豬繁殖與呼吸綜合征病毒主要流行毒株檢測方法的建立

郭振華，陳鑫鑫，郭軍慶，喬松林

(河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室，河南鄭州 450002)

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研究論文

豬繁殖與呼吸綜合征病毒主要流行毒株檢測方法的建立

郭振華，陳鑫鑫，郭軍慶，喬松林*

(河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室，河南鄭州 450002)

旨在建立針對豬繁殖與呼吸綜合征病毒田間主要流行毒株的鑒別診斷方法。通過比對當前田間主要流行毒株的基因序列，分別設計了針對ORF5基因的通用引物和針對Nsp2基因的鑒別引物。RT-PCR結果顯示，兩對引物針對不同的毒株均可以擴增出特異性的目的條帶，通用引物可以用來檢測田間主要的流行毒株，鑒別引物可以區(qū)分當前田間主要流行的不同毒株。所建立的檢測方法具有良好的特異性和敏感性，可以方便地應用于豬繁殖與呼吸綜合征病毒的分子流行病學監(jiān)控和快速檢測診斷，具有良好的應用價值。

豬繁殖與呼吸綜合征病毒；ORF5基因；Nsp2基因；反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)感染引起的，以母豬繁殖障礙和不同年齡段的豬呼吸系統(tǒng)疾病為主要特征的傳染性疫病[1]。美國在1987年首次報道了PRRS的發(fā)生，歐洲在1991年分離到了PRRSV，隨后本病在世界范圍內(nèi)廣泛流行[2]。PRRSV屬于動脈炎病毒科(Arteriviridae)，動脈炎病毒屬(Arterivirus)，有囊膜，基因組為單股正鏈RNA，大小約15 kb，有11個開放閱讀框(open reading frame，ORF)，編碼16個非結構蛋白和8個結構蛋白[3]。

基于基因組序列及抗原特性差異，PRRSV可以分為兩大基因型，即以歐洲型毒株LV為代表的基因Ⅰ型和以美洲型毒株VR-2332為代表的基因Ⅱ型。隨著PRRSV毒株的不斷變異，每個基因型又分為若干個亞型或者譜系(lineage)[1,4,5]。我國在1996年，由郭寶清等首次分離到了PRRSV，命名為CH-1株，隨后PRRSV在我國各地呈流行性狀態(tài)。分子遺傳學分析顯示，我國流行的毒株主要屬于美洲型[6]。2006年，由高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Highly pathogenic PRRSV，HP-PRRSV)導致的PRRS在我國暴發(fā)并大范圍流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大損失。代表性毒株JXA1基因組分析顯示，HP-PRRSV的Nsp2編碼區(qū)具有特征性的不連續(xù)30個氨基酸的缺失(481位和533-561位氨基酸)[7]。之后的分子流行病學研究顯示，HP-PRRSV逐步成為田間流行的優(yōu)勢毒株[5]。2013年以來，一種新的PRRSV變異毒株在田間被檢測到，代表性毒株分子遺傳學分析顯示，該流行毒株與北美地區(qū)流行毒株具有很近的遺傳距離，與北美地區(qū)流行的代表性毒株NADC30在Nsp2編碼區(qū)具有一致的缺失模式——不連續(xù)131個氨基酸的缺失(323-433位、482位、504-522位氨基酸)，隨后的分子流行病學研究顯示，NADC30-like毒株在我國多個地區(qū)呈流行態(tài)勢[8-11]。

因此，目前我國田間流行的PRRSV毒株大致分為3類，即以CH-1a為代表的經(jīng)典類毒株(CH-1a-like strains)，以JXA1位代表的HP-PRRSV類毒株(HP-PRRSV)，以JL580為代表的NADC30-like類毒株(NADC30-like strains)。PRRSV的快速檢測和毒株種類的確定，對于PRRS的防控具有重要的指導意義。目前基于RT-PCR和RT-qPCR技術建立了多種檢測不同PRRSV流行毒株的方法，如針對歐洲型、美洲型和高致病性PRRSV的鑒別診斷[12]。但毒株的確定往往要依賴于ORF5基因的序列測定和分子進化樹分析，對技術人員要求較高，得到結果也需要更長的時間。本研究通過對田間主要流行的代表性毒株進行序列比對分析，設計了針對ORF5基因的通用引物，主要用于不同美洲型毒株的檢測；同時根據(jù)當前主要流行毒株Nsp2編碼區(qū)特征性的堿基序列缺失模式，設計了一對鑒別引物，通過比較RT-PCR產(chǎn)物片段的大小，可以快速確定PRRSV毒株類別的檢測方法。該方法具有良好的敏感性和特異性，具有較好的臨床應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 引物設計參考毒株及GenBanK登錄號分別為：CH-1a(AY032626)、BJ-4(AF331831)HuN4(EF635006)、JXA1(EF112445)、NADC30(JN654459)、JL580(KR706343)；RT-PCR所用模板來源毒株及GenBanK登錄號：BJ-4(AF331831)和HN07由本實驗保存。

1.1.2 主要試劑 病毒基因組提取試劑盒Viral RNA/DNA Extraction Kit、逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(RNase H-)、6聚體隨機引物Hexadeoxyribonucleotide mixture- pd(N)6、Oligo (dT)15 Primer、DL2 000 DNA Marker、Mighty TA-cloning Kit購自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)；TaqPlus Master Mix購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 本研究所使用的引物序列信息見表1。序列比對使用DNA Man軟件進行分析，引物由生工生物(上海)股份有限公司合成。

1.2.2 RNA提取及cDNA的合成 按Viral RNA/DNA Extraction Kit使用說明書從細胞培養(yǎng)物(BJ-4和HN-07)、組織樣品(HNzm1、HNam2、HNhx)中提取總RNA；按照M-MLV(RNase H-)說明書進行反轉(zhuǎn)錄，具體條件為：Hexadeoxyribonucleotide mixture- pd(N)6(100 μmol/L)和Oligo (dT)15 Primer(50 μmol/L)各0.5 μL。反轉(zhuǎn)錄程序：30℃ 10 min，42℃ 60 min，70℃ 15 min，4℃ 10 min。將反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴增 PCR反應體系(25 μL)如下：2 xTaqPlus MasterMix 12.5 μL，cDNA模板2 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反應參數(shù)如下：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共30個循環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物采用15 g/L瓊脂糖凝膠進行電泳分析。

1.2.4 基因克隆與測序 采用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，利用凝膠回收試劑盒回收目的片段，連接pMD19-T載體后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，涂氨芐青霉素抗性的LB平板，37℃培養(yǎng)箱過夜。菌落PCR篩選陽性克隆，PCR反應體系和條件同1.5，最后將陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.2.5 序列分析 利用生物學軟件MEGA6.0對擴增的ORF5基因和參考毒株的ORF5基因進行序列同源性分析，繪制系統(tǒng)進化樹[13]。利用DNA Star MegAlign(Clustal V method)進行比對分析，將測序獲得的Nsp2序列與參考毒株進行多序列比對分析，確定Nsp2編碼區(qū)的序列缺失模式。

1.2.6 特異性和敏感性分析 分別選擇豬瘟病毒(CSFV)、日本腦炎病毒(JEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒(PCV)、豬細小病毒(PPV)的臨床陽性病料，用獲得的cDNA或者DNA作為模板，進行ORF5和Nsp2引物的特異性檢驗。用純化的含有目的基因片段的pMD20-T質(zhì)粒作為標準定量質(zhì)粒，用于ORF5和Nsp2引物的敏感性檢測，基因片段拷貝數(shù)計算公式如下：

Y(拷貝數(shù)/μL)=[質(zhì)粒DNA的濃度(g/μL)/(質(zhì)粒DNA長度bp×660)]×60.2×1023

2 結果

2.1 引物設計

利用DNA Man和DNA Star MegAlign(Clustal V method)生物學軟件，針對CH-1a、BJ-4、HuN4、JXA1、NADC30、JL580等代表性毒株，進行序列比對分析，分別設計了針對ORF5基因的通用引物和針對Nsp2基因的鑒別引物，詳細序列信息見表1。

2.2 ORF5基因RT-PCR擴增結果

利用設計的ORF5通用引物，檢測本實驗室保存的標準毒株BJ-4、HN07以及臨床送檢代表性樣本，均可以獲得特異性的擴增條帶，目的條帶大小約851 bp(圖1)，提示該引物可以用于田間流行PRRSV毒株的檢測。

2.3 基于ORF5基因的分子進化樹分析

將獲得的陽性樣品進行序列測定，進一步通過分子進化樹分析，顯示HN07、HNzm1和HNzm2屬于高致病性毒株，HNhx屬于類NADC30毒株(圖2)，同時也進一步提示針對ORF5基因的引物對當前流行毒株具有很好的通用性。

2.4 Nsp2部分片段擴增結果

利用上述cDNA模板和擴增Nsp2特定區(qū)域的特異性引物，獲得了不同大小的擴增產(chǎn)物其中以經(jīng)典毒株BJ-4為模板的擴增產(chǎn)物大小約1 040 bp，以高致病性毒株HN07、HNzm1、HNzm2為模板的擴增產(chǎn)物大小約950 bp，以NADC30-like毒株HNhx為模板的擴增產(chǎn)物大小約647 bp(圖3)。

表1 引物序列及信息

1～5.樣品BJ-4、HN07、HNzm1、HNzm2、HNhx 1-5.Samples BJ-4,HN07,HNzm1,HNzm2,HNhx

圖2 基于ORF5基因的分子進化樹分析

2.5 Nsp2部分片段序列分析

將擴增產(chǎn)物進行序列測定分析顯示，與經(jīng)典毒株CH-1a相比，HNzm1和HNzm2具有高致病性毒株(JXA1)特征性的氨基酸缺失模式-481為和533-561位不連續(xù)30個氨基酸的缺失；HNhx具有NADC30毒株特征性的缺失模式-323-433位、482位和504-522位不連續(xù)的131個氨基酸的缺失(圖4)。證明本研究所設計的引物可以特異性擴增不同毒株的Nsp2序列，且可以用于區(qū)分3種主要田間流行毒株。

1.BJ-4毒株；2～4.分別為HN07、HNzm1、HNzm2毒株；5.HNhx毒株

1. BJ-4 strain;2-4. HN07、HNzm1、HNzm2 strains;5. HNhx strain

圖3 不同毒株Nsp2基因序列檢測結果

Fig.3 RT-PCR results of Nsp2 gene for different PRRSV strains

2.6 特異性分析

選取了臨床常見的病原來檢驗所設計的引物是否存在非特異擴增。針對豬瘟病毒(CSFV)、日本腦炎病毒(JEV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、偽狂犬病病毒(PRV)、豬圓環(huán)病毒(PCV)、豬細小病毒(PPV)臨床陽性病料的RT-PCR/PCR擴增結果顯示，用作陽性對照的引物均擴增出特定大小的產(chǎn)物，而針對ORF5和Nsp2的引物均未出現(xiàn)非特異的擴增(圖5)。

2.7 敏感性分析

將含有病毒目的基因的pMD20-T載體提取純化，定量后做10倍系列稀釋。PCR結果顯示，針對ORF5基因的擴增在稀釋至10-7時依然可以看到特異性條帶，對應目的基因拷貝數(shù)為2.34×102(圖6 A)；針對Nsp2的擴增在稀釋至10-6時可以獲得清晰的特異性條帶，對應的基因拷貝數(shù)為1.52×103(圖6 B)。提示所建立的檢測方法具有很高的敏感性，適于用于臨床樣本的檢測。

HNzm1、HNzm2具有和JXA1一致的氨基酸缺失模式；HNhx和NADC30具有一致的氨基酸缺失模式 The amino acid deletion pattern of HNzm1 and HNzm2 is consistent with that of JXA1.The HNhx and NADC30 are consistent

1、4、7、10、13、16、19.分別為陽性對照；2、5、8、11、14、17、20.為針對ORF5的引物擴增結果；3、6、9、12、15、18、21.為針對Nsp2引物擴增結果

1，4，7，10，13，16 and 19. Positive control，respectively；2，5，8，11，14，17，20.The ORF5 primer；3，6，9，12，15，18，21. Nsp2 primer

圖5 針對ORF5和Nsp2基因擴增引物的特異性分析

Fig.5 The specificity assay of ORF5 primer and Nsp2 primer

圖6 針對ORF5(A)和×(B)基因擴增引物的敏感性分析

3 討論

豬繁殖與呼吸綜合征是危害養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病，病毒基因組的高變異性、不同毒株間血清學交叉保護反應差是PRRSV的顯著特點。我國自1996年首次分離到PRRSV以來，至今PRRSV在全國范圍內(nèi)流行已有20年，期間PRRSV病毒基因組發(fā)生了較大的變異，毒力和增殖特性也發(fā)生了相應的變化[6,7,9]。如2006年HP-PRRSV在豬群中暴發(fā)給養(yǎng)豬業(yè)造成了沉重打擊。之后雖然開發(fā)出了一系列疫苗，但在實際生產(chǎn)中防控效果不太理想，HP-PRRSV在我國豬場還在流行[1,16-18]。2013年-2014年，一種類NADC30毒株在我國多個地區(qū)(黑龍江、吉林、天津、北京、河南、浙江、福建)流行[10]。NADC30-like毒株是從北美輸入的毒株，且和HP-PRRSV發(fā)生了基因重組，現(xiàn)有PRRS的防控措施對該毒株控制效果較差。

PRRSV在我國經(jīng)過20年的流行變異，對本病的防控構成了嚴重的挑戰(zhàn)。雖然現(xiàn)有的商品疫苗在特定的歷史階段發(fā)揮了重要的作用，但也正是在疫苗大范圍、高強度使用之后，我國的PRRSV毒株變異速率進一步加快、多樣性進一步加大。免疫壓力下對病毒變異的影響、弱毒疫苗潛在的毒力返強風險、疫苗毒株和田間流行毒株發(fā)生重組的風險等，都是當前需要進一步反思的問題。

鑒于當前我國田間主要流行3類PRRSSV毒株，我們通過不同毒株的多序列比對分析，設計了針對ORF5基因的特異性通用引物，該引物可以用于檢測不同PRRSV毒株；根據(jù)目前主要流行毒株Nsp2基因特征性的序列缺失模式，設計了一對特異性的鑒別引物，根據(jù)擴增片段大小的差異，該引物可以用于區(qū)分經(jīng)典的PRRSV毒株、HP-PRRSV毒株和NADC30-like毒株。本研究建立的檢測分析與臨床常見病毒無非特異性反應，利用含有目的基因的標準質(zhì)粒，本方法在目的基因片段低至2.34×102(ORF5)拷貝數(shù)和1.52×103(Nsp2)拷貝數(shù)時依然可以檢出目的片段，說明該方法具有很好的特異性和敏感性，可以用于臨床PRRSV的快速診斷和毒株的初步確定，同時也便于進行進一步的序列測定和分子進化樹分析。本研究對于PRRSV的防控和分子流行病學監(jiān)控具有重要的參考價值。

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Development of a RT-PCR Assay for Detection of Primarily Epidemic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

GUO Zhen-hua1,CHEN Xin-xin1,GUO Jun-qing1,QIAO Song-lin1
(1.HenanKeyLaboratoryofAnimalImmunology,HenanAcademyofAgriculturalSciences,Zhengzhou,Henan,450002,China)

To detect and distinguish the primarily epidemic porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV) strains,we developed a RT-PCR assay method.According to the multiple sequence alignment,we designed two pairs of primers based on ORF5 gene and partial Nsp2 gene sequences respectively.The result of RT-PCR suggested that both of the primers could produce specific objective fragments by cDNA templates from different PRRSV strains.Further，the specificity and sensitivity of this RT-PCR assay were good.It’s very useful and convenient for the quick diagnosis and epidemiological surveillance.

PRRSV; ORF5 gene; Nsp2 gene; RT-PCR

2016-09-29

國家重點研發(fā)計劃(2016YFD0500709)；河南省生豬產(chǎn)業(yè)技術體系創(chuàng)新團隊項目(S2012-06)

郭振華(1984-)，男，執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師，農(nóng)學博士，主要從事豬疫病診斷與防控工作。*通訊作者

S852.65

A

1007-5038(2017)06-0001-05