黃芪注射液對IgA腎病患者免疫球蛋白分子異常糖基化及Cosmc基因表達的影響

沈世忠 楊忠民 蔡佳盈 謝潛紅 胡義陽 孫凌云 姜宗培

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州市第一醫(yī)院腎內(nèi)科,福建 泉州 362000)

黃芪注射液對IgA腎病患者免疫球蛋白分子異常糖基化及Cosmc基因表達的影響

沈世忠 楊忠民 蔡佳盈 謝潛紅 胡義陽 孫凌云 姜宗培1

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州市第一醫(yī)院腎內(nèi)科,福建 泉州 362000)

目的 探討黃芪注射液對IgA腎病患者免疫球蛋白分子異常糖基化及Cosmc基因表達的影響。方法 選擇IgA腎病患者26例，分離患者外周血B淋巴細(xì)胞并分別培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基(空白對照組)、RPMI1640+黃芪注射液200 mg/ml(黃芪低劑量組)、RPMI1640+黃芪注射液1 000 mg/ml(黃芪中劑量組)和RPMI1640+黃芪注射液2 000 mg/ml(黃芪高劑量組)。經(jīng)培養(yǎng)72 h后檢測上述4組細(xì)胞中Cosmc基因mRNA及蛋白表達水平，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測上清液中IgA1水平。結(jié)果 與空白對照組比較，加入黃芪注射液后B淋巴細(xì)胞中Cosmc基因mRNA及蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，且黃芪高劑量組顯著高于中、低劑量組(P<0.05)；與空白對照組比較，加入黃芪后B淋巴細(xì)胞中培養(yǎng)基上清IgA1水平顯著降低(P<0.05)，且黃芪高劑量組顯著低于中、低劑量組(P<0.05)；與空白對照組比較，黃芪注射液組IgA1與蠶豆凝集素結(jié)合力明顯下降(P<0.05),且高劑量組下降更為顯著(P<0.05)。結(jié)論 黃芪可能通過上調(diào)Cosmc基因表達水平調(diào)控IgA腎病患者免疫球蛋白分子IgA1異常糖基化。

IgA腎病；Cosmc基因；黃芪注射液；糖基化

IgA腎病是臨床上最為常見的腎小球疾病，占所有腎小球疾病的50%左右〔1〕。研究顯示，IgA腎病患者大多存在免疫球蛋白分子IgA1異常糖基化的改變，同時IgA1異常糖基化可能受到Cosmc基因表達水平的影響〔2〕。黃芪注射液為中藥黃芪的提取物，被廣泛用于治療多種腎臟疾病包括IgA腎病〔3〕。黃芪可降低腎病患者蛋白尿，保護腎臟功能，但其確切作用機制目前并不清楚。本研究探討黃芪注射液對IgA腎病患者免疫球蛋白分子異常糖基化及Cosmc基因表達的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年2月至2014年7月福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州市第一醫(yī)院收治的腎穿刺活檢確診為IgA腎病患者26例，男14例，女12例，平均年齡(26.4±8.8)歲，平均病史(13.7±8.6)個月，24 h尿蛋白(2.7±1.6)g/24 h，血肌酐平均(82.2±40.1)μmol/L。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18周歲；腎穿刺活檢確診為IgA腎?。换颊呶唇邮苓^激素或免疫抑制劑治療；知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：其他腎小球腎病或無明確病理學(xué)診斷者；近期接受過激素或免疫制劑治療者；其他如紅斑狼瘡等免疫性疾病患者；惡性腫瘤患者；人獲得性免疫缺陷病毒(HIV)陽性者；孕產(chǎn)婦。

1.2 藥物與儀器 黃芪注射液，正大青春寶藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，規(guī)格為10 mg/支；RPMI1640培養(yǎng)基(購自Life techology公司)；植物血凝素(購自晶美生物工程有限公司)；IgA酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒(購自美國Southern Biotechnology Associates公司)；普通離心機(購自美國Beckman公司)，實時熒光定量PCR儀(購自美國ABI公司)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 分離提取IgA腎病患者外周血B淋巴細(xì)胞，并分將104/ml B淋巴細(xì)胞別培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)基(空白對照組)、RPMI1640+黃芪注射液200 mg/ml(黃芪低劑量組)、RPMI1640+黃芪注射液1 000 mg/ml(黃芪中劑量組)和RPMI1640+黃芪注射液2 000 mg/ml(黃芪高劑量組)培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2濃度，培養(yǎng)72 h。

1.4 檢測指標(biāo) 72 h后Tirzol法提取總RNA并采用實時熒光定量PCR法檢測Cosmc基因mRNA水平，Western印跡法檢測Cosmc蛋白表達水平；ELISA法檢測培養(yǎng)基上清液中IgA1濃度，通過蠶豆凝集素結(jié)合力法檢測IgA1分子鉸鏈區(qū)N-乙酰半乳糖的結(jié)合力評估IgA1糖基化水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSSS16.0統(tǒng)計軟件進行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 黃芪對Cosmc基因表達的影響 與空白對照組比較，加入黃芪后B淋巴細(xì)胞中Cosmc基因mRNA及蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)，且黃芪高劑量組顯著高于中、低劑量組(P<0.05)。見表1。

表1 各組Cosmc基因、蛋白表達的比較

與空白對照組比較:1)P<0.05；與黃芪高劑量組比較:2)P<0.05

2.2 黃芪對IgA1水平的影響 與空白對照組〔(338.41±66.88)ng/ml〕比較，加入黃芪后B淋巴細(xì)胞中培養(yǎng)基上清中IgA1水平顯著降低(P<0.05)，且黃芪高劑量組〔(224.65±50.21)ng/ml〕顯著低于中〔(265.45±41.22)ng/ml〕、低劑量組〔(298.32±46.65)ng/ml，P<0.05〕。

2.3 IgA1分子與蠶豆凝集素結(jié)合力 空白對照組、黃芪高、中、低劑量組IgA1與蠶豆凝集素結(jié)合力分別為0.365±0.031(OD492 nm)、0.266±0.035 6(OD492 nm)，0.298±0.033(OD492 nm)、0.325±0.029(OD492 nm)。與空白對照組比較，黃芪組IgA1與蠶豆凝集素結(jié)合力明顯下降(P<0.05),且高劑量組下降更為顯著(P<0.05)。

3 討 論

IgA腎病是以系膜細(xì)胞增生、系膜基質(zhì)增加伴系膜去IgA1或IgA1為主的免疫球蛋白彌漫性沉積為主要特征的一種腎小球疾病，其約占我國腎小球疾病人數(shù)的50%，是臨床最為常見的腎小球腎病，其確切發(fā)病機制至今仍不十分清楚〔4〕。近年研究顯示，IgA腎病患者IgA1分子鉸鏈區(qū)O-連接糖基化過程異常在IgA腎病的發(fā)病機制中起到一定的作用〔5,6〕。已有研究顯示，IgA腎病患者血漿、系膜區(qū)組織中IgA1分子O-糖基化水平顯著下降，提示O-糖基化與IgA腎病的發(fā)生密切相關(guān)〔2〕。

黃芪注射液為中藥黃芪中提取的有效成分，其生物活性物質(zhì)主要為黃芪多糖、多種氨基酸、黃芪總皂苷等，是常用于治療更重腎臟病的中藥〔7〕。臨床上黃芪具有抗炎、抗氧化及抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載等生物學(xué)功能。臨床研究顯示，IgA腎病患者應(yīng)用黃芪后可顯著降低患者24 h蛋白尿水平〔8〕。同時可通過上調(diào)表達肝細(xì)胞生長因子和下調(diào)表達轉(zhuǎn)化生長因子β1來抑制腎纖維化的發(fā)展。本文提示，黃芪可能通過上調(diào)Cosmc基因表達水平來調(diào)控IgA腎病患者免疫球蛋白分子IgA1異常糖基化，Cosmc可能是黃芪治療IgA腎病的重要靶點。Ji等〔3〕應(yīng)用黃芪注射液與IgA患者B淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)黃芪可逆轉(zhuǎn)IgA1分子O-糖基異常，提示黃芪可通過逆轉(zhuǎn)O-糖基異常等分子機制來達到治療IgA腎病的目的。本研究發(fā)現(xiàn)B淋巴細(xì)胞經(jīng)黃芪注射液處理后IgA1與蠶豆凝集素結(jié)合力明顯下降，說明O-異常糖基化分子減少，與Ji等〔3〕的研究結(jié)論一致。

1 McQuarrie EP,Mackinnon B,McNeice V,etal.The incidence of biopsy-proven IgA nephropathy is associated with multiple socioeconomic deprivation〔J〕.Kidney Int,2014;85(1):198-203.

2 Narimatsu Y,Kuno A,Ito H,etal.IgA nephropathy caused by unusual polymerization of IgA1 with aberrant N-glycosylation in a patient with monoclonal immunoglobulin deposition disease〔J〕.PLoS One,2014;9(3):e91079.

3 Ji L,Chen X,Zhong X,etal.Astragalus membranaceus up-regulate Cosmc expression and reverse IgA dys-glycosylation in IgA nephropathy〔J〕.BMC Complement Altern Med,2014;14(1):195.

4 Kiryluk K,Novak J.The genetics and immunobiology of IgA nephropathy〔J〕.J Clin Invest,2014;124(6):2325-32.

5 Novak J,Julian BA,Mestecky J,etal.Glycosylation of IgA1 and pathogenesis of IgA nephropathy〔J〕.Semin Immunopathol,2012;34(3):365-82.

6 Novak J,Moldoveanu Z,Julian BA,etal.Aberrant glycosylation of IgA1 and anti-glycan antibodies in IgA nephropathy:role of mucosal immune system〔J〕.Adv Otorhinolaryngol,2011;72(1):60-3.

7 高 芳,王永霞,楚冬梅,等.黃芪注射液聯(lián)合1,6-二磷酸果糖對小兒病毒性心肌炎的臨床研究〔J〕.中國臨床藥理學(xué)雜志,2014;24(6):484-6.

8 吳宇紅,陳茂盛,盧 冰.黃芪當(dāng)歸合劑聯(lián)合基礎(chǔ)治療對IgA腎病的療效觀察〔J〕.浙江中醫(yī)雜志,2013;48(6):412-3.

〔2015-08-28修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

泉州市科技計劃基金資助項目(No.2014266)

姜宗培(1964-)，男，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事腎小球疾病研究。

沈世忠(1971-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事腎小球疾病研究。

R364

A

1005-9202(2017)11-2788-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.085

1 中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院腎內(nèi)科