杉木磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ClPht1;1的克隆及表達(dá)分析*

蘇爍爍 李 明,2 吳鵬飛,2 張 穎 馬祥慶,2

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院 福州 350002； 2.國家林業(yè)局杉木工程技術(shù)研究中心 福州 350002)

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杉木磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ClPht1;1的克隆及表達(dá)分析*

蘇爍爍1李 明1,2吳鵬飛1,2張 穎1馬祥慶1,2

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院 福州 350002； 2.國家林業(yè)局杉木工程技術(shù)研究中心 福州 350002)

【目的】PHT1基因家族是影響植物吸收磷營養(yǎng)的重要磷轉(zhuǎn)運(yùn)子之一。從杉木32號(hào)磷高效家系cDNA中克隆得到PHT1基因家族的1個(gè)杉木磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ClPht1;1，并對(duì)不同程度磷脅迫下ClPht1;1的時(shí)空表達(dá)進(jìn)行研究，為杉木PHT1基因序列特征和功能結(jié)構(gòu)的研究以及磷高效利用杉木基因型的選育奠定基礎(chǔ)。【方法】 根據(jù)PHT1基因家族序列保守性設(shè)計(jì)簡并引物，以32號(hào)磷高效杉木基因型根系cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增獲得目的基因ClPht1;1的cDNA序列，使用RACE 技術(shù)對(duì)目的基因進(jìn)行全長克隆，并對(duì)其序列特征、同源性和編碼磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測ClPht1;1在32號(hào)磷高效杉木家系根、莖、葉中的表達(dá)，檢測中度缺磷脅迫下ClPht1;1在不同磷利用效率杉木4號(hào)、15號(hào)、25號(hào)、27號(hào)、28號(hào)、32號(hào)家系根系中的表達(dá)差異，以及在中度、重度缺磷脅迫下ClPht1;1在32號(hào)磷高效杉木家系根系中隨時(shí)間序列的表達(dá)量變化?！窘Y(jié)果】 克隆得到1個(gè)杉木磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PHT1基因，命名為ClPht1;1(GenBank登錄號(hào)： KX302006)，基因序列編碼區(qū)長1 638 bp，編碼545 aa的蛋白質(zhì)。ClPht1;1所編碼蛋白質(zhì)由12個(gè)疏水的跨膜區(qū)域組成，1個(gè)疑似跨膜域。每個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域基本由17～25個(gè)氨基酸殘基組成螺旋，同時(shí)跨膜蛋白的N 端和C端均位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，保守序列位于第4個(gè)跨膜域。構(gòu)成蛋白質(zhì)的主要骨架是α-螺旋，無信號(hào)肽序列。ClPht1;1基因編碼蛋白與日本柳杉PHT基因編碼蛋白的氨基酸序列相似性達(dá)到87.0%，與胡楊、油茶、馬尾松等PHT家族基因編碼蛋白的氨基酸序列相似性均在75%以上。ClPht1;1基因在杉木的根、莖、葉組織中均有表達(dá)，其中在根中的表達(dá)量最高，在葉中的表達(dá)量最低。在中度缺磷脅迫下，ClPht1;1基因在杉木不同家系根部的表達(dá)量為25號(hào)>27號(hào)>4號(hào)>15號(hào)>32號(hào)>28號(hào)。在中度和重度缺磷脅迫下，ClPht1;1基因在32號(hào)杉木家系根部的表達(dá)量隨脅迫時(shí)間的延長而逐漸上升； 恢復(fù)供磷后，ClPht1;1基因表達(dá)量逐漸下降至正常水平； 重度缺磷脅迫下，ClPht1;1基因表達(dá)量要高于其在中度缺磷脅迫下的表達(dá)量?！窘Y(jié)論】ClPht1;1基因具有PHT1基因家族的典型結(jié)構(gòu)，其編碼蛋白的氨基酸序列與日本柳杉等磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白氨基酸序列具有高度相似性，為杉木高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PHT1基因家族成員。ClPht1;1基因主要在杉木的根部表達(dá)，在葉片中的表達(dá)量較低； 杉木磷利用效率越強(qiáng)，ClPht1;1基因在其根部的表達(dá)量越高。在不同磷利用效率的杉木家系中ClPht1;1基因表達(dá)量存在較大差異。ClPht1;1 基因的表達(dá)受低磷脅迫的誘導(dǎo)，缺磷脅迫下ClPht1;1基因表達(dá)量明顯升高，恢復(fù)供磷后ClPht1;1基因表達(dá)量明顯降低。

杉木； 磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因；Pht1;1； RACE； RT-qPCR； 磷利用效率

植物PHT1家族成員基因表達(dá)水平的升高是植物適應(yīng)低磷脅迫的普遍機(jī)制。對(duì)擬南芥(Arabidopsisthaliana)、小麥(Triticumaestivum)、水稻(Oryzasativa)、大豆(Glycinemax)等植物PHT1基因的表達(dá)研究表明： 在介質(zhì)磷濃度滿足植物生長情況下，PHT1基因表達(dá)受到抑制，少量表達(dá)或不表達(dá)； 在介質(zhì)磷濃度較低時(shí)，植物高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)啟動(dòng)，從而誘導(dǎo)PHT1基因強(qiáng)烈表達(dá)； 對(duì)PHT1 基因表達(dá)進(jìn)行干擾將會(huì)導(dǎo)致根系吸收磷能力的降低(Yang etal.， 2010)。因此，PHT1基因的高表達(dá)是植物磷高效吸收利用的重要指標(biāo)之一，挖掘植物磷高效吸收利用的基因資源進(jìn)行遺傳改良，是緩解土壤有效磷缺乏和提高磷肥利用效率的有效途徑之一。研究表明，植物PHT1家族的成員組成和表達(dá)受植物種及品種的影響，水稻、玉米(Zeamays)等植物不同品種在低磷脅迫下的PHT1 基因表達(dá)具有明顯差異(Aietal., 2009; Calderon-Vazquezetal., 2008)。在水稻、大豆、歐洲油菜(Brassicanapus)、煙草(Nicotianatabacum)、油茶(Camelliaoleifera)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)等農(nóng)作物中都克隆得到了部分PHT1 家族的磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因成員，并根據(jù)PHT1基因的表達(dá)量變化來篩選和培育了一些磷高效農(nóng)作物品種或無性系，為揭示植物的磷轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制和提高磷素利用效率奠定了基礎(chǔ)。目前，對(duì)植物PHT1基因的研究主要集中在1年生農(nóng)作物上，在森林樹種上的研究報(bào)道較少，僅見毛果楊(Populustrichocarpa)、橡膠樹(Heveabrasiliensis)等喬木中。

杉木(Cunninghamialanceolata)是我國南方最主要的用材林造林樹種之一，其面積和蓄積量均居我國人工林樹種的首位(俞新妥， 2006)。由于南方酸性土壤對(duì)磷具有強(qiáng)烈化學(xué)固定作用，土壤磷素多以Fe-P、Al-P和O-P等形態(tài)存在(賈興永等， 2011)，這使得南方林區(qū)土壤固定態(tài)磷豐富，但是有效磷極度缺乏，杉木等南方林木表現(xiàn)出“遺傳學(xué)缺磷”現(xiàn)象(梁霞等， 2006)。長期以來，南方森林土壤有效磷不足一直是限制杉木人工林產(chǎn)量最重要的因素之一。因此篩選和培育磷高效杉木基因型，提高杉木對(duì)土壤磷素的吸收和利用效率，是培育杉木速生高效人工林和緩解多代連栽下杉木人工林地力衰退的重要方向。然而目前在杉木磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因方面研究報(bào)道較少，據(jù)此課題組在長期的杉木耐低磷脅迫試驗(yàn)研究中，選育了一些磷高效吸收利用杉木基因型，這些杉木基因型或主要通過根系皮層細(xì)胞溶解、加快體內(nèi)磷素的轉(zhuǎn)運(yùn)來抵抗磷脅迫逆境(4號(hào)、32號(hào)家系等)； 或主要通過在貧磷斑塊中的根系向四周拓展增生和分泌化學(xué)物質(zhì)，增強(qiáng)對(duì)介質(zhì)中磷的吸收效率來適應(yīng)環(huán)境的磷脅迫(25號(hào)、32號(hào)家系等)(汪攀， 2015； 吳鵬飛等， 2012)。以這些磷高效利用杉木基因型為研究材料，對(duì)于發(fā)掘杉木高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)子PHT1基因起到重要作用并具有實(shí)踐意義。

本試驗(yàn)以磷高效利用杉木4號(hào)、15號(hào)、25號(hào)、27號(hào)、28號(hào)、32號(hào)家系為試驗(yàn)材料，根據(jù)植物PHT1基因的保守性氨基酸序列設(shè)計(jì)簡并引物，利用RT-PCR和RACE技術(shù)對(duì)杉木PHT1基因全長進(jìn)行克隆，對(duì)其序列特征、同源性和編碼磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并使用熒光定量PCR檢測杉木PHT1基因在磷高效杉木基因型中的時(shí)空表達(dá)情況，以期為揭示杉木吸收磷營養(yǎng)的分子機(jī)制和選育磷高效利用杉木基因型奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取種植在福建農(nóng)林大學(xué)妙峰山試驗(yàn)苗圃的1年生不同利用效率的磷高效杉木4號(hào)(1.14±0.08)kg·g-1、15號(hào)(1.10±0.06)kg·g-1、25號(hào)(1.77±0.22)kg·g-1、27號(hào)(1.38±0.03)kg·g-1、28號(hào)(0.73±0.06)kg·g-1、32號(hào)(1.09±0.02)kg·g-1(汪攀， 2015)家系幼苗，根系經(jīng)純水清洗后固定于塑料小桶進(jìn)行水培供磷試驗(yàn)。幼苗經(jīng)過7天正常供磷營養(yǎng)液培養(yǎng)后，進(jìn)行不同程度缺磷脅迫處理。分別在缺磷脅迫0，12，24，48 h，以及恢復(fù)正常供磷12，24，48 h時(shí)采集幼苗的根、莖和葉，液氮速凍后-80 ℃保存待用。

利用KH2PO4設(shè)置3個(gè)供磷水平： 正常供磷(1.0 mmol·L-1KH2PO4)、中度缺磷(0.5 mmol·L-1KH2PO4，0.5 mmol·L-1KCl)和重度缺磷(0 mmol·L-1KH2PO4，1.0 mmol·L-1KCl)，脅迫中不足的K+用等量KCl代替。其他營養(yǎng)元素含量根據(jù)吳鵬飛(2009)改良的1/3Hoagland營養(yǎng)液配方進(jìn)行補(bǔ)充，即5.0 mmol·L-1KNO3、 2.0 mmol·L-1MgSO4·7H2O、5.0 mmol·L-1Ca(NO3)2·4H2O、l mL·L-1Fe-EDTA, Arnon微量元素(46.3 μmol·L-1H3BO3、0.3 μmol·L-1CuSO4·5H2O、0.8 μmol·L-1ZnSO4·7H2O、9.1 μmol·L-1MnC12·4H2O、0.4 μmol·L-1H2MoO4·4H2O)，調(diào)節(jié)營養(yǎng)液pH為5.8。

1.2ClPht1;1基因全長的克隆

1.2.1ClPht1;1基因保守區(qū)域擴(kuò)增 采用RNA plant plus植物總RNA提取試劑盒(天根公司)提取重度缺磷處理24 h的32號(hào)磷高效杉木根系總RNA，并使用Fermentas公司RT-PCR試劑盒合成cDNA第1條鏈。

根據(jù)油茶(GenBank： EU496869.1)、擬南芥(GenBank： AB005746)、玉米(GenBank： NM001111799.1)等植物PHT1基因氨基酸序列中的保守區(qū)，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)簡并引物ClPht1-R1∶5′-GTGCTGAATGCACTCGATGT-3′和ClPht1-F1∶5′-CCTAGCTGGGAAAATCTCAGC-3′對(duì)杉木根系cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?95 ℃預(yù)變性3 min； 94 ℃ 變性40 s，54 ℃退火40 s，72 ℃ 延伸100 s，35個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)天根公司DNA凝膠回收試劑盒回收、純化后，連接到pGEM-T Easy(TaKaRa公司)載體上進(jìn)行測序，獲得目的基因的核心片段。

1.2.2ClPht1;1基因全長cDNA的獲得 采用Invitrogen公司5′RACE(Version2.0)試劑盒，設(shè)計(jì)特異引物(5′-1：5′-TCGGAGGCAGAGAACC-3′； 5′-2：5′-TCCCAGGAGCCTCGTCAC-3′； 5′-3：5′-GCAGAAG AGGTCATACGCATC-3′)克隆目的基因的5′端序列。使用Superscript Ⅱ RT 酶和引物5′-1對(duì)總RNA進(jìn)行目的基因第1鏈cDNA的合成，使用引物5′-2和橋連鉚釘引物AAP(5′-GGCCACGCGTCGACTAGT ACGGGIIGGGIIGGGIIG-3′)對(duì)已經(jīng)加dC尾的cDNA進(jìn)行PCR第1輪擴(kuò)增，使用引物5′-3和橋連通用擴(kuò)增引物AUAP(5′-GGCCACGCGTC GACTAGTAC-3′)進(jìn)行巢式PCR第2輪擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物連接載體及測序過程同上。

采用Clontech 公司的SMARTerTMRACE試劑盒，設(shè)計(jì)特異引物(3′-1：5′-ACCTGGTTTCTTCT GGACATCGCCTACT-3′； 3′-2： 5′-AACCTGTTTCAA AAGGACATCTTCACGG-3′)克隆目的基因的3′端序列。使用逆轉(zhuǎn)錄酶SmartScribeTMReverse Transcriptase 和引物3′CDS primer A(5′-AAGCAGTGGTATC AACGCAGACTAC(T)30 V N-3′)對(duì)總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以此cDNA為模板，使用引物3′-1和UPM(5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCA AGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′)進(jìn)行第1輪PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋50倍后，用引物3′-2和 UPM進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物連接載體及測序過程同上。

根據(jù)獲得的目的基因核心片段、3′末端和5′末端3 個(gè)序列信息，利用Vector NTI10.3.0軟件進(jìn)行序列拼接，獲得目的全長基因的cDNA 序列。設(shè)計(jì)上游引物QC288F：5′-TTGAACCATGGCGGAGAA GC-3′和下游引物QC288R：5′-CTAAGCTGGT GCGGTTCTGG-3′，采用Takara Taq polymerase對(duì)目的基因全長進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min； 94 ℃變性60 s，50 ℃退火60 s，72 ℃ 延伸180 s，30個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物連接載體及測序過程同上。

1.2.3ClPht1;1基因序列分析 通過DNAMAN軟件預(yù)測測序所得目的基因編碼的氨基酸序列，并使用ORF Finder預(yù)測杉木PHT1基因的最長開放閱讀框。使用NCBI在線Blast檢索其他植物PHT1基因編碼氨基酸序列，并采用Clustal X2.1軟件進(jìn)行多序列比對(duì)。使用ProtParam軟件和ProtScale軟件預(yù)測目的基因編碼蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、疏水性等理化性質(zhì)； 使用TMpredServer軟件和MobylePortal軟件預(yù)測目的基因編碼蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)和拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)； 使用SOPMA軟件和Swiss-model軟件預(yù)測目的基因編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.3ClPht1;1基因表達(dá)分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測目的基因在32號(hào)磷高效杉木家系根、莖、葉中的表達(dá)情況； 檢測中度缺磷脅迫下目的基因在不同磷利用效率杉木4號(hào)(1.14±0.08)kg·g-1、15號(hào)(1.10±0.06)kg·g-1、25號(hào)(1.77±0.22)kg·g-1、27號(hào)(1.38±0.03)kg·g-1、28號(hào)(0.73±0.06)kg·g-1、32號(hào)(1.09±0.02)kg·g-1家系根系中的表達(dá)差異； 檢測中度、重度供磷脅迫下0，12，24，48 h，以及恢復(fù)正常供磷12，24，48 h目的基因在32號(hào)磷高效杉木家系根系中的表達(dá)量變化，以上試驗(yàn)均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR在Roch480熒光定量PCR儀上進(jìn)行，熒光染料采用TakaRa公司SYBR Green PCR Master Mix，上游引物5′-GGCCATTCCGTACAACCACTG-3′，下游引物5′-AATTCTTGACCCCAATACCCT-3′。 使用β-Actin基因作為內(nèi)參基因，其上游引物為5′-TACATTGCCGGTGTATTGAACGTC-3′，下游引物為5′-AGTTGCTCCAGAAGAACATCC-3′。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性3 min； 95 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，45個(gè)循環(huán)； 95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，逐漸升溫到95 ℃，速度0.11 ℃·s-1。擴(kuò)增結(jié)果采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1ClPht1;1基因全長克隆

以重度缺磷處理24 h的32號(hào)磷高效杉木根系cDNA為模板，采用設(shè)計(jì)的簡并引物ClPht1-R1和ClPht1-F1進(jìn)行PCR擴(kuò)增測序，獲得1個(gè)長度為1 004 bp的杉木PHT1基因保守片段序列(圖1A)。根據(jù)獲得的杉木PHT1基因保守序列分別設(shè)計(jì)目的基因的5′和3′ RACE特異引物，5′RACE-PCR擴(kuò)增得到長度為250 bp的片段(圖1B)，3′RACE-PCR擴(kuò)增得到長度為1 000 bp片段(圖1C)。將目的基因保守序列、5′RACE片段和3′RACE片段拼接后獲得全長為1 967 bp的基因序列。依據(jù)拼接獲得的基因序列設(shè)計(jì)全長引物H1和H2，擴(kuò)增目的基因全長并測序驗(yàn)證，在預(yù)測位置獲得單一清晰的目的條帶(圖1D)，測序結(jié)果與拼接的序列一致，命名為杉木高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ClPht1;1(GenBank登錄號(hào)： KX302006)。

圖1 杉木PHT1基因保守片段(A)、cDNA 5′RACE(B)、cDNA 3′RACE(C)和全長基因(D)Fig.1 Cunninghamia lanceolata PHT1 gene conservative fragment (A), cDNA 5′RACE (B), cDNA 3′RACE (C) and full length gene (D)

2.2ClPht1;1基因生物信息學(xué)分析

2.2.1ClPht1;1基因序列分析ClPht1;1基因(GenBank登錄號(hào)： KX302006)全長序列分析表明，其長度為1 967 bp，開放閱讀框?yàn)? 638 bp，編碼1個(gè)含545個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，編碼蛋白分子量為59.95 kDa，等電點(diǎn)為9.04。ClPht1;1基因編碼多肽的原子組成為C2750H4198N698O751S28，不穩(wěn)定系數(shù)是33.44，表明其為穩(wěn)定蛋白質(zhì)分子。ClPht1;1基因的脂肪系數(shù)為82.57，總平均親水性為0.226，ProtScale 軟件分析表明ClPht1;1基因編碼蛋白含有較多的疏水區(qū)域，為疏水性蛋白(圖2)。

圖3 ClPht1;1蛋白跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Prediction of ClPht1;1 protein transmembrane topology

圖2 ClPht1;1疏水性曲線Fig.2 ClPht;1 hydrophobic curve

2.2.2ClPht1;1基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用在線TMpred Server 和Mobyle portal軟件對(duì)ClPht1;1基因編碼蛋白進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)和跨膜區(qū)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果表明ClPht1;1基因編碼蛋白具有12個(gè)跨膜域(TM)，其中含1個(gè)疑似跨膜域，包括6 個(gè)N端的跨膜區(qū)以及6個(gè)C端的跨膜區(qū)，中部(TM6和TM7之間)由1個(gè)中央親水環(huán)(hydrophilic loop)分隔(圖3)。每個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域由17～25個(gè)氨基酸殘基組成的螺旋構(gòu)成，跨膜蛋白的N 端、C端和中間的大環(huán)都分布在細(xì)胞質(zhì)中，保守序列位于第4個(gè)跨膜域，ClPht1;1基因編碼蛋白的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)與其他物種PHT1基因編碼蛋白的跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)基本一致(Nussaumeetal.， 2011)。使用SOPMA軟件和Swiss-model軟件對(duì)ClPht1;1基因編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明其蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中41.65%為α-螺旋，26.42%為與蛋白質(zhì)功能相關(guān)的無規(guī)則卷曲，21.47%為延伸鏈，10.46%為β-轉(zhuǎn)角； 三級(jí)結(jié)構(gòu)中構(gòu)成蛋白質(zhì)的主要骨架是α-螺旋(圖4)； 保守域分析表明ClPht1;1基因編碼蛋白有典型的MFS結(jié)構(gòu)域。

圖4 ClPht1;1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Prediction of ClPht1;1 protein tertiary structure

2.2.3 ClPht1;1蛋白序列同源性分析 使用ClustalX2.1軟件對(duì)ClPht1;1基因和Blast獲得的其他植物PHT基因編碼氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)(圖5)。結(jié)果表明，ClPht1;1基因編碼產(chǎn)物與日本柳杉(Cryptomeriajaponica)PHT基因編碼氨基酸序列的相似性為87%，與其他植物PHT基因編碼氨基酸序列的相似性均在70%以上。其中，與馬尾松(Pinusmassoniana)和可可樹(Theobromacacao)等南方喬木PHT基因編碼氨基酸序列相似性達(dá)到77%，與油茶、葡萄(Vitisvinifera)、胡楊(Populuseuphratica)等相似性達(dá)到76%。

2.3ClPht1;1基因的表達(dá)分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測正常供磷情況下ClPht1;1基因在32號(hào)磷高效杉木家系根、莖、葉中的表達(dá)情況，結(jié)果表明ClPht1;1基因在杉木各組織部位均有表達(dá)，但在根中的表達(dá)量要遠(yuǎn)高于莖和葉，在葉片中的表達(dá)量較低(圖6)。中度缺磷脅迫(0.5 mmol·L-1KH2PO4)下，ClPht1;1基因在不同磷利用效率杉木4號(hào)(1.14±0.08)kg·g-1、15號(hào)(1.10±0.06)kg·g-1、25號(hào)(1.77±0.22)kg·g-1、27號(hào)(1.38±0.03)kg·g-1、28號(hào)(0.73±0.06)kg·g-1、32號(hào)(1.09±0.02)kg·g-1家系根系中的表達(dá)量為25號(hào)>27號(hào)>4號(hào)>15號(hào)>32號(hào)>28號(hào)(圖7)，表明ClPht1;1基因在杉木根部的表達(dá)量隨著不同家系杉木磷利用效率的增強(qiáng)而升高。中度、重度(0 mmol·L-1KH2PO4)缺磷脅迫下ClPht1;1基因在32號(hào)杉木家系根系中的表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間(0，12，24，48 h)的延長均呈現(xiàn)明顯的上調(diào)趨勢； 恢復(fù)供磷12 h后ClPht1;1基因表達(dá)量明顯下降，并在恢復(fù)供磷24 h和48 h后呈現(xiàn)與正常供磷培養(yǎng)相近的表達(dá)量水平。重度缺磷脅迫下，ClPht1;1基因表達(dá)量要高于其在中度缺磷脅迫下的表達(dá)量，表明ClPht1;1基因的表達(dá)明顯受介質(zhì)低磷脅迫誘導(dǎo)(圖8)。

圖5 ClPht1;1及部分植物PHT基因編碼蛋白的氨基酸序列多重比對(duì)Fig.5 Multiple alignments of the amino acid sequences of ClPht1;1 and some plant PHT genes encoding proteins羅馬數(shù)字Ⅰ-Ⅻ表示12 個(gè)跨膜區(qū)，虛框內(nèi)表示疑似跨膜區(qū)； ■表示N-糖基化位點(diǎn)； ▲表示蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)； ★表示酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)。Roman numerals Ⅰ-Ⅻ represent 12 transmembrane regions, virtual boxes represent the suspected transmembrane areas; ■ represents N-glycosylation site; ▲ represents protein kinase C phosphorylation site; ★ represents casein kinase Ⅱ phosphorylation site.

圖6 ClPht1;1在32號(hào)杉木不同組織中的表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis of ClPht1;1 in different tissues of Cunninghamia lanceolata No. 32

圖7 ClPht1;1在不同家系杉木根部的表達(dá)分析Fig.7 Expression analysis of ClPht1;1 in roots in different families of Cunninghamia lanceolata

圖8 不同磷脅迫和處理時(shí)間下ClPht1;1在32號(hào)杉木根系的表達(dá)分析Fig.8 Expression analysis of ClPht1;1 in roots of Cunninghamia lanceolata No. 32 under different P stresses at different treatment time

3 討論

PHT1 基因家族成員大多主要在植物根部表達(dá)，一些PHT1 基因不僅在植物根部表達(dá)，還在植物的莖、葉、花、塊莖和子葉中表達(dá)，這些PHT1基因可能涉及到植株體內(nèi)的磷轉(zhuǎn)運(yùn)功能(Liuetal.， 2005)。在擬南芥中，PHT1;1和PHT1;9均受缺磷脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，除了PHT1;6在花粉中表達(dá)外，其他成員均主要在根中表達(dá)(Bayleetal., 2011)。馬鈴薯(Solanumtuberosum)StPT1和番茄(Lycopersiconesculentum)LePT1(Nagyetal.， 2005)在缺磷或不缺磷的根部和地上部均能大量表達(dá)，但缺磷能誘導(dǎo)增強(qiáng)其表達(dá)量；StPT2和LePT2則僅在植株的根部受缺磷環(huán)境的誘導(dǎo)表達(dá)(Leggewieetal., 1997； Liuetal., 1998； Gordon-Weeksetal., 2003)。油茶BhPHT1;4基因在嫩根、老根、莖、新葉、老葉中都有表達(dá)，但表達(dá)量依次遞減(趙彩芝， 2014)。本試驗(yàn)結(jié)果表明ClPht1;1基因與大部分植物PHT1基因類似，主要在杉木根部表達(dá)，葉片中僅能檢測到少量表達(dá)信號(hào)。ClPht1;1基因在杉木根、莖和葉片中均有表達(dá)，說明其不僅參與杉木對(duì)土壤磷的吸收，而且可能參與杉木體內(nèi)磷素的轉(zhuǎn)運(yùn)。植物對(duì)磷的轉(zhuǎn)運(yùn)效率受細(xì)胞膜上磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的數(shù)量及其對(duì)磷的親和性決定，在中度缺磷脅迫下，ClPht1;1基因在不同磷利用效率4號(hào)、15號(hào)、25號(hào)、27號(hào)、28號(hào)、32號(hào)家系杉木根系中的表達(dá)量存在差異，表達(dá)量隨著不同家系杉木磷利用效率的增強(qiáng)而升高，這可能與不同磷利用效率杉木根部細(xì)胞膜表面ClPht1;1磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白數(shù)量多少有關(guān)。ClPht1;1基因的表達(dá)量隨根系缺磷脅迫時(shí)間的延長和脅迫程度的加重而升高，在恢復(fù)供磷培養(yǎng)后表達(dá)量下降逐漸至正常水平，表明ClPht1;1基因的表達(dá)受低磷脅迫的誘導(dǎo)。綜上研究，ClPht1;1基因的時(shí)空表達(dá)情況符合PHT1家族基因的表達(dá)特性，對(duì)杉木PHT1基因的表達(dá)量分析為磷高效轉(zhuǎn)運(yùn)基因型的篩選提供了參考。

4 結(jié)論

磷是我國杉木人工林產(chǎn)量和質(zhì)量的主要限制因子，由于南方紅壤區(qū)土壤有效磷長期不足，杉木長期處于低磷的生長環(huán)境中。本試驗(yàn)從32號(hào)磷高效利用杉木家系的根部克隆獲得一個(gè)高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ClPht1;1，其具有植物PHT1基因家族的典型結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和表達(dá)模式。對(duì)于長期處于低磷環(huán)境中的杉木，ClPht1;1在杉木高親和轉(zhuǎn)運(yùn)土壤低濃度有效磷中起到重要的作用。目前，杉木PHT1基因家族的成員組成和各自的磷轉(zhuǎn)運(yùn)功能仍有待研究，深入解析杉木高親和磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)于了解杉木磷吸收的代謝機(jī)制，培育磷高效利用杉木品種和增強(qiáng)林分磷素管理都具有重要意義。

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(責(zé)任編輯 徐 紅)

Cloning and Expression Analysis of Phosphate Transporter GeneClPht1;1 inCunninghamialanceolata

Su Shuoshuo1Li Ming1,2Wu Pengfei1,2Zhang Ying1Ma Xiangqing1,2

(1.College of Forestry, Fujian Agriculture and Forestry University Fuzhou 350002； 2.State Forestry Administration Engineering Research Center of Chinese Fir Fuzhou 350002)

【Objective】PHT1 gene family is one of the important phosphorus transporters which affect the uptake of phosphorus in plants. ACunninghamialanceolataphosphate transporter gene ofPHT1 gene family was cloned from No.32 phosphorus efficientC.lanceolatacDNA，and the temporal and spatial expression ofClPht1;1 under different levels of phosphorus stress was studied to lay the foundation for the research ofPHT1 gene sequence characteristics, functional structure and the selection of theC.lanceolatagenotype which is efficient in phosphorus utilization.【Method】According to the designed degenerate primer based on the conserved sequence ofPHT1 gene family, the target geneClPht1;1 cDNA sequence was obtained by amplification of the root cDNA of the P-efficient family No.32 ofC.lanceolataas the template, the full length of the target gene was cloned by RACE technique, and analyzed its sequence characteristics, homology and protein structure were then analyzed. The real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression ofClPht1;1 in roots, stems and leaves of No.32C.lanceolatawith high P-efficiency, differential expressions ofClPht1;1 in the roots ofC.lanceolatafamilies of No.4,No.15,No.25,No.27,No.28 and No.32 in different P-utilization efficiency under moderate P deficiency stress, and theClPht1;1 expression change with time in the root system of phosphorus efficientC.lanceolataNo.32 under moderate and severe phosphorus deficiency stress.【Result】AC.lanceolataPHT1 gene was cloned and namedClPht1;1 (GenBank accession number KJ493165). The coding region of the gene sequence was 1 638 bp, code 545 aa protein.ClPht1;1 encoded proteins were composed of 12 hydrophobic transmembrane domains, including 1 suspected transmembrane domains. Each transmembrane domain was composed of 17-25 amino acid residues, and the N and C ends of transmembrane proteins were located in the cytoplasm, and the conserved sequences were located in the fourth transmembrane domains. The main skeleton of the protein was α-helix, no signal peptide sequence. The similarity of amino acid sequences of encoding proteins ofClPht1;1 was 87% withCryptomeriajaponicaPHTgene, and above 75% withPopulus,Camellia,Pinusmassonianaetc.PHTfamily gene.ClPht1;1 genes were expressed in root, stem and leaf ofC.lanceolata, and the highest expression was in root,the lowest was in leaf; Under moderate P deficiency stress, the expression level ofClPht1;1 in the root ofC.lanceolatavaried among families in a order of No.25>No.27>No.4>No.15>No.32>No.28. Under moderate and severe P deficiency stresses, the expression ofClPht1;1 in the root of No.32 increased with the extension of stress time; The expression level ofClPht1;1 was gradually decreased to normal level after the recovery of phosphorus supply;ClPht1;1 gene expression in severe P deficiency stress was higher than that under moderate P deficiency stress.【Conclusion】ClPht1;1 gene has the typical structure ofPHT1 gene family, and its protein amino acid sequence is highly similar to the amino acid sequences ofCryptomeriajaponicaphosphate transporter protein, it is a member of the high affinity phosphate transporterPHT1 gene family ofC.lanceolata.ClPht1;1 gene was mainly expressed in root ofC.lanceolata, and its expression was lower in leaf. The stronger the phosphorus use efficiency, the higher theClPht1;1 gene expression in its roots.There were large differences in the expression level ofClPht1;1 gene among families with different phosphorus use efficiencies.ClPht1;1 gene expression was induced by low phosphorus stress; Under P deficiency stress, the expression level ofClPht1;1 was significantly increased, and the expression ofClPht1;1 gene was significantly decreased after the recovery of phosphorus supply.

Cunninghamialanceolata; phosphate transporter;PHT1;1; RACE; RT-qPCR; phosphorus use efficiency

10.11707/j.1001-7488.20170505

2016-06-15;

2016-08-12。

國家自然科學(xué)基金海峽聯(lián)合基金項(xiàng)目(U1405211)； 國家林業(yè)局杉木工程技術(shù)研究中心科技成果孵化基金(6213C0111)。

S718.46

A

1001-7488(2017)05-0033-10

*李明為通訊作者。