木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)SSR標(biāo)記的遺傳多樣性分析*

楊漢波 張 蕊 王幫順 徐肇友 陳煥偉 周志春

(1. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所 浙江省林木育種技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 311400； 2. 浙江省龍泉市林業(yè)科學(xué)研究院 龍泉 323700)

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木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)SSR標(biāo)記的遺傳多樣性分析*

楊漢波1張 蕊1王幫順2徐肇友2陳煥偉2周志春1

(1. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所 浙江省林木育種技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州 311400； 2. 浙江省龍泉市林業(yè)科學(xué)研究院 龍泉 323700)

【目的】 利用SSR標(biāo)記深入研究木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)的遺傳多樣性，揭示其遺傳多樣性地理分布特點(diǎn)及種質(zhì)間遺傳關(guān)系，為木荷種質(zhì)資源的保護(hù)和育種親本的選擇提供理論依據(jù)。【方法】 利用10對(duì)SSR引物，分析我國(guó)5個(gè)省份24個(gè)地區(qū)的734份木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)。利用CERVUS、GenAIEx 6.5、NTSYS、Arlequin和STRUCTURE 2.3軟件進(jìn)行無效等位基因檢測(cè)、遺傳參數(shù)估算、主坐標(biāo)分析、聚類圖構(gòu)建、遺傳變異分析及遺傳結(jié)構(gòu)分析?！窘Y(jié)果】 10對(duì)引物共檢測(cè)到105個(gè)等位基因(Na)，平均每個(gè)引物為10.5個(gè)，ss16引物檢測(cè)到的等位基因數(shù)最多，為16個(gè)。Shannon’s信息指數(shù)(I)變化范圍為1.121～1.908，平均值為1.473； 多態(tài)信息指數(shù)(PIC)范圍為0.557～0.807，平均值為0.668； 平均期望雜合度(He)和觀測(cè)雜合度(Ho)分別為0.713和0.735。木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)的主坐標(biāo)(PCoA)和遺傳結(jié)構(gòu)分析基本可以保持一致，供試734份木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)可被分為3個(gè)PCoA類群，而在遺傳結(jié)構(gòu)上可劃分為5個(gè)群組。24個(gè)種質(zhì)群體間遺傳距離范圍為0.030～0.804，平均為0.230，表明群體間的親緣關(guān)系較近，但仍有部分種質(zhì)群體間存在較遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，如HNSZ和GDSX，JXFY和FJSX等； 不同種質(zhì)群體Shannon’s信息指數(shù)(I)變化范圍為0.980～1.431，遺傳多樣性與地理分布不完全相關(guān)。STRUCTURE分析表明，71.1%的木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)遺傳組分相對(duì)比較單一，28.9%的種質(zhì)遺傳背景比較復(fù)雜。分子方差分析(AMOVA)表明，供試的木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)有5.91%的遺傳變異存在于群體間，而94.09%的遺傳變異來自于群體內(nèi)?！窘Y(jié)論】 木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)存在豐富的遺傳多樣性，各群體間遺傳多樣性水平相差較大。在木荷雜交育種親本選配時(shí)不僅要考慮地理遠(yuǎn)緣，還應(yīng)考慮親本群體(個(gè)體)間的親緣關(guān)系。

木荷； 優(yōu)樹； SSR標(biāo)記； 遺傳多樣性； 遺傳結(jié)構(gòu)

種質(zhì)資源的收集是林木育種的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。截止2013年底，我國(guó)已收集保存各類林木種質(zhì)資源16萬份。多樣性的評(píng)價(jià)和遺傳背景的研究是種質(zhì)資源利用的前提(Chuanfuetal., 2008)。許多學(xué)者借助表型性狀變異開展植物種質(zhì)資源遺傳多樣性研究(王永康等， 2014； Zekaetal., 2015)。然而，由于某些性狀受環(huán)境因素和生長(zhǎng)期的影響，基于形態(tài)和生長(zhǎng)性狀對(duì)種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究具有一定的局限性，不能準(zhǔn)確反映種質(zhì)資源個(gè)體間的遺傳差異和親緣關(guān)系(Terzopoulosetal., 2008)。自20世紀(jì)90年代以來，具有共顯性、高分辨率和重復(fù)性好等特點(diǎn)的SSR(Simple Sequence Repeat)標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于作物及多年生木本植物的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析中，并取得了一系列的成果(Ferr?oetal., 2015； 趙爽等， 2016； Lassoisetal., 2016)。另外，在種質(zhì)親緣關(guān)系研究中，主坐標(biāo)分析(PCoA)與STRUCTURE分析方法的結(jié)合已得到許多應(yīng)用。對(duì)于遺傳標(biāo)記結(jié)果，主坐標(biāo)分析(PCoA)通過相似性進(jìn)行個(gè)體區(qū)分，可以清晰地顯示個(gè)體間的相互關(guān)系； STRUCTURE分析采用混合模型，可以對(duì)所有個(gè)體進(jìn)行劃分，反映群體的遺傳結(jié)構(gòu)本質(zhì)，還可以根據(jù)個(gè)體等位基因的組分?jǐn)?shù)，推斷群體中具有復(fù)雜遺傳背景的個(gè)體或者發(fā)生遷移的個(gè)體，對(duì)群體中的個(gè)體進(jìn)行歸屬判斷(Sunetal., 2003； 宗緒曉等， 2010)。如在林木親緣關(guān)系研究中，采用主坐標(biāo)(PCoA)與STRUCTURE 2種分析方法相結(jié)合處理鵝掌楸(Liriodendronchinense)(楊愛紅等， 2014)、紅椿(Toonaciliata)(李培等， 2016)等分子標(biāo)記數(shù)據(jù)，得到了更為準(zhǔn)確、豐富的遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果。

木荷(Schimasuperba)為山茶科(Theaceae)木荷屬(Schima)常綠大喬木，自然分布于31°N以南105°E以東的廣大地區(qū)，是該區(qū)域常綠闊葉林的主要建群種。木荷早期速生，材性優(yōu)良，抗逆性強(qiáng)，亦是我國(guó)南方各省區(qū)的珍貴優(yōu)質(zhì)闊葉用材和高效生物防火樹種，在商品用材林和生態(tài)防火林建設(shè)中占有重要地位(張蕊等， 2013； 楚秀麗等， 2014)，以珍貴優(yōu)質(zhì)用材和高效生物防火為目標(biāo)的木荷育種研究已成為林木育種學(xué)家研究的重點(diǎn)。作者所在研究組自2001年開展木荷育種工作以來，經(jīng)過不斷搜集、補(bǔ)充，目前已保存國(guó)內(nèi)5個(gè)省份24個(gè)地區(qū)的木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)734份，并借助表型標(biāo)記開展了木荷地理種源遺傳變異研究(張萍等， 2004； 周志春等， 2006； 王秀花等， 2011)。本研究在辛娜娜等(2015)對(duì)部分木荷育種親本進(jìn)行遺傳多樣性分析的基礎(chǔ)上，利用SSR標(biāo)記進(jìn)一步對(duì)搜集保存的全部木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，擬通過大規(guī)模樣本間的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)的詳細(xì)系統(tǒng)比較和分析，全面揭示我國(guó)木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)遺傳多樣性地理分布特點(diǎn)和種質(zhì)群體(個(gè)體)間的遺傳關(guān)系，為我國(guó)木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)的深入研究和開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也為我國(guó)木荷的長(zhǎng)期多目標(biāo)育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

研究材料來源于浙江省龍泉市林業(yè)科學(xué)研究院上圩基地木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)基因庫(kù)(28°03′N, 119°06′E)?；孛娣e為6.7 hm2，海拔200～300 m，相對(duì)濕度79%，年均降雨量1 664.8～1 706.2 mm。2010年至今，在浙江、江西、福建等地選擇優(yōu)樹1 000余株，嫁接保存734份。選優(yōu)林分要求林齡20年、面積1.0 hm2以上，以木荷為主的優(yōu)良天然林或起源明確的人工林； 優(yōu)樹選擇條件為樹型高大，干形通直圓滿，生長(zhǎng)量明顯高于附近3～5株同齡優(yōu)勢(shì)木等。以本地1～2年生木荷容器苗為砧木，在3—4月份選用帶有休眠芽的穗條，采用切接的方法嫁接優(yōu)樹無性系，在苗圃地集中培育2年生大容器嫁接苗，然后根據(jù)木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)基因庫(kù)配置圖(株行距為4 m×4 m)將嫁接苗移栽定植至基因庫(kù)相應(yīng)的位置上。將所有木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)按照產(chǎn)地來源分為24個(gè)種質(zhì)群體(表1)， 2015年6月，對(duì)全部734份木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)采集其頂端新發(fā)枝條上的新鮮嫩葉，將其放入液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)來源
Tab. 1 Origin ofSchimasuperbagermplasms

群體Population數(shù)量Number來源OriginGDXS32廣東各縣市GuangdongHNSZ22湖南桑植Sangzhi,HunanHNCB30湖南城步Chengbu,HunanHNQY23湖南祁陽(yáng)Qiyang,HunanJXSY48江西上猶Shangyou,JiangxiJXTG5江西銅鼓Tonggu,JiangxiJXCY21江西崇義Chongyi,JiangxiJXLN21江西龍南Longnan,JiangxiJXYT10江西鷹潭Yingtan,JiangxiJXXF56江西信豐Xinfeng,JiangxiJXFY7江西分宜Fenyi,JiangxiZJSC24浙江遂昌Suichang,ZhejiangZJLQ57浙江龍泉Longquan,ZhejiangZJQY28浙江慶元Qingyuan,ZhejiangFJLC48福建連城Liancheng,FujianFJNP57福建南平Nanping,FujianFJYX54福建尤溪Youxi,FujianFJFZ9福建福州Fuzhou,FujianFJYA30福建永安Yong’an,FujianFJSW21福建邵武Shaowu,FujianFJJO65福建建甌Jian’ou,FujianFJGT49福建古田Gutian,FujianFJSX9福建沙縣Shaxian,FujianFJSC8福建順昌Shunchang,Fujian總計(jì)Total734

1.2 基因組DNA提取及SSR擴(kuò)增

采用試劑盒提取木荷基因組DNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA純度和完整性，NanoDrop-2000超微量分光光度計(jì)(Thermo，美國(guó))檢測(cè)其濃度，最后稀釋成20 ng·μL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆?。本研究選用13對(duì)條帶清晰、多態(tài)性強(qiáng)的SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(辛娜娜等， 2015)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Touch上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系25 μL： 含12.5 μL 2×Taq Plus Master Mix, 10 μmol·L-1上下游引物和50 ng基因組DNA。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?95 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s(35個(gè)循環(huán))； 72 ℃延伸10 min (辛娜娜等， 2015)。擴(kuò)增產(chǎn)物在Qsep100TM全自動(dòng)核酸蛋白自動(dòng)分析系統(tǒng)上進(jìn)行電泳分離檢測(cè)和片段大小的測(cè)定，Qsep100TM能以1～4 bp的分辨率高效區(qū)分20～20 000 bp DNA片段 (http://www.sciencemag.org/content/348/6241/1383.1.full)。

1.3 遺傳參數(shù)分析

對(duì)SSR檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行峰圖分析及等位基因的讀取，然后采用Cervus 3.0.7軟件(Kalinowskietal., 2007)計(jì)算多態(tài)信息含量(PIC)，并檢測(cè)各SSR位點(diǎn)的無效等位基因(null alleles)頻率，去除無效等位基因頻率超過0.2的引物組合，以確保后續(xù)遺傳多樣性分析結(jié)果的準(zhǔn)確性(文亞峰等， 2013)。利用GenAlEx6.502軟件(Peakalletal.， 2012)對(duì)結(jié)果進(jìn)行遺傳多樣性分析。分別計(jì)算： 1)等位基因數(shù)(Na)； 2)有效等位基因數(shù)(Ne)； 3)Shannon’s信息多樣性指數(shù)(I)； 4)觀測(cè)雜合度(Ho)與期望雜合度(He)； 5)群體間Nei’s遺傳相似系數(shù)和遺傳距離，并利用NTSYS pc 2.1軟件(Rohlf , 2000)繪制基于UPGMA法的樹狀聚類圖。利用GenAlEx6.502軟件，計(jì)算各木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)個(gè)體間的遺傳距離，并進(jìn)行主坐標(biāo)(PCoA)分析。用Arlequin軟件對(duì)群體間和種群內(nèi)分子遺傳變異進(jìn)行AMOVA分子方差分析(Excoffieretal., 2010)。

1.4 群體遺傳結(jié)構(gòu)和模擬聚類分析

利用Genepop 4.5軟件(Rousset, 2008)，采用馬爾科夫鏈方法(Markov chain method，MC)對(duì)SSR位點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，得到無偏估計(jì)P值，當(dāng)P<0.05表明連鎖不平衡具有顯著性。采用軟件STRUCTURE 2.3(Pritchardetal., 2000)進(jìn)行木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)遺傳結(jié)構(gòu)分析。這一軟件分析目的在于找到個(gè)體合適的分組數(shù)，K值。首先確定K值取值范圍為1～20，然后運(yùn)行軟件，對(duì)每個(gè)K值進(jìn)行個(gè)體分組分析，每個(gè)K值重復(fù)運(yùn)行100次，參數(shù)iterations和burn-in period均設(shè)為10 000。再根據(jù)Evanno等(2005)提供的ΔK方法確定合適的分組K值。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR位點(diǎn)多態(tài)性分析

13對(duì)SSR引物中，有7對(duì)引物的無效等位基因(null alleles)頻率為正值，其中ss01、ss24和ss30的無效等位基因頻率均大于0.2，并且顯著偏離哈迪-溫伯格平衡(表2)，因此，在后續(xù)遺傳多樣性分析中去除這3個(gè)位點(diǎn)以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。篩選出的10對(duì)引物組合能準(zhǔn)確獲得不同材料在不同位點(diǎn)的等位基因片段大小及相應(yīng)的電泳峰圖(圖1)。10對(duì)SSR引物在734份木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)中擴(kuò)增出105個(gè)等位基因(Na)，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出10.5個(gè)等位基因，有效等位基因數(shù)(Ne)為3.756(表2)。 10對(duì)木荷SSR引物間存在較大的差異，其中，等位基因數(shù)(Na)最多的引物是ss16，為16個(gè)，其有效等位基因數(shù)(Ne)為4.245； 其次是ss32、ss22，Na均為14個(gè)，Ne分別為5.874個(gè)和4.868個(gè)；Na最少的是引物ss02和ss13，均為6個(gè)，Ne分別為2.602個(gè)和2.677個(gè)。10對(duì)SSR引物的多態(tài)信息含量(PIC)范圍為0.557～0.807，平均值為0.668，表明所選的SSR引物在木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)上多態(tài)性豐富。期望雜合度(He)和觀測(cè)雜合度(Ho)的變化范圍分別為0.616(ss02)～0.830(ss32)和0.431(ss02)～0.965(ss22)，平均分別為0.713和0.735。Shannon’s信息多樣性指數(shù)(I)變化范圍為1.121～1.908，平均為1.473，這表明木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)具有較豐富的遺傳多樣性。

表2 13對(duì)SSR引物在全部參試種質(zhì)中的遺傳多樣性參數(shù)①Tab. 2 The genetic diversity parameters of 13 SSR primers in all tested collections of Schima superba

①Na: 等位基因數(shù);Ne: 有效等位基因數(shù);I: Shannon’s信息指數(shù);Ho: 觀測(cè)雜合度;He: 期望雜合度; PIC: 多態(tài)信息含量。下同。括號(hào)內(nèi)為去除無效等位基因頻率大于0.2的SSR引物后的10對(duì)引物的遺傳多樣性參數(shù)。*** ：P<0.001。

Na: Number of different alleles;Ne: Number of effective alleles;I: Shannon’s information index;Ho: Observed heterozygosity;He: Expected heterozygosity; PIC: Polymorphic information content. The same below. The parameters in brackets are the parameters of genetic diversity for remainder 10 primers which removing the primers of which the frequency of null alleles is higher than 0.2. *** :P<0.001.

圖1 引物ss12，ss16，ss22和ss24在部分材料中的電泳圖譜Fig.1 The part of electrophoretogram of primer ss12, ss16, ss22 and ss24

2.2 群體遺傳變異及結(jié)構(gòu)分析

24個(gè)種質(zhì)群體的有效等位基因數(shù)(Ne)變化范圍較大，在2.593(HNSZ)～3.647(FJJO)之間(表3)。各參試群體的Shannon’s信息指數(shù)(I)變化在0.980(JXFY)～1.431(FJJO)之間，平均為1.246。觀測(cè)雜合度(Ho)最小的是 HNSZ(0.545)，最大的是JXTG(0.820)， JXLN次之(0.781)，平均為0.725。期望雜合度(He)最小的是HNSZ(0.516)，最大的是FJJO(0.709)，平均為0.645。部分群體的有效等位基因數(shù)(Ne)和Shannon’s信息指數(shù)(I)的變化趨勢(shì)不一致，如FJNP的Ne高于FJYX,而二者的I值均為1.338，HNCB的Ne高于FJYX，但I(xiàn)卻低于FJYX。同樣，部分群體的觀察雜合度(Ho)和期望雜合度(He)也表現(xiàn)出這種不一致的變化趨勢(shì)。AMOVA分析結(jié)果(表4)顯示，木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)群體間的遺傳變異為5.91%，而群體內(nèi)遺傳變異顯著，為94.09%。

表3 24個(gè)木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)群體的遺傳多樣性Tab. 3 Genetic diversity of 24 Schima superba plus tree clone populations

表4 24個(gè)種質(zhì)群體的AMOVA分析Tab. 4 Analysis of molecular variance for 24 germplasm populations

連鎖不平衡(LD)檢測(cè)結(jié)果顯示各SSR位點(diǎn)間不存在連鎖，處于完全獨(dú)立狀態(tài)(表5)。STRUCTURE分析中，ΔK在K=5時(shí)有明顯的峰(圖2)，因此將734份木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)分為5個(gè)群組，并繪制出遺傳結(jié)構(gòu)圖(圖3)。分析各木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)在不同群組的Q值，發(fā)現(xiàn)522份種質(zhì)(71.1%)在某一群組中的Q值大于0.5，推測(cè)其遺傳組分相對(duì)比較單一，被劃分到5個(gè)群組中的1個(gè)，而剩余的212份(28.9%)在5個(gè)群組中Q值均小于0.5，沒有明確的群組歸屬特性，形成了1個(gè)混合群(mixed group)(表6)。GDSX中的96.9%(31份)歸屬于1個(gè)群組(綠色群組)，Q平均值為0.88，僅1份種質(zhì)劃分到混合群，表明該群體遺傳組分相對(duì)單一。來自FJSC(8份，100%)、FJSX(8份，88.9%)和HNSZ(22份，100%)的大部分種質(zhì)被歸為1個(gè)群組(黃色群組)，表明它們的遺傳結(jié)構(gòu)相似。參試木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)遺傳結(jié)構(gòu)與地理分布不完全相關(guān)，如JXSY、FJNP和JXXF等群體的種質(zhì)材料在5個(gè)群組中均有分布。

表5 10個(gè)SSR位點(diǎn)的連鎖不平衡檢驗(yàn)結(jié)果(P值)Tab. 5 Linkage disequilibrium test result of 10 SSR loci (P value)

圖2 待定群體數(shù)K與估計(jì)值ΔK的關(guān)系Fig.2 Relations between the number of determined group K and estimated value ΔK

2.3 親緣關(guān)系分析

主坐標(biāo)(PCoA)分析結(jié)果顯示，734份木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)可分為A、B和C 3個(gè)類群(圖4)。A類群所包含的種質(zhì)數(shù)量最多，占全部種質(zhì)的41%，B、C 2個(gè)類群所包含的種質(zhì)數(shù)量差異不大，分別占材料總數(shù)的29.7%和29.3%。5個(gè)省(市)的種質(zhì)在3個(gè)類群中均有分布，3個(gè)類群間有少量相互滲透的現(xiàn)象。A類群的典型代表是HNSZ(20份)、ZJSC(14份)和ZJQY(16份)等， B類群的典型代表是FJSW(13份)、HNCB(16份)和 FJFZ(4份)等，C類群的典型代表有FJYX(37份)、JXFY(4份)和GDSX(27份)等?？傮w上看，福建、浙江和江西的資源在大范圍內(nèi)呈分散分布，說明其遺傳背景寬廣?；趦蓛蓚€(gè)體間遺傳距離的主坐標(biāo)(PCoA)分析與遺傳結(jié)構(gòu)分析聚類結(jié)果基本可以保持一致： A類群與粉紅色和黃色群組對(duì)應(yīng)，B類群與紅色群組和藍(lán)紫色群組相對(duì)應(yīng)，C類群與綠色群組對(duì)應(yīng)； 群體結(jié)構(gòu)分析中劃分到混合群體的材料在PCoA分析中也被劃分到與Q值最大的類群所對(duì)應(yīng)的區(qū)域，或與該區(qū)域較近的位置。

圖3 參試木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)遺傳結(jié)構(gòu)分組Fig.3 Estimated population STRUCTURE for Schima superba resources populations圖中5種顏色表示5個(gè)不同的群組，每條彩色豎線代表一份種質(zhì)，不同顏色所占比例越大，則該種質(zhì)被劃分到相應(yīng)群組的可能性就越大。Each germplasm is represented by a single color line; there are five population groups; the more proportion of the color, the more possibility of the represented germplasm by the color divided into the corresponding population.

群組Group種質(zhì)數(shù)Numberofgermplasm所占比例Percent(%)代表種質(zhì)群體(材料數(shù))Representativepopulations(Numberofaccessions)紅色群組Red9512.9FJSW(11)綠色群組Green7910.8GDSX(31)藍(lán)紫色群組Blue-purple13618.5FJYX(33)、JXXF(25)粉紅色群組Pink9212.5ZJSC(14)黃色群組Yellow12016.3FJSC(8)、HNSZ(22)、FJSX(8)混合群組Mixedgroup21228.9JFXY(4)

圖4 基于10對(duì)SSR引物的734份木荷種質(zhì)二維PCoA分析Fig.4 Two-dimension principal coordinate analysis of the 734 Schima superba accessions based on 10 SSR primer pairs

為進(jìn)一步探明種質(zhì)遺傳多樣性與地理來源的相關(guān)性，對(duì)24個(gè)種質(zhì)群體繪制基于UPGMA法的樹狀聚類圖(圖5)。24個(gè)木荷種質(zhì)群體間遺傳距離差異很大，介于0.030～0.804之間，平均為0.230。從聚類圖看出，GDSX、HNSZ和FJSX 3個(gè)群體與其他群體間遺傳距離均較大，分別單獨(dú)聚為一組，其中HNSZ與GDSX間遺傳距離最大，為0.804。HNCB和FJSC聚為一組，它們之間的遺傳距離為0.149。其余19個(gè)種質(zhì)群體全部聚為一組，遺傳距離介于0.030～0.323，其中FJYX與JXXF間的遺傳距離最小，F(xiàn)JSW與JXFY間的遺傳距離最大。

圖5 基于遺傳距離的木荷種質(zhì)群體聚類Fig.5 Phylogenetic dendrogram based on the genetic distance in the Schima superba germplasm populations

3 討論

無效等位基因(null alleles)會(huì)對(duì)遺傳學(xué)相關(guān)研究結(jié)果造成顯著影響，如降低群體遺傳多樣性，加大群體間遺傳分化和遺傳距離等，是SSR標(biāo)記最大的缺陷之一(Paetkauetal., 1997； 文亞峰等， 2013)。本研究中，3對(duì)高無效等位基因頻率引物的存在，明顯降低了觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)和群體總體遺傳多樣性(表2)，相應(yīng)地，使得群體遺傳分化和遺傳距離增大。在進(jìn)行引物能力評(píng)估時(shí)，PIC>0.5時(shí)，引物貢獻(xiàn)率較高，多態(tài)性較好，選取的引物可以最大程度地反映遺傳多樣性(Wangetal., 2014)。本研究中，篩選后的10對(duì)SSR引物組合的PIC平均值為0.668，說明選擇的10對(duì)SSR引物可以很好反映引物的區(qū)分能力，能準(zhǔn)確有效地揭示木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)的遺傳多樣性。保持林木遺傳多樣性是對(duì)林木進(jìn)一步選擇和改良的前提(李悅等， 2000)。本研究結(jié)果顯示，參試木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)具有較高的遺傳多樣性，10對(duì)多態(tài)性SSR引物共檢測(cè)出105個(gè)等位基因(Na)，平均每對(duì)引物為10.5個(gè)。檢測(cè)到等位基因(Na)最多的引物是ss16(16個(gè)等位基因)，而辛娜娜等(2015)利用ss16引物僅檢測(cè)到6個(gè)等位基因，Niu等(2012)也只檢測(cè)到7個(gè)等位基因。本研究中的SSR引物之所以能檢測(cè)到更為豐富的變異類型，可能與參試種質(zhì)豐富、參試種質(zhì)來源廣泛、群體間的地理位置相距較遠(yuǎn)有關(guān)。Shannon’s信息指數(shù)(I)可以有效反映種質(zhì)各群體的遺傳多樣性，也是評(píng)價(jià)遺傳多樣性水平的重要指標(biāo)(Nybom, 2004)。本研究中木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)Shannon’s信息指數(shù)(I)為1.473，高于辛娜娜等(2015)利用SSR對(duì)木荷一代育種群體遺傳多樣性研究結(jié)果(I=1.225)。原因可能有以下2個(gè)方面： 一是研究材料來源于木荷主產(chǎn)區(qū)的5個(gè)省市具有廣泛代表性，這本身就代表著相對(duì)較高的遺傳多樣性； 二是與木荷本身的交配系統(tǒng)有關(guān)(雌雄同花、蟲媒傳粉且自交不親和)。與其他闊葉樹種相比較，如大花序桉(Eucalyptuscloeziana) (I=1.250)、灰葉胡楊(Populuspruinosa)(I=1.185)等(鄧紫宇， 2012； 張玲等， 2012)，本研究中木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性(I=1.473)，這與其本身的生物學(xué)特性有關(guān)。木荷是一種適應(yīng)性很強(qiáng)的物種，在群落演替的各個(gè)階段都出現(xiàn)，分布廣泛，種群較大，使得木荷在總體上表現(xiàn)出很高的遺傳多樣性。

通過對(duì)比分析不同地理來源木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)群體間的遺傳多樣性參數(shù)，發(fā)現(xiàn)FJJO、ZJLQ和JXXF的遺傳多樣性最為豐富，其可能原因?yàn)檫@些地區(qū)處于南嶺山脈-武夷山脈附近，與張萍等(2006)劃分的南部種源區(qū)和王秀花等(2011)劃分的中心種源區(qū)位置大致相同，是木荷的中心產(chǎn)區(qū)，其種質(zhì)不僅最為速生，而且遺傳多樣性也最高。JXFY的遺傳多樣性最低，遺傳變異最??； 這可能與該群體的種質(zhì)數(shù)量較少有關(guān)(N=7)，如JXTG (N=5)和FJSX(N=9)的遺傳多樣性水平均較低。因此，在今后的木荷種質(zhì)保存和育種策略制定工作中，應(yīng)重點(diǎn)考慮遺傳多樣性相對(duì)較為豐富的群體(如FJJO、ZJLQ和JXXF等種質(zhì)群體)，優(yōu)先對(duì)這些地區(qū)的木荷種質(zhì)做進(jìn)一步系統(tǒng)研究和開發(fā)利用，同時(shí)還應(yīng)加強(qiáng)對(duì)優(yōu)樹種質(zhì)的搜集和保存，以拓寬遺傳背景，提高育種成效。育種親本間的遺傳基礎(chǔ)差異越大，產(chǎn)生的雜交后代中越容易選出性狀超越親本和適應(yīng)性較強(qiáng)的新品種，因此，科學(xué)的育種親本選配是雜交育種工作的關(guān)鍵，選配親本重要原則之一就是選擇不同生態(tài)型、不同地理來源和不同親緣關(guān)系的材料作為雜交育種親本(余亞瑩等， 2015)。本研究結(jié)果顯示，JXXF與FJYX、JXSY與ZJLQ等種質(zhì)群體間的遺傳距離較小、親緣關(guān)系較近，因此，在木荷雜種育種工作中應(yīng)避免在這些群體間進(jìn)行雜交制種； 應(yīng)在遺傳距離大、親緣關(guān)系遠(yuǎn)的群體間(如HNCB與FJSX、 GDSX與HNSZ)進(jìn)行雜交制種，以期獲得更多的遺傳變異和雜種優(yōu)勢(shì)。主坐標(biāo)分析(PCoA)與STRUCTURE分析屬于2種不同的運(yùn)算模式，2種分析方法的結(jié)合，有助于結(jié)果的相互驗(yàn)證，使結(jié)果更為準(zhǔn)確，更全面了解不同材料間的遺傳關(guān)系(陳斐等， 2013)。在本研究中，主坐標(biāo)分析(PCoA)及STRUCTURE分析結(jié)果均顯示，不同地區(qū)種質(zhì)聚集交錯(cuò)，與地理來源并無直接關(guān)系，這與國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究結(jié)果一致(Laurentinetal., 2006; 辛娜娜等， 2015)。因此，在木荷雜交育種親本選配時(shí)不僅要考慮地理遠(yuǎn)緣，還應(yīng)考慮親本群體(個(gè)體)間的親緣關(guān)系。同時(shí)還要根據(jù)其他參考性狀，如木材質(zhì)量、抗逆性等性狀來考慮是否作為雜交育種的親本材料。

分子方差分析(AMOVA)結(jié)果表明，木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)的遺傳變異主要來源于群體內(nèi)。因此，在木荷育種工作中，需要側(cè)重于優(yōu)樹個(gè)體的選擇和改良，同時(shí)兼顧地理群體的選擇。群體遺傳分化的動(dòng)力主要來源于自然選擇(李康琴， 2013)。木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)群體間遺傳分化程度低，原因可能是木荷分布范圍較廣，木荷優(yōu)樹采集地保留種群一般比較大，呈集群分布，群體間基因流較大而未發(fā)生嚴(yán)重的遺傳分化。

近年來，基于DNA水平的分子標(biāo)記在作物關(guān)聯(lián)作圖分析上得到廣泛應(yīng)用，而在多年生木本植物中應(yīng)用相對(duì)較少(Zhuetal., 2015; Xuetal., 2015)。對(duì)種質(zhì)遺傳多樣性的研究及遺傳結(jié)構(gòu)的分析，是關(guān)聯(lián)作圖的前提，當(dāng)研究所用材料遺傳結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單時(shí)，關(guān)聯(lián)分析的功效就會(huì)達(dá)到最大，結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性的可能性也最低(Cardonetal., 2003； Aulchenko, 2011)。在群體遺傳結(jié)構(gòu)分析中，Wang等(2008)在玉米(Zeamays)研究中將Q>0.8的材料認(rèn)為結(jié)構(gòu)相對(duì)單一，在小麥(Triticumaestivum)研究中劉麗華等(2009)將Q>0.6視為結(jié)構(gòu)單一。本文根據(jù)種質(zhì)資源遺傳復(fù)雜程度的不同，將Q>0.5作為判斷遺傳結(jié)構(gòu)是否單一的標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)71.1%木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)遺傳組分相對(duì)單一，說明不同地區(qū)的木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)間存在一定的混雜，同時(shí)也表明這些木荷優(yōu)樹無性系是較好的關(guān)聯(lián)作圖材料。然而進(jìn)行表型與基因型的關(guān)聯(lián)分析時(shí)，應(yīng)具體分析遺傳結(jié)構(gòu)與表型的關(guān)系，對(duì)關(guān)聯(lián)分析的結(jié)果做出正確的判斷。

4 結(jié)論

利用篩選的10對(duì)條帶清晰、多態(tài)性SSR引物對(duì)734份木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，共獲得105個(gè)等位基因(Na)，多態(tài)信息含量(PIC)為0.668。根據(jù)地理來源將其劃分為24個(gè)種質(zhì)群體，各種質(zhì)群體均具有較高的遺傳多樣性。遺傳變異主要存在于群體內(nèi)，而群體間的交流有限。在選擇高遺傳多樣性群體的基礎(chǔ)上，木荷選育應(yīng)側(cè)重于群體內(nèi)個(gè)體的選擇。主坐標(biāo)分析(PCoA)及STRUCTURE分析均顯示群體劃分與種質(zhì)來源不完全相關(guān)，在木荷雜交育種親本選配時(shí)須同時(shí)考慮地理遠(yuǎn)緣和親本群體(個(gè)體)間的親緣關(guān)系。木荷優(yōu)樹無性系種質(zhì)的遺傳多樣性豐富，可以為種質(zhì)創(chuàng)新、優(yōu)良基因挖掘以及關(guān)聯(lián)分析提供基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯 徐 紅)

Analysis of Genetic Diversity inSchimasuperbaPlus Tree Germplasms by SSR Markers

Yang Hanbo1Zhang Rui1Wang Bangshun2Xu Zhaoyou2Chen Huanwei2Zhou Zhichun1

(1. Zhejiang Provincial Key Laboratory of Tree Breeding Research Institute of Subtropical Forestry, Chinese Academy of Forestry Hangzhou 311400; 2. Longquan Forestry Research Institute, Zhejiang Province Longquan 323700)

【Objective】 As a precious broadleaf timber and an efficient tree species for biological fire prevention,Schimasuperbaplays an important role in commercial timber production forests and ecological fireproof forest construction. In depth studies of genetic diversity ofS.superbaplus tree clones using SSR markers are particularly important for conservation, utilization of genetic resources, and future breeding programs for this plant species. 【Method】A total of 734 clones ofS.superbaplus trees from 24 areas of five provinces in China, were analyzed systematically with 10 SSR primer pairs. The GenAIEx 6.5 and CERVUS software were used for genetic diversity parameters calculation, principal coordinates analysis (PCoA) and null alleles detection. NTSYS software was used for cluster analysis based on the matrix of Nei’s genetic identity. The Arlequin software was used for analysis of molecular variance (AMOVA). STRUCTURE 2.3 software was used to analyze genetic structure. 【Result】The results showed that 105 alleles were detected among the germplasm accessions, with an average of 10.5 alleles per pair of primers. The maximum number of alleles was detected in primer ss16 with a value of 16. The Shannon’s information index (I) was ranged from 1.121 to 1.908, with an average of 1.473. The polymorphism information content (PIC) was ranged from 0.557 to 0.807, with an average of 0.668. The expected and observed heterozygosity were 0.713 and 0.735, respectively. The results of principal coordinate analysis (PCoA) and genetic structure analysis were basically consistent with each other, the 734 clones were divided into three groups in PCoA or five subgroups in STRUCTURE analysis. The genetic distance of 24 populations were ranged from 0.030 to 0.804, with an average of 0.230. The results showed that there were close genetic relationship between populations, but, there were still larger genetic distances between some populations, such as HNSZ and GDSX, JXFY and FJSX, etc. The Shannon’s information index (I) of populations were ranged from 0.980 to 1.431, and the genetic diversity was not significantly correlated to geographic distribution. The results of genetic structure analysis indicated that 71.1%S.superbaplus tree clones displayed a simple genetic structure, and the rest 28.9% displayed a mixed genetic structure. The AMOVA results showed that the differentiation among populations contributed to 5.91% of the total genetic variation, and the differentiation within populations contributed 94.09% of the total genetic variation.【Conclusion】 All the results showed that there was a high level of genetic diversity inS.superbaplus tree germplasms, and a significant difference of genetic diversity among populations. When selecting mating parents,the mating pairs should be geographically distant, and genetic relationship between populations or individuals should also be taken into account.

Schimasuperba; plus tree; SSR markers; genetic diversity; genetic structure

10.11707/j.1001-7488.20170506

2016-04-25；

2016-06-15。

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃課題(2012BAD01B04)； 浙江省竹木農(nóng)業(yè)新品種選育重大科技專項(xiàng)竹木育種協(xié)作組項(xiàng)目(2012C12908-6)； 福建省林木種苗科技攻關(guān)五期項(xiàng)目木荷課題； 江西省林業(yè)廳林業(yè)科技創(chuàng)新專項(xiàng)項(xiàng)目(201503)。

S718.46

A

1001-7488(2017)05-0043-11

*張蕊為通訊作者。