重組UBC13對RAW264.7炎癥因子mRNA表達(dá)的影響

張 亮，扆妍妍，陶佳麗，段馬魁，姜俊兵

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801)

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重組UBC13對RAW264.7炎癥因子mRNA表達(dá)的影響

張 亮，扆妍妍，陶佳麗，段馬魁，姜俊兵*

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷 030801)

為了研究重組蛋白UBC13對RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞炎癥因子mRNA表達(dá)量的影響，采用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測UBC13對RAW264.7細(xì)胞活力的影響，qPCR法檢測不同濃度UBC13(20、10、5 μg/mL)在不同時(shí)間點(diǎn)(3、6、9、12、24 h)對RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6、IL-1β、TNF-α 和COX-2 4種炎癥因子mRNA表達(dá)量的影響。結(jié)果表明，在整個(gè)試驗(yàn)時(shí)間范圍內(nèi)IL-6、IL-1β、TNF-α和COX-2 mRNA表達(dá)量呈現(xiàn)逐步降低的趨勢；與細(xì)胞對照組組相比，在24 h時(shí)IL-6、IL-1β、TNF-α 和COX-2 mRNA表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。說明重組蛋白UBC13作用于RAW264.7細(xì)胞24 h時(shí)能夠明顯抑制RAW264.7細(xì)胞中IL-6、IL-1β、TNF-α 和COX-2的mRNA表達(dá)，并且具有藥物劑量依賴性。

UBC13；小鼠巨噬細(xì)胞；炎癥因子；基因表達(dá)

泛素化是蛋白質(zhì)翻譯后的重要修飾方式。泛素結(jié)合酶(E2)家族中，UBC13是唯一能夠參與Lys63多聚泛素鏈形成的泛素結(jié)合酶，并參與調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和其他細(xì)胞過程，例如DNA損傷修復(fù)，激活和調(diào)節(jié)天然免疫系統(tǒng)和獲得性免疫系統(tǒng)[1]。泛素結(jié)合酶UBC13與其他2種不具有催化功能的小分子蛋白Mms2和Uev1A形成Lys63泛素鏈，這2種小分子又被稱為E2樣配體蛋白。其中UBC13-Mms2二聚物參與細(xì)胞核內(nèi)Lys63泛素鏈的形成負(fù)責(zé)DNA損傷應(yīng)答[2]，而UBC13-Uev1A二聚物參與胞漿內(nèi)Lys63泛素鏈的形成是核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)激活的必要因素[3-4]。

巨噬細(xì)胞除了參與炎癥反應(yīng)，還是天然免疫和獲得性免疫系統(tǒng)中重要成員。巨噬細(xì)胞的主要作用是吞噬外來病原微生物和分泌促炎因子，如IL-6、IL-1β、TNF-α、COX-2和iNOS。本試驗(yàn)以實(shí)驗(yàn)室前期研究為背景，利用重組蛋白UBC13作用于RAW264.7細(xì)胞，探討其對RAW264.7細(xì)胞相關(guān)炎癥因子mRNA表達(dá)量的影響，為后期關(guān)于重組蛋白UBC13免疫調(diào)節(jié)功能的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞系，中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 重組蛋白UBC13由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)臨床獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供；二甲基亞砜(DMSO)，Solarbio公司產(chǎn)品；胎牛血清(FBS)，Biological Industries公司產(chǎn)品；DMEM培養(yǎng)基，Hyclone公司產(chǎn)品；噻唑藍(lán)(MTT)，Amresco公司產(chǎn)品；0.25%胰酶，Gibco公司產(chǎn)品；Trizol試劑，Invitrogen公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，TaKaRa公司產(chǎn)品；2×SYBR Green qPCR Master Mix，Biotool公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 多功能酶標(biāo)儀，Molecular Devices公司產(chǎn)品；倒置熒光顯微鏡，Olympus公司產(chǎn)品；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，Heal force公司產(chǎn)品；ABI 7500定量PCR儀，Life公司產(chǎn)品；核酸蛋白濃度測定儀，NanoDrop公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 RAW264.7細(xì)胞復(fù)蘇后用含有100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素和10% FBS的DMEM培養(yǎng)基于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至90%時(shí)，棄去孔內(nèi)的培養(yǎng)基，進(jìn)行藥物處理試驗(yàn)。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞活力 生長對數(shù)期的RAW264.7細(xì)胞以4×105個(gè)/mL密度接種于96孔板，待細(xì)胞生長至90%時(shí)加入不同濃度UBC13蛋白溶液(320、160、80、40、20、10、5 μg/mL)。以細(xì)胞組為對照，每組設(shè)置6個(gè)重復(fù)。24 h后每孔加入20 μL MTT (0.5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入100 μL DMSO，37℃培養(yǎng)20 min后酶標(biāo)儀490 nm波長處讀取吸光值。

1.2.3 特異性引物設(shè)計(jì) 采用NCBI在線引物設(shè)計(jì)工具進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)，小鼠IL-6、IL-1β、TNF-α、COX-2和β-actin基因序列和產(chǎn)物大小見表1。

表1 本試驗(yàn)所用引物序列

1.2.4 細(xì)胞總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄 生長對數(shù)期的RAW264.7細(xì)胞以4×105個(gè)/mL密度接種于6孔板，待細(xì)胞生長至90%時(shí)，按以下方式進(jìn)行分組。細(xì)胞組：只加2%的DMEM培養(yǎng)基；試驗(yàn)組：每組加入不同濃度的UBC13蛋白溶液(20、10 、5 μg/mL)。分別于3、6、9、12、24 h共5個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，按照Invitrogen Trizol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA，Nanodrop測定RNA濃度及純度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行cDNA合成：去除gDNA，1 μg RNA中加入gDNA Eraser 1 μL，5×gDNA Eraser buffer 1 μL，用ddH2O將總體積補(bǔ)齊至10 μL 42℃反應(yīng)2 min; cDNA合成，向已去除DNA的樣品中加入PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL,RT Prime Mix 1 μL,5×PrimeScript buffer 4 μL,ddH2O 4 μL。

1.2.5 qPCR法檢測UBC13對細(xì)胞炎癥因子表達(dá)量的影響 根據(jù)2×SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒說明書，取10 μL 2×SYBR Green qPCR Master Mix，上下游引物各1 μL，1 μL cDNA和7 μL dH2O進(jìn)行擴(kuò)增。采用ABI 7500 Real-time PCR系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增：95℃ 30 s，95℃ 5 s,60℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)，然后經(jīng)過95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 30 s及60℃ 15 s進(jìn)行熔解曲線分析。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。以β-actin為內(nèi)參基因，根據(jù)Ct值，采用2-△△CT法分別進(jìn)行計(jì)算。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，利用One-way analysis of variance (ANOVA)方法確定各組間的差異性，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 UBC13對RAW264.7細(xì)胞活性影響

結(jié)果如圖1所示，高濃度UBC13蛋白對RAW264.7細(xì)胞活性有顯著抑制作用。故篩選RAW264.7細(xì)胞存活率為90%以上的UBC13蛋白濃度為試驗(yàn)濃度，篩選得到的藥物濃度分別為20、10、5 μg/mL。

圖1 UBC13對細(xì)胞活力的影響

2.2 UBC13對RAW264.7細(xì)胞TNF-α mRNA表達(dá)量的影響

結(jié)果如圖2所示，藥物作用3 h和6 h時(shí)，藥物處理組各組TNF-α mRNA表達(dá)量均高于正常組，其中3 h 10 μg/mL組和5 μg/mL組TNF-α mRNA表達(dá)量顯著高于正常組(P<0.05)；6 h藥物處理組各組TNF-α mRNA表達(dá)量顯著高于正常組(P<0.05)；藥物作用9 h時(shí)，藥物處理組各組TNF-α mRNA表達(dá)量與正常組相比無顯著性差異(P>0.05)，其中20 μg/mL組TNF-α mRNA表達(dá)量低于正常組，10 μg/mL組和5 μg/mL組TNF-α mRNA表達(dá)量高于正常組；藥物作用12 h時(shí)，藥物處理組各組TNF-α mRNA表達(dá)量均低于正常組，但無顯著性差異(P>0.05)；藥物作用24 h時(shí)，藥物處理組各組TNF-α mRNA表達(dá)量顯著低于正常組(P<0.05)。且各時(shí)間點(diǎn)TNF-α mRNA表達(dá)量的變化均體現(xiàn)出藥物濃度依賴性。

2.3 UBC13對RAW264.7細(xì)胞IL-6 mRNA表達(dá)量的影響

藥物作用3 h、6 h和9 h時(shí)，藥物處理組各組IL-6 mRNA表達(dá)量均高于正常組，其中3 h 10 μg/mL組IL-6 mRNA表達(dá)量顯著高于正常組(P<0.05)；6 h 10 μg/mL組和5 μg/mL組IL-6 mRNA表達(dá)量顯著高于正常組(P<0.05)；9 h 10 μg/mL組IL-6 mRNA表達(dá)量顯著高于正常組(P<0.05)；藥物作用12 h時(shí)，藥物處理組各組IL-6 mRNA表達(dá)量均低于正常組，其中20 μg/mL組和10 μg/mL組IL-6 mRNA表達(dá)量顯著低于正常組(P<0.05)；藥物作用24 h時(shí)，藥物處理組各組IL-6 mRNA表達(dá)量顯著低于正常組(P<0.05)。且各時(shí)間點(diǎn)IL-6 mRNA表達(dá)量的變化總體上具有藥物濃度依賴性(圖3)。

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖2 UBC13作用不同時(shí)間后TNF-α mRNA相對表達(dá)量

Fig.2 Relative expression levels of TNF-α mRNA at different time after UBC13 treatment

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖3 UBC13作用不同時(shí)間后IL-6 mRNA相對表達(dá)量

Fig.3 Relative expression levels of IL-6 mRNA at different time after UBC13 treatment

2.4 UBC13對RAW264.7細(xì)胞COX-2 mRNA表達(dá)量的影響

結(jié)果如圖4所示，藥物作用3 h時(shí)，藥物處理組各組COX-2 mRNA表達(dá)量顯著高于正常組(P<0.05)；藥物作用6 h時(shí)，20 μg/mL組COX-2 mRNA表達(dá)量低于正常組，10 μg/mL組和5 μg/mL組COX-2 mRNA表達(dá)量高于正常組，其中5 μg/mL組COX-2 mRNA表達(dá)量顯著高于正常組(P<0.05)；藥物作用9 h時(shí)，20 μg/mL組和10 μg/mL組COX-2 mRNA表達(dá)量均低于正常組，5 μg/mL組COX-2 mRNA表達(dá)量顯著高于正常組(P<0.05)；藥物作用12 h時(shí)，藥物處理組各組COX-2 mRNA表達(dá)量均低于正常組，其中20 μg/mL組和10 μg/mL組COX-2 mRNA表達(dá)量顯著低于正常組(P<0.05)；藥物作用24 h時(shí)，藥物處理組各組COX-2 mRNA表達(dá)量均顯著低于正常組(P<0.05)。且各時(shí)間點(diǎn)COX-2 mRNA表達(dá)量的變化均體現(xiàn)出藥物濃度依賴性。

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖4 UBC13作用不同時(shí)間后COX-2 mRNA相對表達(dá)量

Fig.4 Relative expression levels of COX-2 mRNA at different time after UBC13 treatment

2.5 UBC13對RAW264.7細(xì)胞IL-1β mRNA表達(dá)量的影響

結(jié)果如圖5所示，藥物作用3 h和6 h時(shí)，藥物處理組各組IL-1β mRNA表達(dá)量均高于正常組，其中6 h 10 μg/mL組和5 μg/ml組IL-1β mRNA表達(dá)量顯著高于正常組(P<0.05)；藥物作用9 h時(shí)，20 μg/mL組和10 μg/mL組IL-1β mRNA表達(dá)量均低于正常組，其中20 μg/mL組IL-1β mRNA表達(dá)量顯著低于正常組(P<0.05)，5 μg/mL組IL-1β mRNA表達(dá)量顯著高于正常組(P<0.05)；藥物作用12 h時(shí)，藥物處理組各組IL-1β mRNA表達(dá)量均低于正常組，其中20 μg/mL組IL-1β mRNA表達(dá)量顯著低于正常組(P<0.05)；藥物作用24 h時(shí)，藥物處理組各組IL-1β mRNA表達(dá)量顯著低于正常組(P<0.05)。且各時(shí)間點(diǎn)IL-1β mRNA表達(dá)量的變化均體現(xiàn)出藥物濃度依賴性。

3 討論

炎癥是由細(xì)菌感染或化學(xué)損傷引發(fā)的一個(gè)復(fù)雜過程，在抵抗各種病原微生物入侵中起關(guān)鍵作用[5-6]。此外，炎癥反應(yīng)是機(jī)體產(chǎn)生的一種自我保護(hù)性反應(yīng)。細(xì)菌感染和化學(xué)損傷引起的損傷導(dǎo)致細(xì)胞炎癥因子的產(chǎn)生，包括單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α和IL-6。然而過度的炎癥反應(yīng)又會(huì)引發(fā)自身免疫性疾病，例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡[7]。所以，保持免疫環(huán)境穩(wěn)定是維持機(jī)體生理功能正常的基本要求。在炎癥過程中，巨噬細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)的主要組成部分。巨噬細(xì)胞的活化是動(dòng)物天然免疫系統(tǒng)激活的首要反應(yīng)，被激活的巨噬細(xì)胞能夠通過LPS/TLR4-NF-κB通路產(chǎn)生的TNF-α、NO和IL-6參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)[8]。本試驗(yàn)首先檢測重組蛋白UBC13對RAW264.7細(xì)胞活力的影響，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，藥物濃度在20 μg/mL以內(nèi)對細(xì)胞無明顯的毒副作用，所以選擇20 μg/mL、10 μg/mL和5 μg/mL濃度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖5 UBC13作用不同時(shí)間后IL-1β mRNA相對表達(dá)量

Fig.5 Relative expression levels of IL-1β mRNA at different time after UBC13 treatment

細(xì)胞因子是一類具有廣泛生物學(xué)活性且功能復(fù)雜的小分子蛋白質(zhì)，TNF-α主要由單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，被視為炎癥反應(yīng)中最為重要的細(xì)胞因子之一，能夠引起急性炎癥性疾病并引發(fā)組織損傷[9-10]。IL-6也是誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要細(xì)胞因子，它能促進(jìn)淋巴細(xì)胞的分化，同其他炎性因子協(xié)同作用放大炎癥反應(yīng)[11]。環(huán)氧化酶-2(COX-2)是機(jī)體催化花生四稀酸轉(zhuǎn)變?yōu)榍傲邢偎氐南匏倜福哂蟹糯笱装Y反應(yīng)的作用[12-13]。因此，IL-6、IL-1β、TNF-α 和COX-2作為炎癥標(biāo)志物，對驗(yàn)證藥物是否具有免疫調(diào)節(jié)功能存在指導(dǎo)性作用。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在整個(gè)試驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)范圍內(nèi)IL-6、IL-1β、TNF-α 和COX-2 mRNA表達(dá)量呈現(xiàn)逐步降低的趨勢，并且各時(shí)間點(diǎn)基因表達(dá)量的變化體現(xiàn)出一定的藥物劑量依賴性。其中，3、6、9 h時(shí)藥物組各因子mRNA表達(dá)量總體要高于正常組，但是個(gè)別藥物組各因子mRNA表達(dá)量已經(jīng)低于正常組；12 h時(shí)，藥物組各因子mRNA表達(dá)量低于正常組；24 h 藥物組各因子mRNA表達(dá)量顯著低于正常組；以上結(jié)果說明重組蛋白UBC13在24 h對炎癥因子mRNA的表達(dá)量有一定的抑制作用。但是UBC13在不同時(shí)間點(diǎn)對各因子mRNA表達(dá)量的影響具體機(jī)制還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Effects of Recombinant UBC13 on mRNA Expressions of Inflammatory Cytokines in RAW264.7 Cells

ZHANG Liang,YI Yan-yan,TAO Jia-li,DUAN Ma-kui,JIANG Jun-bing*
(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,ShanxiAgriculturalUniversity,Taigu,Shanxi,030801,China)

To investigate the effects of recombinant UBC13 on mRNA expressions of the inflammatory cytokines in RAW264.7 cells,the viability of cells was measured by using MTT assay.qPCR method was used to detect the effects of different concentrations (20,10， 5 μg/mL) of UBC13 on the mRNA expression levels of IL-6,IL-1β,TNF-α and COX-2 at 3,6,9,12，24 h.The results showed that the mRNA expressions of IL-6,IL-1β,TNF-α and COX-2 decreased gradually at the whole stage of the experiment.The mRNA expressions of IL-6,IL-1β,TNF-α and COX-2 were significantly decreased in UBC13 treatment group at 24 h (P<0.05),comparing with the cell group.Our results indicated that the UBC13 could significantly inhibits the mRNA expressions of IL-6,IL-1β,TNF-α and COX-2 in RAW264.7 cells at 24 h in a dose-dependent manner.

UBC13; RAW264.7; inflammatory cytokine; gene expression

2017-01-21

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目(20100312016)

張 亮(1990-)，男，內(nèi)蒙古鄂爾多斯人，碩士研究生，主要從事動(dòng)物生化與分子免疫學(xué)研究。*通訊作者

S852.2

A

1007-5038(2017)06-0020-04