)的雙向通訊，使用上述的平底板稀釋板，將濃度為5%的獻血者紅細胞加分別到5塊梯形板上，每塊120孔，一共600孔，每板設置一個陽性對照孔和一個陰性對照孔，加樣程序能夠自動判定稀釋板的紅細胞對應血液的血型、檢測結(jié)果和庫存狀態(tài)，共使用稀釋板20塊，一共選取590例O型及化驗合格者，常規(guī)ABO血型檢測的日期為2015年12月1日到2015年12月8日，本次實驗的時間為2015年12月20日。

1.3.3 將試劑抗-C和抗-e兩種等量混合，編號No. 1；將試劑抗-C和抗-e和Jka三種試劑等量混合，編號No.2；將試劑抗-C和抗-e和Jkb三種試劑等量混合，編號為No.3；將試劑抗-C和抗-e和抗-M三種試劑等量混合，編號為No.4；將試劑抗-C和抗-e和抗-N三種試劑等量混合，編號為No.5。No. 1陰性的表示C、e均陰性，No.2陰性的表示C、e、Jka均陰性，No.3陰性的表示C、e、Jkb均陰性，No.4陰性的表示C、e、M均陰性，No.5陰性的表示C、e、N均陰性。

1.3.4 用STAR加樣器將編號為No.1～No.5的5種試劑分別加入到已加獻血者標本的5塊梯形板上，每孔25μl。陰性孔加入RhD陰性獻血者紅細胞和抗-D，陽性孔加入RhD陽性獻血者紅細胞和IgM抗-D。

1.3.5 將已加試劑的梯形微板放置微量在振蕩器上，設定振蕩頻率為35Hz和45Hz之間，振蕩20s，使孔內(nèi)紅細胞和抗體試劑充分混勻，然后靜置30min。有實心圓點的為陰性結(jié)果，均勻分布的為陽性結(jié)果，記錄微孔位置，查找相應的獻血者編碼。

1.3.6 用手工試管法進行對照實驗，獻血者的標本采用的是血辮子，方法參考文獻[5]，記錄全過程所需時間。

2 結(jié)果

2.1 梯形型板法篩選590例獻血者尋找相應抗原陰性與手工試管法效果對比結(jié)果見表1。

2.2 梯形型板法篩選過程記錄見表2。

表2 梯形型板篩選過程記錄

2．3靈敏度比較試驗每種抗體試劑選取一個陽性標本，將每種抗體試劑稀釋2～64倍，結(jié)果見表3。

2.4 使用紅細胞保養(yǎng)液和生理鹽水做稀釋液檢測效果對比只使用陰性對照孔和陽性對照孔用紅細胞保養(yǎng)液做稀釋的紅細胞在懸浮紅細胞過期報廢之前均不影響結(jié)果，用生理鹽水稀釋的紅細胞在第5d就已經(jīng)輕度溶血，且無法分辨陰陽性對照了，結(jié)果見表4。

2.5 梯形型板法篩選實際使用結(jié)果記錄從2016年3月份到2016年9月份，本站共收到臨床送檢的4例含溫自身抗體的患者的疑難配血需求，因為患者血清中含自身抗體，常規(guī)方法無法為患者找到相合的血液，為防止自身抗體掩蓋同種抗體，采用本研究的方法為患者篩選血液，輸血后臨床均未見明顯輸血反應，結(jié)果見表5。

3 討論

含溫自身抗體的標本，因紅細胞被致敏，血漿中存在自身抗體，無論是血清學檢測還是臨床的配合性試驗，都是很難處理的問題，常常困擾著輸血工作者?；颊哐逯凶陨砜贵w特別是含有溫自身抗體如果按照常規(guī)實驗將很難獲得相合的血液，因為自身抗體尤其是溫自身抗體的存在會干擾同種抗體的檢出；患者如果輸入含同種抗體對應抗原陽性的血液，可使其產(chǎn)生溶血性輸血反應，嚴重的可能產(chǎn)生致命的危險[6]。按照以往的做法是使用自身紅細胞，先進行放散實驗，放散掉黏附在自身紅細胞上的抗體，然后再吸收自身血清中的抗體，反復進行多次，以此排除自身抗體的干擾[8]。然而在實際工作中，嚴重貧血的患者血樣中的紅細胞通常很少，做吸收放散實驗很容易溶血，實驗也非常繁瑣耗時，而且很難奏效。Shirey RS等學者提出對有溫自身抗體的或者難于鑒定同種抗體類型的患者，可作預防性供者抗原配型進行血液輸注[7]。上海血液中心的向東等也提出使用Rh血型系統(tǒng)、MMS血型系統(tǒng)及Kidd血型系統(tǒng)抗原匹配的紅細胞輸注，就可基本上避免同種抗體引起的嚴重輸血反應。以此省略復雜耗時的的自身吸收放散等操作，使患者得到及時有效的輸血治療[8]。對于有生育能力的女性患者的輸血，筆者認為使用DCcEe抗原以及M、S、Jka、Jkb等抗原匹配的紅細胞輸注，就可基本上避免產(chǎn)生不規(guī)則抗體，從而最大限度防止因血型抗體導致的新生兒溶血病的發(fā)生。

表3 抗體試劑靈敏度檢測結(jié)果

表4 紅細胞保養(yǎng)液和生理鹽水做稀釋液檢測效果對比

表5 梯形型板法篩選實際使用結(jié)果記錄

在確定患者的Rh血型系統(tǒng)以及MMS血型系統(tǒng)及其他血型系統(tǒng)的抗原后，就需要篩選對應抗原同樣也為陰性的血源，但如果遇到的是低頻率血型抗原陰性的紅細胞，醫(yī)院輸血科很難在庫存血中篩選出出相合的血液。輸血科此時只有請求血站協(xié)助篩選血液。血站篩選的方法一般使用試管法和微板法，試管法因為難于實現(xiàn)自動加樣，不適合進行大批量的標本篩選。如果使用傳統(tǒng)試管法進行大批量的血源篩選，需要耗費大量的時間來進行試驗，可能會耽擱患者寶貴的搶救時機。國內(nèi)的羅海玲等使用U型板為疑難配血的患者進行抗原篩選[10]，但是U型板法需要進行離心和震蕩，不利于弱抗體的檢出，因而U型板法要求抗體試劑的效價較高，本實驗采用微板法中抗原抗體反應最為敏感的梯形板。梯型微板法原理是采用孔壁呈階梯狀的特殊V型微孔板，微孔內(nèi)發(fā)生相應的抗原抗體反應（凝集）時，紅細胞會彼此粘成凝塊，掛在階梯上，均勻分布于孔內(nèi)底面階梯上.未發(fā)生抗原抗體反應(非凝集)時，紅細胞沿階梯滾落于孔底中央形成實心圓點，觀察微板的底部即可判定是否發(fā)生抗原抗體反應[11]。

本實驗所使用方法的紅細胞保養(yǎng)液取自成分分離紅細胞時，有些血袋破袋或者采集不足量的時候，將有剩余的紅細胞保養(yǎng)液，在一般情況下，將會丟棄，日常檢測ABO正定型和Rh血型的稀釋板也是做完實驗就當醫(yī)療垃圾進行處理的，平時我們?yōu)榛颊吲溲男枰窖獛炷醚霓p子來進行，非常費時費力。使用本研究所使用的方法方便快捷，不需要動用獻血者原始標本和血袋的辮子，直接選擇保存在2～6℃冰箱含有獻血者紅細胞的稀釋板，可以為此類危重患者爭取寶貴的搶救時間。

受條件所限，本實驗使用的抗體沒有包括Duffy，Lewis等其他血型系統(tǒng)，因而并不能100%保證避開不規(guī)則抗體，有條件的血站可以加入其他血型系統(tǒng)的抗體，本組實際應用標本數(shù)也不多，需要用更長時間和更大批量的實驗去進行驗證。

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R457.1+1

A

1674-1129(2017)03-0451-04

2017-03-09；

2017-04-14)

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.03.056