干酪乳桿菌胞外多糖基因簇的調(diào)控基因在大腸桿菌中異源表達(dá)

孔令慧，周煒，王光強(qiáng)，夏永軍，張匯，李紅梅，艾連中，熊智強(qiáng)*

1(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海食品微生物工程研究中心，上海，200093)2(揚(yáng)州市揚(yáng)大康源乳業(yè)有限公司，江蘇 揚(yáng)州,225004)

干酪乳桿菌胞外多糖基因簇的調(diào)控基因在大腸桿菌中異源表達(dá)

孔令慧1，周煒2，王光強(qiáng)1，夏永軍1，張匯1，李紅梅1，艾連中1，熊智強(qiáng)1*

1(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海食品微生物工程研究中心，上海，200093)2(揚(yáng)州市揚(yáng)大康源乳業(yè)有限公司，江蘇 揚(yáng)州,225004)

為研究干酪乳桿菌胞外多糖的生物合成和轉(zhuǎn)錄調(diào)控，對其生物合成基因簇中假定的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子LC2W_2170進(jìn)行克隆，并在大腸桿菌(Escherichiacoli)中異源表達(dá)。首先，利用PCR技術(shù)從干酪乳桿菌LC2W中擴(kuò)增出目的基因LC2W_2170，將其插入到大腸桿菌表達(dá)載體pET24a和pET30a中，構(gòu)建出LC2W_2170 N端或C端和N端均含有His蛋白標(biāo)簽的重組質(zhì)粒。含上述質(zhì)粒的E.coli經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)后，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析并未發(fā)現(xiàn)LC2W_2170蛋白可溶性表達(dá)。對LC2W_2170氨基酸序列利用Phobius服務(wù)器分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白N端存在跨膜區(qū)(前27個(gè)氨基酸為跨膜序列)。切除此跨膜區(qū)域重新構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒后，在E.coli中成功實(shí)現(xiàn)LC2W_2170蛋白可溶性表達(dá)。研究為進(jìn)一步純化該轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，并研究其功能和對胞外多糖生物合成基因簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

干酪乳桿菌；胞外多糖；轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子；異源表達(dá)；大腸桿菌

乳酸菌是一類能利用碳水化合物并產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌總稱，屬于革蘭氏陽性菌，不產(chǎn)芽孢，在自然界中分布廣泛，從各種植物的表面、人畜禽類的腸道和腌制食品等環(huán)境中都能檢測到它的存在，在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用較多的乳酸菌主要有乳桿菌屬和乳酸乳球菌屬等。例如，干酪乳桿菌具有很高的乙醇耐受力[1]，能夠很好地適應(yīng)惡劣環(huán)境。它具有能夠改善人體腸道微環(huán)境[2-3]，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，抗過敏，調(diào)節(jié)血壓和降低膽固醇等[4]重要生理活性。目前乳酸菌的研究重點(diǎn)主要是其發(fā)揮作用的機(jī)理，比如它的次生代謝產(chǎn)物細(xì)菌素和胞外多糖(EPS)[5]如何在調(diào)節(jié)腸道平衡中發(fā)揮著重要作用。

乳酸菌EPS是乳酸菌在生長代謝過程中分泌到細(xì)胞壁外的黏多糖或莢膜多糖[2,5-6]。EPS被廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥等行業(yè)，可作為增稠劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、增稠劑、膠凝劑、脂肪替代品和水黏合劑等[7-8]。在發(fā)酵過程中有助于改善發(fā)酵的流變學(xué)特性，減少發(fā)酵乳乳清析出現(xiàn)象，改善發(fā)酵乳質(zhì)地和感官質(zhì)量等[9]。此外，干酪乳桿菌產(chǎn)生的EPS對自發(fā)性高血壓大鼠和腎性高血壓大鼠都具有明顯的降血壓作用[10-11]。由于乳酸菌EPS的這些重要功能，展開乳酸菌EPS的生物合成和調(diào)控機(jī)制研究具有重要意義。

隨著許多重要的乳酸菌全基因組序列公布和EPS合成相關(guān)基因簇的克隆及功能分析，使得利用基因工程和代謝工程技術(shù)提高EPS的產(chǎn)量成為可能[7,13-15]。通過其生物合成的機(jī)制研究，可闡明其代謝過程中關(guān)鍵因素[16]，大量的研究已經(jīng)證明EPS生物合成途徑中必需的一些基因和相對應(yīng)編碼的酶。例如，eps基因簇在乳酸乳球菌中過表達(dá)，能顯著提高EPS的合成。在此基礎(chǔ)上，對產(chǎn)EPS的乳酸菌進(jìn)行改造修飾和調(diào)控也取得了一定的進(jìn)展[16]。本研究基于對干酪乳桿菌LC2W基因組數(shù)據(jù)分析的基礎(chǔ)上[17-18]，發(fā)現(xiàn)該菌EPS基因簇中含有一個(gè)假定的途徑特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子LC2W_2170，關(guān)于此調(diào)控因子的研究尚未見報(bào)道，對它在EPS生物合成中可能的調(diào)控作用尚不清楚。為了解LC2W_2170在轉(zhuǎn)錄水平上如何調(diào)控EPS生物合成，純化此蛋白展開凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)等體外基因表達(dá)調(diào)控研究非常有必要。因此，本文對LC2W_2170進(jìn)行克隆，并在E.coli中異源表達(dá)，為該蛋白進(jìn)一步的分離純化、功能鑒定和對EPS生物合成調(diào)控機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

實(shí)驗(yàn)所用的菌株與質(zhì)粒如表1所示。

表1 本研究所使用的菌株與質(zhì)粒

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS(g/L)：細(xì)菌蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏10，檸檬酸氫二胺2，葡萄糖20，乙酸鈉8.3，K2HPO42，MgSO40.58，MnSO40.25，吐溫-80 1 mL。115 ℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基另加瓊脂粉20。

LB(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。121 ℃滅菌15 min。固體培養(yǎng)基另加瓊脂粉20。

1.1.3 試劑與儀器

質(zhì)粒提取、PCR純化試劑盒購自Axygen；限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、IPTG、高保真酶以及DNA marker購自大連寶生物公司；卡那霉素等購自上海生工；蛋白試劑盒購自康為世紀(jì)。電泳儀、電泳槽、凝膠成像儀，購自Bio-Rad公司；冷凍離心機(jī)，購自Sigma公司；厭氧培養(yǎng)箱，購自RUSKINN公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中干酪乳桿菌LC2W的LC2W_2170基因完整序列，設(shè)計(jì)引物并由生工生物工程(上海)股份有限公司合成(表2)。

表2 PCR擴(kuò)增所用的引物及其序列

1.2.2 重組質(zhì)粒pKLH01和pZX100的構(gòu)建

以干酪乳桿菌基因組為模板，用LC2W_2170-F/LC2W_2170-R和LC2W_2170-R/LC2W_2170-F1兩對引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子LC2W_2170。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min，98℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃，10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測，并用純化試劑盒回收。LC2W_2170-F/LC2W_2170-R純化產(chǎn)物和pET24a分別用NdeI和XhoI雙酶切，純化回收；LC2W_2170-R/LC2W_2170-F1和pET30a分別用EcoRI和XhoI雙酶切純化回收，16 ℃，連接1 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliTop10，提取質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證正確后送上海生工測序，測序成功的重組質(zhì)粒分別命名為pKLH01和pZX100，轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)，涂布在含有卡那霉素(Kan)的LB固體培養(yǎng)基平板上進(jìn)行篩選。

1.2.3 IPTG濃度對蛋白可溶性表達(dá)的影響

將質(zhì)粒pET24a、pKLH01和pZX100轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)，將含有重組質(zhì)粒的BL21(DE3)接種于4 mL含卡那霉素(Kan)的LB液體培養(yǎng)基(kan終濃度為50 μg/mL)中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)過夜。以1%的接種量接種于新鮮LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600約0.6時(shí)，加入IPTG至終濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L，37℃，200 r/min 誘導(dǎo)表達(dá)3 h。

取菌液1 mL，12 000 r/min離心1 min，棄上清，無菌水重懸后取80 μL菌液，加入20 μL上樣緩沖液后于100℃煮沸5 min，離心取上清至新1.5 mL EP管，-20 ℃冷卻備用。取上述樣品，進(jìn)行SDS-PAGE分析(采用康為世紀(jì)SDS-PAGE試劑盒)，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%。電泳結(jié)束后凝膠染色2 h，將脫色后的凝膠用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)照相。

1.2.4 不同溫度對蛋白可溶性表達(dá)的影響

細(xì)胞培養(yǎng)至OD600約為0.6時(shí)，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，分別在28 ℃和37 ℃誘導(dǎo)，收集菌體，按1.2.3方法進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.5 不同菌株對蛋白可溶性表達(dá)的影響

將pET24a、pKLH01和pZX100分別轉(zhuǎn)化至E.coliC43(DE3)和E.coliRosetta(DE3)中，培養(yǎng)至OD600約為0.6時(shí)，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG，37℃誘導(dǎo)3 h，收集菌體，按1.2.3方法進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.6 切除跨膜區(qū)域?qū)Φ鞍卓扇苄员磉_(dá)的影響

1.2.6.1 切除跨膜區(qū)域重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以干酪乳桿菌基因組為模板，用引物Tru_orf2170-F/LC2W_2170-R1和Tru_orf2170-F1/LC2W_2170-R1兩對引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增LC2W_2170基因。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min,98 ℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃，10 min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測，并用純化試劑盒回收。Tru-orf2170-F1/LC2W_orf2170-R1和pET30a分別用EcoRI和XhoI雙酶切純化回收；Tru-orf2170-F/LC2W_orf2170-R1純化產(chǎn)物和pET30a分別用NdeI和XhoI雙酶切，純化回收，16 ℃，連接1 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliTop10，提取質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證正確后送上海生工測序，測序正確的質(zhì)粒分別命名為pKLH12和pKLH11。

1.2.6.2 重組質(zhì)粒pKLH11和pKLH12的表達(dá)

將pET24a、pKLH11和pKLH12轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)，培養(yǎng)至OD600約為0.6時(shí)，加入IPTG分別至終濃度為0、0.2、0.4、0.6和0.8 mmol/L，37 ℃，200 r/min 誘導(dǎo)表達(dá)3 h，收集菌體，按1.2.3方法進(jìn)行SDS-PAGE分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pKLH01和pZX100的構(gòu)建

干酪乳桿菌中存在與EPS合成有關(guān)的基因簇，并且該基因簇中存在一個(gè)假定的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子LC2W_2170。本實(shí)驗(yàn)以LC2W基因組為模板，利用PCR擴(kuò)增出目的基因LC2W_2170，預(yù)期條帶大小為897 bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示(圖1A)，在750 bp與1 000 bp之間有明顯特異性擴(kuò)增條帶，片段大小與理論預(yù)期值一致。

將擴(kuò)增出的目的基因LC2W_2170經(jīng)酶切后分別連入表達(dá)載體pET30a和pET24a，轉(zhuǎn)化至E.coliTop10，挑取陽性轉(zhuǎn)化子過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定。結(jié)果顯示(圖1B)雙酶切獲得1條約800 bp及1條約5 400 bp的條帶。前者與插入片段大小一致，后者與pET24a和pET30a大小相一致，2種重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和PCR擴(kuò)增鑒定正確。

對重組質(zhì)粒進(jìn)一步通過測序來進(jìn)行鑒定，經(jīng)過軟件分析比對，結(jié)果表明：插入片段的序列同NCBI中公布的結(jié)構(gòu)基因序列完全一致，且插入方向和讀碼框架均正確無誤，表明目的基因LC2W_2170正確插入到了pET24a和pET30a載體中，成功構(gòu)建了C端含有His-tag的重組質(zhì)粒pKLH01及C端和N端都含有His-tag的重組質(zhì)粒pZX100，重組質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖(圖1C)。

(A)目的基因LC2W_2170的克??；M：DNA marker DL 2000；1：pZX100質(zhì)粒中LC2W_2170；2：pKLH01質(zhì)粒中LC2W_2170。(B)重組質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證；M：DNA marker DL 10000；1：pZX100質(zhì)粒雙酶切結(jié)果；2：pKLH01質(zhì)粒雙酶切結(jié)果；3：pZX100質(zhì)粒電泳結(jié)果；4：pKLH01質(zhì)粒電泳結(jié)果。(C)表達(dá)載體結(jié)構(gòu)示意圖；T7 promoter：T7啟動(dòng)子；RBS：核糖體結(jié)合位點(diǎn)；His-tag：組氨酸純化標(biāo)簽；LC2W_2170：LC2W_2170基因；Terminator：終止子圖1 LC2W_2170蛋白表達(dá)重組質(zhì)粒構(gòu)建與驗(yàn)證Fig.1 Construction and validation of recombinant plasmid of LC2W_2170

2.2 不同條件對重組蛋白可溶性表達(dá)的影響

為研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子LC2W_2170性質(zhì)和功能，將pZX100和pKLH01轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)、C43(DE3)和Rosseta(DE3)中進(jìn)行蛋白表達(dá)，分別在28 ℃和37 ℃兩種溫度，以及在不同IPTG濃度(0、0.2、0.4、0.6和0.8 mmol/L)下誘導(dǎo)下。LC2W_2170蛋白分子量約為30 kDa，但通過SDS-PAGE分析(圖2)，各泳道中25～35 kDa之間與對照組泳道1相比，并無明顯蛋白表達(dá)，表明LC2W_2170蛋白在E.coli中并未可溶性表達(dá)。

M-蛋白marker；1-pET24a(對照)；2-pKLH01，未加IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；3-pKLH01，0.2 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；4-pKLH01，0.4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；5-pKLH01，0.6 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；6-pKLH01，0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)圖2 不同條件對LC2W_2170重組蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of different conditions on the expression of LC2W_2170

2.3 切除跨膜區(qū)域?qū)Φ鞍妆磉_(dá)的影響

2.3.1 切除跨膜區(qū)域重組質(zhì)粒構(gòu)建與驗(yàn)證

為解決LC2W_2170蛋白在E.coli中未表達(dá)問題，我們對此蛋白進(jìn)行了序列分析。利用Phobius服務(wù)器(http://phobius.sbc.su.se)對LC2W_2170蛋白氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白N端存在跨膜區(qū)(前27個(gè)氨基酸為跨膜序列，圖3A)，所以很可能是此跨膜區(qū)影響了蛋白表達(dá)。利用NCBI蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域搜索(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)顯示(圖3B)，LC2W_2170蛋白的保守結(jié)構(gòu)域(如Cps2a保守結(jié)構(gòu)域)并不包括跨膜序列。因此，截去跨膜區(qū)并不影響LC2W_2170蛋白的功能。由于前面的實(shí)驗(yàn)用E.coli并沒有成功表達(dá)LC2W_2170蛋白，所以嘗試去除此蛋白的跨膜區(qū)來提高表達(dá)。設(shè)計(jì)引物PCR擴(kuò)增不含此跨膜區(qū)域的LC2W_2170目的基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示(圖3C)，在800 bp附近出現(xiàn)單一條帶，與目的片段大小相符。

將PCR產(chǎn)物插入表達(dá)載體后，提取重組質(zhì)粒酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果顯示(圖3D)雙酶切獲得1條800 bp及1條約5 400 bp的片段，與預(yù)期結(jié)果相符合，表明目的基因已經(jīng)連接到載體pET30a上，分別構(gòu)建C端含有His-tag及C端和N端均含有His-tag的重組質(zhì)粒pKLH11和pKLH12(圖3E)。將重組質(zhì)粒送測序鑒定，測序結(jié)果再次證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3.2 切除跨膜區(qū)的LC2W_2170重組質(zhì)粒在大腸桿菌中表達(dá)

將切除跨膜區(qū)域重組表達(dá)質(zhì)粒pKLH11、pKLH12以及對照pET30a轉(zhuǎn)化至E.coliBL21(DE3)，37 ℃培養(yǎng)至OD600約為0.6時(shí)，加入不同濃度(終濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L)的IPTG誘導(dǎo)后，進(jìn)行SDS-PAGE分析。發(fā)現(xiàn)所有IPTG濃度都能誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，不管是C端含有His蛋白標(biāo)簽的pKLH11，還是C端和N端均含有His蛋白標(biāo)簽的pKLH12，在30 kDa處有明顯的表達(dá)蛋白條帶(圖4A和4B)，并與預(yù)測的LC2W_2170蛋白大小相當(dāng)。而未誘導(dǎo)的含重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌以及未誘導(dǎo)的含pET30a質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化菌(對照)都無目的蛋白條帶，說明此蛋白條帶的出現(xiàn)與IPTG的誘導(dǎo)密切相關(guān)，而不是宿主菌本身的蛋白。同時(shí)也表明該蛋白在之前條件下未表達(dá)，是由于此蛋白跨膜區(qū)域的存在影響了其在E.coli中的可溶性表達(dá)。

(A)pKLH11蛋白表達(dá)結(jié)果；M蛋白marker；1：對照pET30a；2：未加IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)；3：0.2 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)；4：0.4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)；5：0.6 mmol/L IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)；6：0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。(B)pKLH12蛋白表達(dá)結(jié)果；M蛋白marker；1：對照pET30a蛋白表達(dá)；2：未加IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)；3：0.2 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)蛋白表達(dá)；4：0.4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)；5：0.6 mmol/L IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)；6：0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)圖4 切除跨膜區(qū)LC2W_2170蛋白在大腸桿菌中表達(dá)Fig.4 Truncated LC2W_2170 expression in E.coli

3 討論

乳酸菌能夠促進(jìn)消化，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的攝取，在機(jī)體腸道內(nèi)產(chǎn)生有機(jī)酸、細(xì)菌素和EPS等益生因子，從而維持腸道平衡、增強(qiáng)生物屏障功能和減少疾病的發(fā)生[19]。EPS在乳酸菌胞內(nèi)生物合成的效率普遍偏低，目前其調(diào)控機(jī)制研究鮮有報(bào)道，這些已成為制約其在食品工業(yè)中應(yīng)用的重要因素。

利用基因工程改造是提高乳酸菌EPS產(chǎn)量的重要途徑[20-21]。例如，在干酪乳桿菌LC2W中，通過過表達(dá)NADH氧化酶基因，發(fā)現(xiàn)可以顯著增加EPS產(chǎn)量[15]。STINGELE等成功地將嗜熱鏈球菌Sfi6的EPS合成基因簇轉(zhuǎn)入乳球菌MG1363中，使乳球菌能高效表達(dá)嗜熱鏈球菌EPS[22]。VAN KRANENBURG等通過在乳酸菌內(nèi)高效表達(dá)參與EPS合成的糖基轉(zhuǎn)移酶，顯著地提高了EPS的產(chǎn)量[23]。但目前并沒有利用基因工程方法對乳酸菌EPS生物合成中調(diào)控蛋白進(jìn)行研究，因此展開乳酸菌EPS生物合成中調(diào)控蛋白功能研究，對進(jìn)一步了解乳酸菌EPS的生物合成和調(diào)控機(jī)制研究具有重要意義。

為研究乳酸菌EPS生物合成中調(diào)控蛋白功能，對其蛋白表達(dá)純化是展開體外功能研究的先決條件。本文以干酪乳桿菌LC2W的EPS基因簇中途徑特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子LC2W_2170為研究對象，采用最常用的E.coli蛋白表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行蛋白表達(dá)，其中E.coliBL21(DE3)是以T7 RNA聚合酶為表達(dá)系統(tǒng)的高效外源基因的蛋白表達(dá)宿主，pET系列載體是利用E.coliT7噬菌體的轉(zhuǎn)錄體系為元件構(gòu)建的高效表達(dá)載體，也是目前最有效的E.coli表達(dá)載體。研究表明，在C端或者是N端含有His-tag目的蛋白易于表達(dá)，并且能夠增加目的蛋白的表達(dá)量[24]，同時(shí)也有利于后續(xù)對重組蛋白的純化。因此，本文構(gòu)建了C端或N端含有His-tag重組質(zhì)粒來表達(dá)LC2W_2170。但是將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli表達(dá)宿主中，無論是改變溫度，采用不同IPTG誘導(dǎo)濃度、不同表達(dá)宿主，和選擇不同誘導(dǎo)時(shí)間，LC2W_2170蛋白都未成功實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)。

為實(shí)現(xiàn)LC2W_2170蛋白的成功表達(dá)，我們對此蛋白的氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其N端存在跨膜區(qū)，可能造成蛋白在E.coli表達(dá)時(shí)跨膜信號肽翻譯不完全等問題[25]。因此，本文對其N端跨膜區(qū)(前27個(gè)氨基酸為跨膜序列)采用了截短策略，去除跨膜區(qū)后的重組質(zhì)粒在E.coliBL21(DE3)中成功實(shí)現(xiàn)LC2W_2170蛋白可溶性表達(dá)。本研究不僅可為其他具有跨膜結(jié)構(gòu)的調(diào)控蛋白在E.coli中表達(dá)作為一個(gè)成功范例，還為純化該轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，研究其功能及其對胞外多糖生物合成基因簇的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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Heterologous expression of the transcriptional regulator in the exopolysaccharides gene cluster fromLactobacilluscaseiinEscherichiacoli

KONG Ling-hui1, ZHOU Wei2, WANG Guang-qiang1, XIA Yong-jun1, Zhang Hui1,LI Hong-mei1, AI Lian-zhong1, XIONG Zhi-qiang1*

1(School of Medical Instrument and Food Engineering, University ofShanghaifor Science and Technology, Shanghai 200093, China)2(Kangyuan Dairy Co. Ltd, Yangzhou University, Yangzhou 225004, China)

To study biosynthesis of exopolysaccharides (EPS) and its transcriptional regulation, the putative transcriptional regulator, LC2W_2170, of EPS biosynthetic gene cluster fromLactobacilluscaseiwas cloned and expressed inE.coli.LC2W_2170 gene from the genome ofL.caseiwas amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into the vector pET24a and pET30a with His-tag fused to the N-or C- and N-terminus of LC2W_2170. However, the target protein LC2W_2170 cannot be expressed inE.coliafter isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) induction. Through analyzing the amino acid sequence of LC2W_2170 using Phobius server, there was a trans-membrane region at the N- terminal (the first 27 amino acids) of LC2W_2170. LC2W_2170 protein was successfully expressed inE.coliBL21 (DE3) after removal of the trans-membrane region. These results would be helpful for protein purification and transcriptional regulation of exopolysaccharides biosynthesis gene cluster.

Lactobacilluscasei; exopolysaccharides; transcription regulator; heterologous expression;Escherichiacoli

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705002

博士研究生(熊智強(qiáng)副教授為通訊作者,E-mail：xiongzq@hotmail.com)。

國家自然科學(xué)基金(31371809)；新世紀(jì)優(yōu)秀人才計(jì)劃(NCET-13-0901)；上海市曙光計(jì)劃項(xiàng)目(15SG42)；中國科學(xué)院合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題

2016-12-05，改回日期：2017-02-07