miR-630在肺腺癌組織中的表達(dá)及其對肺腺癌細(xì)胞遷移侵襲的影響

謝銘芳 唐蒙蒙 丁偉

●基礎(chǔ)研究

miR-630在肺腺癌組織中的表達(dá)及其對肺腺癌細(xì)胞遷移侵襲的影響

謝銘芳 唐蒙蒙 丁偉

目的 研究miR-630在人肺癌組織中的表達(dá)，探討miR-630對肺腺癌細(xì)胞系（A549）細(xì)胞遷移侵襲的影響及其機(jī)制。方法 收集37例肺腺癌組織標(biāo)本及癌旁正常肺組織，通過RT-PCR檢測各標(biāo)本中miR-630、SOX4 mRNA的表達(dá)情況，Pearson相關(guān)分析檢驗miR-630與SOX4的相關(guān)性；通過轉(zhuǎn)染miR-630mimic和miR-630NC至離體培養(yǎng)的A549細(xì)胞中，Western blot檢測A549細(xì)胞中COL1A1、COL1A5、SOX4的表達(dá)情況，劃痕試驗和Transwell法觀察細(xì)胞遷移侵襲情況，熒光素酶素試驗驗證SOX4是miR-630的靶基因。結(jié)果 與癌旁正常肺組織比較，miR-630在肺腺癌組織中的表達(dá)降低（P＜0.05）；肺腺癌組織中SOX4 mRNA的表達(dá)增加（P＜0.01）；miR-630與SOX4 mRNA的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)（r=-0.344，P＜0.01）。與對照組比較，轉(zhuǎn)染miR-630mimic后A549細(xì)胞的遷移侵襲減少（P＜0.01），細(xì)胞中COL1A1、COL1A5、SOX4的表達(dá)減少（均P＜0.05）；熒光素酶試驗結(jié)果顯示，miR-630能夠降低SOX4-3′-UTR質(zhì)粒的熒光素活性（P＜0.05）。結(jié)論 miR-630在肺腺癌組織中低表達(dá)；miR-630可能是通過下調(diào)SOX4抑制A549細(xì)胞的遷移和侵襲。

肺腺癌 微小RNA-630 SOX4 侵襲

microRNAs（miRNAs）是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，可調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[1]。在肺癌細(xì)胞研究中，目前熱門的miRNAs包括miR-630、miR-32、miR-21、miR-34、miR-138、miR-206，但是目前人肺癌組織中這些miRNAs的表達(dá)情況鮮有研究報道。SOX4基因（SRY related high-mobile group box4）屬于SOX基因家族中C亞族，其編碼的蛋白通過HMG盒（high－mobility group DNAbinding domain）與DNA結(jié)合，調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄活化或抑制。已經(jīng)有大量的研究發(fā)現(xiàn)SOX4參與多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，具有抑癌基因和癌基因雙向調(diào)節(jié)功能[2]。抑制SOX4的表達(dá)可以抑制肺癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、食管癌細(xì)胞、宮頸癌細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[3－6]。筆者在預(yù)實驗中通過實時熒光定量PCR檢測15例患者肺腺癌組織、正常肺組織中miR－630、miR－32、miR－21、miR－34、miR－138、miR－206的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR－630和miR－32在肺腺癌組織中表達(dá)減少。本研究擬通過擴(kuò)大樣本量，驗證miR－630在肺癌組織中的表達(dá)情況，及其與SOX4表達(dá)量之間的相關(guān)性關(guān)系，并通過細(xì)胞實驗進(jìn)一步探索miR－630對肺腺癌細(xì)胞遷移侵襲的影響以及SOX4的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2015年4至9月37例肺腺癌患者手術(shù)切取的肺腺癌組織及癌旁正常肺組織（紹興市柯橋區(qū)中醫(yī)醫(yī)院4例，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院胸外科33例），男16例，女21例，年齡41～74（63.7±6.9）歲；所有患者術(shù)前均未行任何放、化療。肺腺癌診斷經(jīng)病理診斷確認(rèn)，TNM分期Ⅰ期患者2例，Ⅱ期患者19例，Ⅲ期患者12例，Ⅳ期患者4例。

1.2 方法

1.2.1 試劑 肺腺癌細(xì)胞株A549購于上海拜力生物公司；胎牛血清（美國GIBCO公司）；DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶（美國Sigma公司）；RNA提取試劑（美國Invitrogen公司）；兔或鼠抗人COL1A1、COL1A5、SOX4、βactin多克隆抗體（美國ABCAM公司）；辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗（美國Jackson公司）；脂質(zhì)體2000（中國上海英駿公司）；Western blot相關(guān)試劑（中國江蘇碧云天生物技術(shù)研究所）。

1.2.2 實驗分組 手術(shù)取下的組織根據(jù)病理結(jié)果分為肺腺癌組、癌旁正常肺組織組；細(xì)胞實驗中，在miR－630mimic轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，將細(xì)胞分為對照組和miR－630 mimic組。

1.2.3 熒光定量RT－PCR檢測miR－630和SOX4 mRNA的表達(dá) 提取組織或細(xì)胞中總RNA，將提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系為20μl，反應(yīng)條件為：37℃反轉(zhuǎn)錄15min，85℃反轉(zhuǎn)錄酶失活5s，4℃保存。運(yùn)用SYBR Green法檢測miR－630、SOX4 mRNA的表達(dá)情況，運(yùn)用的反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性15min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共循環(huán)40次；最后72℃延伸8 min。每組樣品重復(fù)3次，試驗重復(fù)3次，統(tǒng)計分析各標(biāo)本中miR－630和SOX4 mRNA的表達(dá)。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達(dá)量 提取細(xì)胞中總蛋白，BCA法定量蛋白，SDS－PAGE膠每孔加入30μl的樣品，70V 30min進(jìn)行蛋白濃縮，100V 2h進(jìn)行蛋白電泳，并用孔徑0.45μm的PVDF膜250mA 90min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后常溫下TBST洗膜3次、封閉1h后，以1∶1 000濃度加入兔（鼠）抗人COL1A1一抗（或抗COL1A5、SOX4、β－actin一抗），4℃孵育過夜，常溫下TBST洗膜3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔（鼠）二抗（1∶5 000）孵育后ECL化學(xué)發(fā)光法檢測?？逻_(dá)膠片暗室顯影，Quantity one軟件分析。

1.2.5 轉(zhuǎn)染細(xì)胞株 過表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：miR－630mimic由上海吉瑪公司設(shè)計合成，miR－630mimic序列為：正義鏈：5′－AGUAUUCUGUACCAGGGAAGGU－3′，反義鏈：3′－ACCUUCCCUGGUACAGAAUACU－5′。轉(zhuǎn)染：將A549細(xì)胞系接種至6孔板，生長至50%～70%密度時，以脂質(zhì)體2 000轉(zhuǎn)染miR－630mimic或miR－630NC，各100pmol 24h后，提取總RNA/蛋白后，PCR/Western blot鑒定轉(zhuǎn)染效率，進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.2.6 細(xì)胞劃痕實驗（Wound Healing）測定A549細(xì)胞遷移 A549細(xì)胞先用1.8mmol/L羥基脲作用12h抑制細(xì)胞增殖，100μl槍頭垂直孔板制造細(xì)胞劃痕，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS沖洗孔板3次。拍照記錄0、24h后劃痕圖片，用image pro plus6.0軟件分析計算細(xì)胞遷移面積。

1.2.7 Transwell法測定細(xì)胞侵襲 A549細(xì)胞先用血清饑餓使細(xì)胞同步化，1.8mmol/L羥基脲作用12h用抑制細(xì)胞增殖，用0.25%胰蛋白酶消化A549細(xì)胞后，用DMEM培養(yǎng)基（1%血清）配成細(xì)胞懸液并計數(shù)（5×104個/ml）。各組24孔板配套Transwell小室（0.8μm）上室加入200μl的細(xì)胞懸液，下室加入含有10%FBS的培養(yǎng)液500μl，分別培養(yǎng)24h。以棉簽擦去上層未穿透膜的A549細(xì)胞，取下Transwell半透膜，PBS洗3次，用3.7%多聚甲醛室溫固定5min，再用PBS洗3次，用1mg/ml的結(jié)晶紫染色，PBS洗3次，倒置顯微鏡每組隨機(jī)取5個視野觀察計數(shù)并記錄穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.2.8 熒光素酶試驗 設(shè)計合成SOX4－3′－UTR的序列及突變序列，以SOX4質(zhì)粒為載體，分別構(gòu)建能夠表達(dá)熒光素酶的包含SOX4－3′－UTR和SOX4－3′－UTR突變序列的質(zhì)粒，然后將A549細(xì)胞系按每孔1×105接種至24孔板，24h后以脂質(zhì)體2000共轉(zhuǎn)染200ng包含SOX4－3′－UTR或SOX4－3′－UTR突變序列的熒光素酶質(zhì)粒和 80ng海腎熒光質(zhì)粒以及 60pmol miR－630－mimic或?qū)φ眨?8h后用熒光檢測儀測熒光強(qiáng)度，海腎熒光作為內(nèi)參照，每組試驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，兩組間比較用t檢驗；SOX4 mRNA表達(dá)量與miR-630表達(dá)量間相關(guān)性分采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

2.1 癌旁正常肺組織、肺腺癌組織中miR-630和SOX4 mRNA的表達(dá) 檢測發(fā)現(xiàn)miR-630在肺癌組織中表達(dá)減少，SOX4 mRNA在肺癌組織中表達(dá)升高，與癌旁正常肺組織比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；相關(guān)性分析結(jié)果顯示SOX4 mRNA的表達(dá)量與miR-630的表達(dá)量之間呈負(fù)相關(guān)（r=-0.3928，P＜0.01），見圖1。

2.2 miR-630對A549細(xì)胞侵襲遷移的影響 miR-630mimic轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，miR-630組中A549的遷移均較對照組減少（均P＜0.01），見圖2a-b（插頁）。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，miR-630組 A549細(xì)胞中COL1A1和COL1A5與細(xì)胞遷移密切相關(guān)的蛋白表達(dá)均較對照組減少（均P＜0.01），見圖2c（插頁）。

圖1 癌旁正常肺組織、肺腺癌組織中miR-630和SOX4 mRNA表達(dá)情況（a：miR-630在癌旁正常肺組織、肺腺癌組織中的表達(dá)情況；b：SOX4 mRNA在肺組織、肺腺癌組織中的表達(dá)情況；c：miR-630與SOX4 mRNA的相關(guān)性；與癌旁正常肺組織比較，*P＜0.01）

2.3 miR-630通過識別3′-UTR抑制SOX4的表達(dá)Western blot檢測結(jié)果顯示，miR-630 mimic組A549細(xì)胞中SOX4的表達(dá)較對照組明顯降低（P＜0.01），見圖3。分別構(gòu)建包含SOX4-3′-UTR和其突變序列的熒光素酶質(zhì)粒，見圖4a。與miR-630mimic或者miR-630NC共轉(zhuǎn)A549細(xì)胞，培養(yǎng)24h后，檢測各組細(xì)胞中熒光素酶活性。實驗結(jié)果顯示，miR-630mimic+WT-SOX4-3′-UTR組熒光素酶活性低于miR-630NC+WT-SOX4-3′-UTR組（P＜0.01），見圖4b。

圖3 miR-630抑制SOX4的表達(dá)（與對照組比較，*P＜0.01）

圖4 miR-630通過識別3′-UTR抑制SOX4的表達(dá)（a：miR-630與SOX4-3′UTR靶向結(jié)合示意圖；b：各組熒光素酶活性，與對照組比較，*P＜0.01）

3 討論

轉(zhuǎn)移和侵襲是腫瘤基本的生物學(xué)特征，不僅跟腫瘤細(xì)胞的黏附能力下降、侵襲性增強(qiáng)有關(guān)，還與腫瘤組織中血管生成、細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的降解及間質(zhì)重構(gòu)等過程密切相關(guān)[7]。因此，抑制肺腺癌細(xì)胞侵襲和遷移對臨床治療肺腺癌有重要意義[8]。

miRNAs是一類高度保守的小分子非編碼單鏈RNA，大量的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)miRNAs參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[9]。本研究檢測了癌旁正常肺組織以及肺腺癌組織中miR-630的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-630在肺腺癌組織中的表達(dá)減少。miR-630是一種抑癌miRNAs，參與調(diào)節(jié)多種與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)蛋白的表達(dá)，可調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[10-13]。據(jù)此結(jié)果，筆者選擇進(jìn)一步研究miR-630對肺腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響。在離體實驗中，筆者發(fā)現(xiàn)miR-630mimic抑制A549細(xì)胞的遷移和侵襲，同時還可以下調(diào)COL1A1和COL1A5這兩個與腫瘤遷移侵襲密切相關(guān)的蛋白的表達(dá)。

SOX4基因?qū)儆赟OX C亞族，主要在胚胎發(fā)育過程中的心臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胸腺高表達(dá)。此外，SOX4還在一些干細(xì)胞和祖細(xì)胞中高表達(dá)，對干細(xì)胞的穩(wěn)定和分化具有重要的調(diào)控作用。因此，SOX4基因突變、缺失或者過表達(dá)不僅僅會引起先天性疾病，還與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。已有研究結(jié)果顯示，SOX4基因在多種腫瘤組織中表達(dá)升高[2]。Shen等[14]和Wang等[15]研究還發(fā)現(xiàn)SOX4基因的表達(dá)與多種腫瘤患者預(yù)后相關(guān)，并預(yù)測SOX4可以作為腫瘤治理的一個靶向位點(diǎn)。此外，近期的研究發(fā)現(xiàn)miR-211通過靶向抑制SOX4的表達(dá)從而抑制SGC-7901細(xì)胞的侵襲。與上述研究結(jié)果相符，本研究顯示，相比于肺癌旁組織，SOX4在肺腺癌組織中表達(dá)升高，并且與miR-630的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果提示在肺腺癌中，miR-630可能也可以通過下調(diào)SOX4發(fā)揮抑制細(xì)胞遷移侵襲的作用。在之后的離體實驗中，本研究組進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在用miR-630mimic干預(yù)A549細(xì)胞后，細(xì)胞中SOX4的表達(dá)減少。熒光素酶實驗顯示miR-630可以與SOX4的3′-UTR靶向結(jié)合。在預(yù)先用SOX4過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 A549細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)過表達(dá) SOX4可以增加COL1A1和COL1A5的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)miR-630對A549細(xì)胞遷移侵襲的抑制作用。以上結(jié)果提示miR-630是通過下調(diào)SOX4的表達(dá)，從而發(fā)揮抑制A549細(xì)胞遷移侵襲的作用。

本實驗通過實時熒光定量PCR檢測正常肺組織和肺腺癌組織中miR-630和SOX4 mRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-630在肺腺癌組織中表達(dá)減少、SOX4在肺腺癌組織中表達(dá)增加，兩者之間呈負(fù)相關(guān)。之后在離體實驗中證實miR-630可以抑制A549細(xì)胞的侵襲遷移，并進(jìn)一步通過熒光素酶試驗證實miR-630結(jié)合SOX4-3′-UTR的序列，為肺腺癌的治療提供新的思路。

[1] Song J H,Meltzer S J.MicroRNAs in pathogenesis,diagnosis,and treatment ofgastroesophagealcancers[J].Gastroenterology,2012, 143(1):35-47.

[2]Yoon TM,Kim S A,Cho WS,et al.SOX4 expression is associated with treatment failure and chemoradioresistance in oralsquamous cellcarcinoma[J].BMC Cancer,2015,15:888.

[3] LiY,Zu L,Wang Y,et al.miR-132 inhibits lung cancer cellmigration and invasion by targeting SOX4[J].J Thorac Dis,2015,7(9): 1563-1569.

[4] Zhao G,Guo Y,Chen Z,et al.miR-203 Functions as a Tumor Suppressor by Inhibiting Epithelial to Mesenchymal Transition in Ovarian Cancer[J].J Cancer SciTher,2015,7(2):34-43.

[5] Hanieh H.Aryl hydrocarbon receptor-microRNA-212/132 axis in human breast cancer suppresses metastasis by targeting SOX4 [J].MolCancer,2015,14:172.

[6] Sun R,Jiang B,QiH,et al.SOX4 contributes to the progression of cervical cancer and the resistance to the chemotherapeutic drug through ABCG2[J].CellDeath Dis,2015,6:e1990.

[7] Yio X,Diamond M,Zhang J Y,et al.Trefoil factor family-1 mutations enhance gastric cancer cellinvasion through distinct signaling pathways[J].Gastroenterology,2006,130(6):1696-1706.

[8]周仲樓,丁陽,安建宏.腺苷對人肺腺癌細(xì)胞A549增殖和細(xì)胞周期的影響[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2010,40(04):378-380,385.

[9] Zhao Y,SamalE,Srivastava D.Serum response factor regulates a muscle-specific microRNAthat targets Hand2 during cardiogenesis[J].Nature,2005,436(7048):214-220.

[10]Chen WX,Zhang Z G,Ding Z Y,et al.MicroRNA-630 suppresses tumor metastasis through the TGF-beta-miR-630-Slug signaling pathway and correlates inversely with poor prognosis inhepatocellular carcinoma[J].Oncotarget,2016,7(16):22674-22686.

[11] Zhang J W,Li Y,Zeng X C,et al.miR-630 overexpression in hepatocellular carcinoma tissues is positively correlated with alpha-fetoprotein[J].Med SciMonit,2015,21:667-673.

[12] Zhou C X,Wang C L,Yu A L,et al.MiR-630 suppresses breast cancer progression by targeting metadherin[J].Oncotarget, 2016,7(2):1288-1299.

[13] Corcoran C,Rani S,Breslin S,et al.miR-630 targets IGF1R to regulate response to HER-targeting drugs and overall cancer cellprogression in HER2 over-expressing breast cancer[J].Mol Cancer,2014,13:71.

[14] Shen H,Blijlevens M,Yang N,et al.Sox4 Expression Confers Bladder Cancer Stem Cell Properties and Predicts for Poor Patient Outcome[J].Int J BiolSci,2015,11(12):1363-1375.

[15] Wang C Y,Hua L,Sun J,et al.MiR-211 inhibits cell proliferation and invasion of gastric cancer by down-regulating SOX4[J].Int J Clin Exp Pathol,2015,8(11):14013-14020.

Expression of miR-630 in lung adenocarcinoma and its effect on tumor migration and invasion

XIE Mingfang，TANG Mengmeng, DING Wei,et al.Department of Clinical Laboratory,Shaoxing Keqiao Hospital of Traditional Chinese Medicine,Shaoxing 312030, China

Lung adenocarcinoma miR-630 Sex determining region Y-box 4 Invasion

2016-12-01）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.12.2016-2015

浙江省自然科學(xué)基金項目（LY14H0200002）

312030 紹興市柯橋區(qū)中醫(yī)醫(yī)院檢驗科（謝銘芳）；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院病理科（唐蒙蒙、丁偉）

丁偉，E-mail:dingweihz1977@163.com

【 Abstract】 Objective To investigate the expression of miR-630 in lung adenocarcinoma and its effect on tumor invasion and metastasis. Methods The expressions of miR-630 and SOX4 mRNA were detected by RT-PCR in 37 samples of lung adenocarcinoma tissue and matched normal lung tissue.Pearson correlation analysis was performed to test the correlation of miR-630 with SOX4 mRNA.Human lung adenocarcinoma A549 cells were transfected with miR-630.The migratory ability of A549 cells was tested by wound healing and Transwell assays;the expressions of COL1A1,COL1A5 and SOX4 in A549 cells were detected by Western blotting;Luciferase assay was used to confirmed whether SOX4-3'-UTR was the target gene of miR-630. Results Compared with normal lung tissue,the expression of miR-630 was decreased and SOX4 mRNA was significantly increased in lung adenocarcinoma (P＜0.05,P＜0.01).Pearson correlation analysis showed that miR-630 was negatively correlated with SOX4 mRNA (r=-0.344,P＜0.01).In vitro experiment,compared with the wild A549 cells,the expressions of COL1A1,COL1A5 and SOX4 were decreased in the miR-630-transfected A549 cells(P＜0.01).The migration activity of A549 cells was decreased after transfected with miR-630(P＜0.01).The Luciferase activity of the SOX4-3′-UTR plasmid was significantly suppressed by miR-630(P＜0.00). Conclusion The expression of miR-630 is down-regulated in lung adenocarcinoma;miR-630 inhibits migration and invasion ofA594 cells,indicating that SOX4-3′-UTR may be its targeting gene.