豬流行性腹瀉病毒山西分離株全基因組序列分析

劉文俊，樊振華，王娟萍，姚敬明，吳 忻，孟 帆，韓一超，薛翼鵬，米瑞娟，李紅麗，趙 岳

(山西省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原 030032)

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豬流行性腹瀉病毒山西分離株全基因組序列分析

劉文俊，樊振華*，王娟萍，姚敬明，吳 忻，孟 帆，韓一超，薛翼鵬，米瑞娟，李紅麗，趙 岳

(山西省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原 030032)

用RT-PCR擴增分離的一株PEDV CH-SXCH11-2015的全基因組序列，測序拼接后，進行了序列分析。CH-SXCH11-2015全長28 038 bp比CV777長5 bp，與BJ-2011-1同源性最高，為98.9%；與LZC、SM98同源性最低，為96.6%。S基因全長均為4 161 bp，突變主要發(fā)生在S1區(qū)，同源性分析表明，CH-SXCH11-2015核苷酸同源性與BJ-2011-1和CH/ZJJS-Z/2012的最高為98.9%，與SM98同源性最低為93.6%，與CV777、CV777vaccine同源性分別為94.2%和93.8%。CH-SXCH11-2015 S基因氨基酸同源性與CH/ZJJS-Z/2012的最高為98.3%，與CV777vaccine、SQ2012同源性最低為91.8%，與CV777的同源性為92.9%。ORF3基因全長均為675 bp，無核苷酸插入和缺失，同源性分析表明，CH-SXCH11-2015的ORF3基因與CH/HBQX/10核苷酸同源性最高，為99.3%，與CV777 truncated核苷酸同源性最低，為90.6%。CH-SXCH11-2015的ORF3基因推導的氨基酸與(CH/HBQX/10、CH/S、CH/SHH/06、 CH/TJ-2012、CH/ZKXH/11、CPF299、GZGY-10、PFF188、PFF285)同源性最高，為98.7%；與CV777 truncated毒株最低，為88%。CH-SXCH11-2015的ORF3基因與CV777、attenuated DR13的核苷酸同源性分別為96.6%和97.6%，氨基酸同源性分別為95.1%和97.1%。遺傳進化分析表明，CH-SXCH11-2015全基因組、S基因、ORF3基因與2010年以后我國分離的毒株親緣關系較近，與CV777、2個疫苗株(attenuated DR13、CV777vaccine)的親緣關系較遠。

豬流行性腹瀉病毒；全基因組序列；序列分析

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的豬的一種急性、高度傳染性腸道傳染病，臨床上以嘔吐、水樣腹瀉和脫水死亡為特征[1]。該病1978年首次報道于比利時和英國[2-3]，1984年宣化等證實該病在我國存在[4]。2010年10月，中國南方暴發(fā)PED[5]，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。2014年冬季至2015年春季，山西部分規(guī)模化豬場暴發(fā)哺乳仔豬腹瀉病，臨床主要表現為哺乳仔豬水樣腹瀉、嚴重脫水和嘔吐，發(fā)病率和病死率高達90%～100%，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經濟損失。為了查清山西豬流行性腹瀉的流行情況，課題組對山西11個地市的30個規(guī)模化豬場的仔豬腹瀉發(fā)病情況進行了流行病學調研，并對采集的253份病料進行豬流行性腹瀉病毒、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)檢測，PEDV陽性率為73.26%，TGEV陽性率為7.36%。表明山西豬群發(fā)生的腹瀉，主要是由豬流行性腹瀉病毒引起。課題組從陽性病料中分離出一株PEDV，命名為CH-SXCH11-2015。本研究通過對基因組序列的分析，為PED防控提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 2015年從山西某種豬場采集的疑似PED病料中分離出一株PEDV，命名為CH-SXCH11-2015。

1.1.2 主要試劑 RNAiso Plus、PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit、PremixTaqTM、DNA Marker DL2000、pMD18-T Vector購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自上海生工生物工程技術服務有限公司；E.coliDH5α菌株購自天根生物科技(北京)有限公司；乙醇、異丙醇、氯仿等試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物的設計與合成 根據GenBank中收錄的PEDV CV777、CH/FJND-3/2011全基因組序列，設計了31對引物，引物序列見表1。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.2 病毒總RNA的提取 按RNAiso Plus試劑盒操作說明書，從細胞培養(yǎng)液中提取病毒基因組RNA，用適量的DEPC水溶解，置-20℃保存，備用。

1.2.3 PEDV全基因組的擴增、克隆和測序 以提取的RNA為模板制備cDNA，參照Prime ScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit操作說明書進行。在PCR管中依次加入，RNase free H2O 7 μL、RNA 1 μL 、dNTP 1 μL，下游引物1 μL；混勻后，65℃保溫5 min后，冰上迅速冷卻；在上述的PCR管加入5×Prime Script Ⅱ buffer 4 μL、RNase Inhibitor 0.5 μL、 PrimeScript Ⅱ RTase 1 μL、 RNase free dH2O 4.5 μL。緩慢混勻，30℃、10 min，42℃、60 min，95℃保溫5 min，冰上放置。PCR反應體系：PremixTaq25 μL，上下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，滅菌蒸餾水21 μL，混勻后進行擴增。擴增反應條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 80 s，35個循環(huán)；再72℃延伸10 min。取10 μL PCR擴增產物進行15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果。將PCR產物純化后與pMD18-T載體連接，轉化DH5a感受態(tài)細胞，經鑒定后將陽性菌液送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

表1 擴增PEDV全基因序列的引物

1.2.4 PEDV全基因組、S和ORF3基因的序列比較分析 參考CV777毒株的全基因組序列，用DNAMAN將測得的序列進行拼接。用MegAlign分析CH-SXCH11-2015與GenBank中收錄的國內外PEDV參考毒株的全基因組序列和S、ORF3基因同源性和變異情況，并用MEGA5.0分析CH-SXCH11-2015與參考毒株之間遺傳進化關系。

2 結果

2.1 全基因組序列序列分析

用DNAMAN將測得的序列進行拼接，結果顯示，CH-SXCH11-2015毒株全長28038bp，基因結構為5’UTR-ORF1-S-ORF3-E-M-N-3’UTR，符合PEDV基因組的特征。同源性分析表明，CH-SXCH11-2015與BJ-2011-1同源性最高，為98.9%；與LZC、SM98同源性最低，為96.6%。用MEGA5.0分析CH-SXCH11-2015毒株與GenBank中收錄的其他PEDV毒株的遺傳進化關系，結果見圖1。由圖1可見，PEDV毒株可分為2個群，G1包括CV777、我國2010年以前分離的的毒株(LZC、CH/S)和3個韓國毒株(SM98、attenuated DR13、virulent DR13)。CH-SXCH11-2015與5個我國2010年及以后分離的毒株(CH/FJND-3/2011、CH/HNLH/2015、SD2014、CHYJ130330、BJ-2011-1)組成G2群。結果表明CH-SXCH11-2015與我國2010以后分離的毒株親緣關系較近，與CV777、我國早期分離的的毒株(LZC、CH/S)和3個韓國毒株(SM98、attenuated DR13、virulent DR13)親緣關系較遠。

圖1 基因PEDV全基因組序列構建的遺傳進化分析

2.2 S基因序列分析

2.2.1 S基因序列變化 CH-SXCH11-2015株S基因全長均為4161bp，與CV777比較，既存在堿基位點突變，又存在堿基的插入和缺失現象。在170～171之間插入AAACCAGGGTGT12個堿基，在401～402之間插入TAA，在467-474位之間缺失TGGAAA。共有251個堿基發(fā)生突變，其中S1區(qū)有183個堿基發(fā)生突變。CH-SXCH11-2015株S基因推導的氨基酸與CV777比較，在58～59位之間插入QGVN，在135-136位之間插入N，在153-156位之間缺失DG，共有97個氨基酸發(fā)生突變，其中在S1區(qū)發(fā)生突變的氨基酸有72個，占發(fā)生突變的氨基酸比例為74.23%。

2.2.2 S基因同源性分析 CH-SXCH11-2015株S基因核苷酸同源性與BJ-2011-1和CH/ZJJS-Z/2012的最高為98.9%，與SM98同源性最低為93.6%，與CV777、CV777vaccine同源性分別為94.2%、93.8%。CH-SXCH11-2015株S基因氨基酸同源性與CH/ZJJS-Z/2012的最高為98.3%，與CV777vaccine、SQ2012同源性最低為91.8%，與CV777的同源性為92.9%。

2.2.3 S基因的遺傳進化分析 CH-SXCH11-2015株S基因與GenBank已收錄的PEDV的23株進行比對，構建進化樹，見圖2。由圖2可知，PEDV毒株可分為2個群(G1和G2)。G1群又可分為2個亞群(G1-1和G1-2)，G1-1包括，4株2010年以前分離的中國株(LJB/03、LZC、JS-2004-2、CH/S、)、2014年分離的SQ2014、4株韓國毒株(attenuated DR13、virulent DR13、KPEDV-9、SM98)、1株日本毒株83P-5、 CV777vaccine、CV777。CH-SXCH11-2015與9個2010年以后我國分離的毒株(CH/HNQX-3/14、CH/FHND-3/2011、CHYJ130330、BJ-2011-1、CH/ZJJS-Z/2012、FJ-PT/2013、SH1404、CH/HNLH/2015、SD2014)組成G1-2群。1個韓國毒株Chinju99和1個日本毒株KH組成G2群。結果表明，CH-SXCH11-2015與2010年以后我國流行毒株(除SQ2014)的親緣關系較近，與2010年以前我國流行毒株、2個日本株、5個韓國株、2個疫苗株(attenuated DR13、CV777vaccine)、CV777的親緣關系較遠。

2.3 ORF3基因的序列分析

2.3.1 ORF3基因序列變化 CH-SXCH11-2015毒株的ORF3基因全長均為675 bp，與CV777 ORF3基因比較相比，無核苷酸插入和缺失，有23個相同的核苷酸突變，分別為：62、 162、 360、 393位核苷酸由T→C，54、160、235、301位核苷酸由G→A，63、237 、243 264、274、369、439、450位核苷酸由C→T，238、546位核苷酸由T→G，438位核苷酸由T→A，497位核苷酸由A→G， 616位核苷酸由A→T，630位核苷酸由A→C，631位核苷酸由T→A。CH-SXCH11-2015毒株的ORF3基因推導的氨基酸與CV777相比，第21位氨基酸由V→A，第54、79位由V→I，第80位F→V，第92由L→F，第101由A→T，第165由N→S，第182由H→Q。CH-SXCH11-2015毒株的ORF3基因與attenuated DR13比較，在244-245位之間多了51個核苷酸，推導的氨基酸序列比attenuated DR13在81-82位氨基酸之間多了17個氨基酸。

2.3.2 ORF3基因同源性分析 CH-SXCH11-2015與CH/HBQX/10核苷酸同源性最高，為99.3%，與CV777 truncated核苷酸同源性最低，為90.6%。CH-SXCH11-2015的ORF3基因推導的氨基酸與(CH/HBQX/10、CH/S、CH/SHH/06、CH/TJ-2012、CH/ZKXH/11、CPF299、GZGY-10、PFF188、PFF285)同源性最高，為98.7%；與CV777 truncated毒株最低，為88%。CH-SXCH11-2015的ORF3基因與CV777、attenuated DR13的核苷酸同源性分別為96.6%和97.6%，氨基酸同源性分別為95.1%和97.1%。

圖2 基因PEDV S基因序列構建的遺傳進化樹

圖3 基因PEDV ORF3基因組序列構建的遺傳進化樹

2.3.3 ORF3基因的遺傳進化分析 CH-SXCH11-2015的ORF3基因與GenBank已收錄的PEDV的ORF3基因序列比對，利用MEGA5.0建進化樹(圖3)。由圖3可知，PEDV毒株可分為2大群(G1和G2)，其中G1群又可分為3個亞群(G1-1、G1-2和G1-3)。CH-SXCH11-2015與11個我國2010年以來分離的毒株(CH/HNLH/2015、GZGY-01、BJ-2011-1、CH/HBQX/10、CH/HNQX-3/14、CH/ZJHZHY-6/2013、SH5、CH/TY/12、CH/TJ-2012、CH/ZKXH/11、CH/FJND-3/2011)和2009分離的CH/JL/09組成G1-1。G1-2群包括1個我國2010年以前我國分離的毒株(CH/SHH/06)、1個我國2010年以后我國分離的毒株(SD2014)和3個韓國毒株(PFF188、PFF285、CPF299)。G1-3群包括我國早期分離的毒株CH/S、3個韓國毒株(Chinju99、virulent DR13、attenuated DR13)和CV777 truncated。CV777、Brl/87、LZC組成G2群。遺傳進化關系：CH-SXCH11-2015毒株與11個我國2010年以來分離的毒株(CH/HNLH/2015、GZGY-01、BJ-2011-1、CH/HBQX/10、CH/HNQX-3/14、CH/ZJHZHY-6/2013、SH5、CH/TY/12、CH/TJ-2012、CH/ZKXH/11、CH/FJND-3/2011)的親緣關系較近，與CV777、LZC、Brl/87、2個弱毒株(attenuated DR13和CV777 truncated)親緣關系較遠。

3 討論

用DNA Man將測得的序列進行拼接，結果顯示，CH-SXCH11-2015毒株全長28 038 bp，基因結構為5’UTR-ORF1-S-ORF3-E-M-N-3’UTR，符合PEDV基因組的特征。CH-SXCH11-2015比CV777多5個堿基，是由于CH-SXCH11-2015的5UTR比CV777少了4個堿基，S基因比CV777多了9個堿基。全基因組序列分析表明，CH-SXCH11-2015與2010年以后分離的毒株位于同一亞群，親緣關系較近，同源性為98.3%～98.9%。2010年以前分離的2個毒株(CH/S、LZC)，3個韓國毒株(SM98、virulent DR13、 attenuated DR13)和CV777位于另一亞群，與CH-SXCH11-2015的親緣關系較遠，同源性為96.6%～97.3%。

CH-SXCH11-2015的S基因全長均為4 161 bp， 與CV777比較，共有251個堿基發(fā)生突變，其中S1區(qū)有183個堿基發(fā)生突變。氨基酸序列比較，共有97個氨基酸發(fā)生突變，其中在S1區(qū)發(fā)生突變的氨基酸有72個，占發(fā)生突變的氨基酸比例為74.23%，表明突變主要發(fā)生在S1區(qū)，這一結果與鄭逢梅[6]、劉艷成[7]等的結果一致。遺傳進化樹分析表明，CH-SXCH11-2015與2010年以后我國流行毒株的親緣關系較近，與2010年以前我國流行毒株、疫苗株的親緣關系較遠。

CH-SXCH11-2015的ORF3基因與GenBank已收錄PEDV進行對比分析，CH-SXCH11-2015與11個2010年以來我國各地方分離的毒株和2009年我國分離的CH/JL/09毒株親緣關系較近，與CV777、LZC、Brl/87、2個弱毒株(attenuated DR13和CV777 truncated)親緣關系較遠。Park[8]等研究發(fā)現，經過細胞適應的毒株比親本毒株和野生毒株的ORF3基因有51個核苷酸的缺失。CH-SXCH11-2015與attenuated DR13比較，在244～245之間多了51個核苷酸，表明CH-SXCH11-2015為野毒株。CH-SXCH11-2015 的ORF3與CV777基因相比，無核苷酸插入和缺失，有多處核苷酸發(fā)生變異，與董彥鵬[9]、顧超逸[10]、黃冬妮[11]等分離的毒株既有相同的變異位點，又有不同的變異位點，可能是由于受到各個地方當地的環(huán)境、免疫壓力或藥物等因素的影響產生不同變異，變異的多樣性，增加了PED的防控難度。

本研究對2015年從山西發(fā)病豬群中分離的PEDV毒株CH-SXCH11-2015進行了遺傳變異分析，結果表明，CH-SXCH11-2015全基因與弱毒株attenuated DR13親緣關系較遠，CH-SXCH11-2015的S基因和ORF3基因與弱毒株attenuated DR13和CV777親緣關系較遠。因此，PEDV發(fā)生變異，現在的疫苗不能提供很好的保護，可能是PED流行的主要原因?，F在急需從變異毒株中篩選新的疫苗毒株，用來防控PED的流行。

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Analysis of Complete Genome Sequence of Porcine Epidemic Diarrhea Virus CH-SXCH11-2015

LIU Wen-jun,FAN Zhen-hua,WANG Juan-ping,YAO Jing-ming,WU Xin,MENG Fan,HAN Yi-chao,XUE Yi-peng,MI Rui-juan,LI Hong-li,ZHAO Yue
(InstitutionofAnimalHusbandryandVeterinary,ShanxiAcademyofAgriculturalSciences,Taiyuan030032,China)

Through the RT-PCR method,the complete genome sequence of CH-SXCH11-2015 was amplified,and the sequence data were assembled and analyzed by using Lasergene software (DNAstar Inc.,USA).The complete genome sequence of PEDV CH-SXCH11-2015 is 28 038 nucleotides (nt) in length,and has 5 bp longer than that of CV777.The highest sequence homology of the complete genome sequence of CH-SXCH11-2015 with that of BJ-2011-1 was 97.6%,and the lowest sequence homology of CH-SXCH11-2015 with LZC and SM98 was 96.6%.The length of S gene of CH-SXCH11-2015 was 4161 nucleotides,and was 9 bp longer than that of CV777 strain.The mutations of the S gene of CH-SXCH11-2015 occurred mainly in the S1 region.The CH-SXCH11-2015 had the highest nucleotide homology of 98.9% with BJ-2011-1 and CH/ZJJS-Z/2012,had the lowest nucleotide homology of 93.6% with SM98,and had the nucleotide homologies of 94.2%,93.8% with CV777,vaccine strain-CV777,respectively.The amino acid homology of S gene of CH-SXCH11-2015 was highest of 98.3% with CH/ZJJS-Z/2012,and the lowest homology of 91.8%with CV777vaccine and SQ2012,and the homology was 92.9% with CV777.The ORF3 gene of CH-SXCH11-2015 was 675bp in length,and no nucleotide insertion and deletion.The ORF3 gene of CH-SXCH11-2015 had the highest nucleotide homology of 99.3% with CH/HBQX/10,had the lowest nucleotide homology of 93.6% with CV777 truncated,and had the nucleotide homologies of 96.6% and 95.1% with CV777 and attenuated DR13,respectively.The amino acid homology of ORF3 gene of CH-SXCH11-2015 was highest of 98.7% with CH/HBQX/10,CH/S,CH/SHH/06,CH/TJ-2012,CH/ZKXH/11,CPF299,GZGY-10,PFF188,PFF285,and the lowest homology of 88%withCV777 truncated,and the homologies were 97.6% and 97.1% with CV777 and attenuated DR13.Phylogenetic analysis showed that complete genome sequence,S gene,ORF3 gene of CH-SXCH11-2015 have close relationship with the strains isolated in China after 2010,and have genetically quite distant(far genetic relationship) from CV777,and 2 different strains of vaccine strains (attenuated DR13,CV777vaccine).

Porcine epidemic diarrhea virus; complete genome sequence; sequence analysis

2016-09-28

山西省科技攻關項目(20140311020-2-A)；山西省科技攻關項目(20150311018-3)

劉文俊(1979-)，男，山西河津人，助理研究員，碩士，主要從事動物疫病分子生物學研究。*通訊作者

S852.65

A

1007-5038(2017)06-0006-07