反復(fù)自然流產(chǎn)患者外周血孕激素誘導(dǎo)阻斷因子及Th1/Th2型細(xì)胞因子表達(dá)的研究*

黃山鷹，唐國玲，戴 宇，劉慶芝，姚吉龍，都紅蕾

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市婦幼保健院婦科，廣東 深圳 518000)

反復(fù)自然流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion,RSA)是指連續(xù)2次或2次以上的自然流產(chǎn)，發(fā)病率為1%。RSA的病因很多，包括染色體異常、內(nèi)分泌異常、免疫因素、感染因素和解剖因素等。約50%RSA原因不明，多考慮與免疫因素相關(guān)，母胎之間免疫狀態(tài)失衡，發(fā)生免疫排斥致反復(fù)流產(chǎn)。近年來，RSA的免疫學(xué)病因研究較廣泛開展，尤其是細(xì)胞因子表達(dá)異常與RSA發(fā)生的相關(guān)性更是近年來的研究熱點(diǎn)。越來越多的研究表明Th1/Th2表達(dá)失衡與妊娠結(jié)局密切相關(guān)，Th2來源的細(xì)胞因子有利于妊娠，而Th1來源的細(xì)胞因子則對妊娠不利，孕激素誘導(dǎo)阻斷因子(Progesterone-induced blocking factor，PIBF)通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子產(chǎn)物而對正常妊娠發(fā)揮重要免疫調(diào)節(jié)作用；但國內(nèi)有關(guān)PIBF對RSA的影響的研究很少。本研究擬通過對RSA患者血清中PIBF、Th1/Th2型細(xì)胞因子水平的測定，以深入探討各細(xì)胞因子之間及它們與RSA之間的的關(guān)系，致力于為RSA的預(yù)防、診斷和臨床治療提供新的思路及理論依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2010-06—2011-06間在南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳市婦幼保健院生育保健科住院的RSA患者94例，經(jīng)詳細(xì)詢問病史及系統(tǒng)檢查，排除遺傳、解剖、自身免疫、內(nèi)分泌方面的異常及感染性疾病。同時(shí)選擇同期就診要求終止妊娠的92例正常健康早孕婦女及72例正常未孕婦女作為對照。正常健康早孕婦女要求過去無自然流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)史，本次妊娠期間無陰道流血、腹痛等先兆流產(chǎn)癥狀和體征，B超證實(shí)胚胎發(fā)育正常。RSA組及正常健康早孕組研究對象均要求妊娠8～12周，年齡、孕次、停經(jīng)天數(shù)比較均無明顯差異。

1.2 方法

分別收集臨床治療前RSA組、正常健康早孕組婦女，及正常未孕組婦女空腹靜脈血4mL，分離血清并于-20℃保存待檢測。采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法(ELISA)測定各細(xì)胞因子的含量。檢測試劑盒購自美國GBD公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

RSA組血清中IL-2、TNF-α、IFN-γ的水平顯著高于正常健康早孕組，也高于正常未孕組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。正常健康早孕組血清中IL-2、TNF-α、IFN-γ的水平低于正常未孕組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。RSA組血清中PIBF、IL-10水平顯著低于正常健康早孕組，也低于正常未孕組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。正常健康早孕組血清中PIBF、IL-10的水平高于正常未孕組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 RSA患者外周血血清中PIBF和Th1/Th2型細(xì)胞因子的表達(dá)水平 pg/mL

3 討論

RSA是常見的病理妊娠之一，近年來細(xì)胞因子在調(diào)控生殖方面的作用愈發(fā)引人注目，越來越多證據(jù)表明，免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子通過影響生殖系統(tǒng)的神經(jīng)內(nèi)分泌、卵巢功能、胚胎的著床和發(fā)育,以及胎盤功能等以影響正常妊娠的進(jìn)行。其中孕激素誘導(dǎo)阻滯因子、Th1/Th2 細(xì)胞因子在生殖活動(dòng)中的作用更是引起了眾多學(xué)者的關(guān)注，其作用機(jī)理有待醫(yī)學(xué)界同仁的進(jìn)一步研究探討，為RSA的預(yù)防與治療提供有力的理論支持。

3.1 PIBF與反復(fù)自然流產(chǎn)的關(guān)系

PIBF最早是由Szekeres-Bartho等[1]作為與調(diào)節(jié)妊娠免疫應(yīng)答的密切相關(guān)的有效因子1985年提出的。PIBF是由妊娠婦女淋巴細(xì)胞釋放的一種分子量為34-KDa的蛋白質(zhì)，介導(dǎo)妊娠免疫調(diào)節(jié)和孕激素的抗流產(chǎn)效應(yīng)。PIBF主要通過抑制NK(自然殺傷細(xì)胞)細(xì)胞活性對妊娠起保護(hù)作用，此外它還可以增加Th2型細(xì)胞因子和抑制Th1型細(xì)胞因子的表達(dá)，影響Th1/Th2型細(xì)胞因子的平衡，在妊娠保護(hù)作用機(jī)制中起重要作用[2]。PIBF 還有助于封閉抗體的合成，從而對胚胎起保護(hù)作用[3]。Szekeres[4]等人早在1989年的研究中就發(fā)現(xiàn)流產(chǎn)婦女血清中PIBF表達(dá)水平低于正常妊娠婦女。Hudic[5]等用ELISA法檢測先兆流產(chǎn)患者及正常妊娠婦女血清及尿液中的PIBF濃度，發(fā)現(xiàn)前者血清及尿液中的PIBF濃度均顯著低于后者。該研究同時(shí)也表明病理妊娠婦女血清中PIBF表達(dá)水平也明顯低于正常妊娠婦女。即當(dāng)PIBF缺乏時(shí)，妊娠流產(chǎn)率顯著升高[10]。本次研究中，RSA患者外周血血清中PIBF表達(dá)水平顯著低于正常健康早孕組，與上述研究結(jié)果一致。這就進(jìn)一步證實(shí)PIBF表達(dá)降低是RSA發(fā)生的重要原因之一，PIBF血清表達(dá)水平可用來預(yù)測RSA的發(fā)生。

3.2 Th1/Th2型細(xì)胞因子與反復(fù)自然流產(chǎn)的關(guān)系

輔助性T細(xì)胞(T helper cell，TH)可分為Th1和Th2型細(xì)胞，它們均在妊娠免疫中發(fā)揮著重要作用。Th1型細(xì)胞分泌的IL-2、TNF-α、IFN-γ等因子主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫及局部炎癥反應(yīng)，可以直接或間接激活細(xì)胞毒細(xì)胞損害胎盤組織，阻礙早期胚胎發(fā)育，從而影響妊娠結(jié)局，具有胚胎毒作用。Th2型細(xì)胞分泌的IL-4、IL-10等因子，主要介導(dǎo)體液免疫和同種排斥反應(yīng)耐受，通過抑制母-胎界面的免疫炎癥，促進(jìn)胎兒生長發(fā)育并維持妊娠繼續(xù)進(jìn)展，具有胚胎營養(yǎng)作用。兩者之間的平衡是維持正常妊娠的重要因素，Rezaei等[6]發(fā)現(xiàn)RSA組患者血清中IL-2、TNF-α水平顯著高于正常早孕組，某種程度上證實(shí)了升高的Th1細(xì)胞因子可被看做是預(yù)測妊娠結(jié)局的可靠指標(biāo)。仕金讓等[7]在對RSA患者的臨床研究中發(fā)現(xiàn)其血清中TNF-α水平明顯高于早孕及非孕婦女，該研究提示過高的TNF-α可對胚胎發(fā)育造成破壞，影響妊娠結(jié)局。Daher等[8]也發(fā)現(xiàn)RSA患者外周血IFN-γ水平顯著高于正常未孕婦女。李昭榮等[9]通過對54例RSA患者血清及蛻膜組織中IL-2、IFN-γ的含量測定，證實(shí)了RSA患者血清及蛻膜組織中IL-2、IFN-γ的水平均明顯高于正常早孕組，該研究同時(shí)也發(fā)現(xiàn)RSA患者血清中IL-4、IL-10的水平顯著低于正常對照組；上述研究均表明，正常妊娠時(shí)Th2型免疫反應(yīng)占優(yōu)勢，而RSA患者則以Th1型免疫反應(yīng)為主。本次研究通過對94例RSA患者血清中Th1(IL-2、TNF-α、IFN-γ)和Th2(IL-10)的含量檢測，證實(shí)了RSA患者血清中Th1型細(xì)胞因子水平均明顯高于正常早孕組，Th2型細(xì)胞因子水平顯著低于正常早孕組，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本次研究結(jié)果與前述研究結(jié)果一致，這就再次表明，正常妊娠時(shí)人體是一種特殊的Th2現(xiàn)象，Th1處于抑制狀態(tài)，若Th1型細(xì)胞因子過度表達(dá)，則引起流產(chǎn)發(fā)生[10-11]。

3.3 反復(fù)自然流產(chǎn)患者血清PIBF含量與Th1/Th2型細(xì)胞因子的關(guān)系

正常生殖過程的調(diào)節(jié)是通過效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，從而形成“通訊”網(wǎng)絡(luò)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞-細(xì)胞之間的信息傳遞，通過啟動(dòng)、激活、抑制或減弱程序性的生理機(jī)能而實(shí)現(xiàn)。參與生殖過程調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子有多種，如細(xì)胞介素、TNF、IFN等，這些因子對維持正常妊娠有積極作用，若這些細(xì)胞因子含量發(fā)生變化，妊娠結(jié)局也將發(fā)生改變，這便導(dǎo)致各種病理妊娠發(fā)生。本次研究中發(fā)現(xiàn)，正常早孕組婦女血清中IL-2、TNF-α、IFN-γ水平明顯低于未孕組，而其PIBF、IL-10的水平則顯著高于未孕組。這就表明妊娠過程中母體Th1、Th2型細(xì)胞因子含量的改變及其新的動(dòng)態(tài)平衡的建立，有利于受精卵著床和胚胎發(fā)育，促進(jìn)妊娠正常進(jìn)行。另外，正常妊娠過程中，PIBF表達(dá)的增加可促進(jìn)Th2型細(xì)胞因子(IL-4和IL-10)分泌，并同時(shí)抑制Th1型細(xì)胞因子(IL-12、IFN-γ)分泌，使Th1/Th2型細(xì)胞因子建立新的動(dòng)態(tài)平衡，即向Th2型細(xì)胞因子偏移，有利于正常妊娠的維持。Raghupathy R等人[12]的研究顯示，相較于血清中無PIBF表達(dá)的RSA患者，血清中有PIBF表達(dá)的RSA患者，其Th2型細(xì)胞因子(IL-4、IL-6、IL-10)表達(dá)明顯升高，即證實(shí)PIBF在增加Th2型細(xì)胞因子表達(dá)水平上有重要作用。同時(shí)研究結(jié)果還證實(shí)有PIBF的表達(dá)患者比無PIBF表達(dá)患者的Th1/Th2值低，提示PIBF可促使患者血清Thl/Th2型細(xì)胞因子，由Th1向Th2偏倚。Szekeres等[13]還檢測出有流產(chǎn)傾向的孕婦血清中TNF-a較健康孕婦顯著增高，PIBF的檢測結(jié)果則正好相反，內(nèi)源性PIBF被中和后NK細(xì)胞活性升高，P1BF抑制IL-12在激活的淋巴細(xì)胞中表達(dá)，通過活性脾細(xì)胞增加IL-10表達(dá)。本次研究還顯示，RSA組血清中TH1型細(xì)胞因子表達(dá)水平顯著高于正常早孕組，而PIBF、IL-10水平顯著低于正常早孕組，即出現(xiàn)了RSA組血清中Th1/Th2細(xì)胞因子平衡的逆轉(zhuǎn)，即向Th1型細(xì)胞因子偏移，這就導(dǎo)致了流產(chǎn)的發(fā)生。探討Th1/Th2平衡的概念使人們從更符合自然個(gè)體的角度來理解和認(rèn)識(shí)妊娠免疫，正常妊娠的維持與Th1/Th2平衡有關(guān)，當(dāng)Th1/Th2平衡破壞，則妊娠病理產(chǎn)生，隨之流產(chǎn)發(fā)生[14-15]。

綜上所述，PIBF具有多種生物學(xué)效應(yīng)，對妊娠有保護(hù)作用，有利于正常妊娠的維持。其作用主要通過影響Th1/Th2型細(xì)胞因子的平衡來實(shí)現(xiàn)；而Th1/Th2型細(xì)胞因子在正常妊娠和病理妊娠中發(fā)揮重要作用，這將給臨床醫(yī)生多種啟示：我們是否可通過檢測孕婦外周血中的細(xì)胞因子濃度來判斷孕婦的孕早期狀態(tài)，對RSA等病理妊娠進(jìn)行預(yù)測和診斷。我們是否可根據(jù)細(xì)胞因子的類型及其比值對患者進(jìn)行免疫治療，通過改變優(yōu)勢免疫應(yīng)答類型，尋找有效的作用靶點(diǎn)，達(dá)到預(yù)防和治療RSA的目的，從而改善母兒預(yù)后。

[1] SZEKERES-BARTHO J,KILAR F,FALKAY G,etal.The mechanism of the inhibitory effect of progesterone on lymphocyte cytotoxicity：I.Progesterone-treated lymphocytes release a substance inhibiting cytotoxicity and prostaglandin synthesis[J].Am J Reprod Immunol Microbiol,1985,9(1)15-18.

[2] SZEKERES-BARTHO J,POLGAR B,KOZMA N,etal.Progesterone-dependent immunomodulation[J].Chem Immunol Allergy,2005(89)：118-125.

[3] POLGAR B,NAGY E,MIKO E,etal.Urinary progesterone-induced blocking factor concentration is related to pregnancy outcome[J].Biol Repord,2004,71(5):1699-1705.

[4] SZWKERS-BARTHO J,VARGA P,PEJTSIK B.ELISA test for the detection of an immunological blocking factor in human pregnancy serum[J].J Reprod Immunol,1989,16(1):19-29.

[5] HUDIC I，F(xiàn)ATUS Z.Progesterone-induced blocking factor(PIBF) and Th1/Th2 cytokine in women with threatened spontaneous abortion[J].J Perinat Med,2009,37(4) :338-342.

[6] REZAEI A，DABBAGH A.T-helper(1)cytokines increase during early pregnancy in women with a history of recurrent spontaneous abortion[J].Med Sci Monit，2002，8(7)：607-610.

[7] 仕金讓，任興武，潘筱，等.反復(fù)自然流產(chǎn)患者妊娠相關(guān)蛋白、自身抗體及細(xì)胞因子的檢測研究[J].中華婦產(chǎn)科雜志，2002，10(37):617-618.

[8] DAHER S,DE ARRUDA GERALDES DENARDI K,BLOTTAMH,etal.Cytokines in recurrent pregnancy loss[J].J Reprod Immunol,2004,62(1-2)：151-157.

[9] 李昭榮，韓香，呂海俠，等.Thl/Th2型細(xì)胞因子與反復(fù)自然流產(chǎn)的關(guān)系[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2003，24(3)：255-257.

[10] 尤昭玲，劉慧萍，雷磊，等.正常妊娠與自然流產(chǎn)模型小鼠Th1/Th2 型細(xì)胞因子表達(dá)的差異[J].中國中醫(yī)藥科技，2009,16(2)：133-134.

[11] 靳榮，金平.原因不明復(fù)發(fā)性流產(chǎn)病因和治療研究進(jìn)展[J].中國婦幼保健，2008,23(13)：1891-1893.

[12] RAGHUPATHY R,AL-MUTAWA E,AL-AZEMI M,etal.Progesterone-induced blocking factor(PIBF) modulates cytokine production by lymphocytes from women with recurrent miscarriage or preterm delivery[J].J Reprod Immunol,2009,80(1-2):91-99.

[13] SZEKERES-BARTHO J，F(xiàn)AUST Z，VARGA P.The immunological pregnancy protective effect of progesterone is manifested via controlling cytokine production[J].Am J Reprod Immunol,1996,35(4):348-351.

[14] KWAK-KIM J，LEE S K，GILMAN-SACHS A，etal.Elevated Th1/Th2 cell ratios in a pregnant woman with a history of RSA，secondary Sjogren’s syndrome and rheumatoid arthritis complicated with one fetal demise of twin pregnancy[J].Am J Reprod Immunol，2007，58(4)：325-329.

[15] NAN C L，LEI Z L，ZHAO Z J，etal.Increased Th1/Th2(IFN-gamma/IL-4,cytokine mRNA ratio of rat embryos in the pregnant mouse uterus[J].J Reprod Dev，2007，53(2)：219-228.