大鼠局灶性腦梗死后大腦皮質(zhì)PRX6表達(dá)和MDA含量的變化

林占東，郭瑞芳，羅 凡，陳 婷，李 雪

（1.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院）

大鼠局灶性腦梗死后大腦皮質(zhì)PRX6表達(dá)和MDA含量的變化

林占東1，郭瑞芳2△，羅 凡1，陳 婷1，李 雪1

（1.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院）

目的:觀察局灶性腦梗死大鼠梗死區(qū)大腦皮質(zhì)過氧化物酶6（peroxiredox6，PRX6）表達(dá)和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量的變化。方法：30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組，采用線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞模型，各組大鼠分別于術(shù)后1d、3d、7d處死取材。采用硫代巴比妥酸法檢測(cè)梗死區(qū)大腦皮質(zhì)MDA的含量，Western blot法和qRT-PCR法檢測(cè)梗死區(qū)大腦皮質(zhì)PRX6蛋白和mRNA的表達(dá)。結(jié)果：模型組各時(shí)間點(diǎn)大鼠梗死區(qū)大腦皮質(zhì)MDA含量，PRX6蛋白、mRNA表達(dá)均明顯高于對(duì)照組（P＜0.01）。隨著術(shù)后時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組大鼠梗死區(qū)大腦皮質(zhì)MDA含量逐漸降低，PRX6蛋白、mRNA表達(dá)逐漸升高（P＜0.01）。結(jié)論：大鼠腦梗死后可能通過上調(diào)PRX6的表達(dá)水平減輕氧化應(yīng)激損傷。

局灶性腦梗死；過氧化物酶6；氧化應(yīng)激；丙二醛

氧化應(yīng)激是指機(jī)體遭受各種有害刺激（如缺血、缺氧等）時(shí)體內(nèi)產(chǎn)生過量高活性分子(如活性氧自由基ROS等），超出自身的清除能力，從而導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、蛋白質(zhì)變性、DNA損傷等一系列病理變化[1]。大腦是對(duì)氧化應(yīng)激非常敏感的器官，與其它器官相比，腦組織更容易生成活性氧并受到活性氧的攻擊。已有研究表明，氧化應(yīng)激是大腦缺血性損傷的重要原因[2]。過氧化物酶6（PRX6）是一種重要的抗氧化酶，功能主要是還原H2O2和磷脂過氧化物[3]。本研究通過建立局灶性腦梗死大鼠模型，觀察大鼠腦梗死組織PRX6表達(dá)的變化，探討其在大鼠腦梗死中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)雄性SD大鼠，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)SCXK（京）2012-0001。兔抗大鼠PRX6抗體，美國(guó)艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；辣根酶標(biāo)記抗兔IgG二抗，美國(guó)KPL公司；PRX6引物，大連寶生物工程有限公司；丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒，中國(guó)南京建成生物公司；Trizol試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及造模 30只雄性SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組，每組15只。參照文獻(xiàn)[4]，模型組大鼠采用左側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞法制備局灶性腦梗死模型；對(duì)照組只分離血管，不栓塞結(jié)扎。模型組大鼠于造模后2h參照文獻(xiàn)[5]的方法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分，選1-3分的大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。

1.3 取材 對(duì)照組和模型組分別于造模后1d、3d、7d（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只大鼠）用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，30s內(nèi)斷頭處死。模型組取左側(cè)梗死區(qū)大腦皮質(zhì)，對(duì)照組取左側(cè)相同部位的大腦皮質(zhì)，-80℃冰箱保存。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 檢測(cè)MDA含量：取大腦皮質(zhì)，裂解后勻漿，離心取上清，采用硫代巴比妥酸（TBA）法檢測(cè)MDA的含量，具體操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4.2 檢測(cè)PRX6蛋白表達(dá)：采用Western blot法。取大腦皮質(zhì)，勻漿后提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白含量。蛋白上樣量30μg，12% SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2h，一抗（1：3000）4℃過夜，二抗室溫2h，漂洗后加發(fā)光液，膠片曝光。采用Image J軟件分析灰度值，以目的蛋白與β-actin灰度值的比值作為PRX6蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4.3 檢測(cè)PRX6 mRNA表達(dá)：采用qRT-PCR法。取大腦皮質(zhì)，Trizol法提取總RNA后逆轉(zhuǎn)為cDNA，于-20℃保存。PRX（6NM-053576.2）基因引物序列：上游引物，5’-CGC TTC CAC GAT TTC CTA-3’； 下游引物，5’-CAT TGA TGT CCT TGC TCC-3’。擴(kuò)增反應(yīng)體系內(nèi)含cDNA模板1 l，2×Super Real PreMix Plus 12.5 l，上、下游引物各0.75 l，95℃預(yù)變性10min、95℃1 0s、60℃ 20s、72℃ 15s，共30個(gè)循環(huán)，末次延伸72℃10min。使用Δ Δ Ct值計(jì)算目的基因表達(dá)水平：Δ Ct=目的基因Ct值-β-actin基因Ct值，Δ Δ Ct=實(shí)驗(yàn)組Δ Ct-對(duì)照組Δ Ct，目的基因相對(duì)總量=2-ΔΔCt。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。服從正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，行析因方差分析，方差齊時(shí)采用LSD法，方差不齊時(shí)采用Dunnett T3法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

對(duì)照組大鼠各時(shí)間點(diǎn)大腦皮質(zhì)MDA含量，PRX6蛋白、mRNA表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，模型組大鼠梗死區(qū)大腦皮質(zhì)MDA含量逐漸降低，PRX6蛋白、mRNA表達(dá)逐漸升高，兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；相同時(shí)間點(diǎn)比較：模型組各時(shí)間點(diǎn)大鼠梗死區(qū)大腦皮質(zhì)MDA含量，PRX6蛋白、mRNA表達(dá)均明顯高于對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)（P＜0.01）。見附表：

附表 各組大鼠大腦皮質(zhì)MDA含量和PRX6蛋白、mRNA表達(dá)情況（±s，n=5）

附表 各組大鼠大腦皮質(zhì)MDA含量和PRX6蛋白、mRNA表達(dá)情況（±s，n=5）

與對(duì)照組同時(shí)間點(diǎn)比較：aP＜0.01；與模型組1d組比較：bP＜0.01；與模型組3d組比較：cP＜0.01

組別和時(shí)間點(diǎn) MDA含量（mmol/mg蛋白）PRX6蛋白 mRNA對(duì)照組1d 3.94±0.16 0.575±0.011 1.000 3d 3.97±0.21 0.571±0.012 1.000 7d 3.99±0.25 0.583±0.009 1.000 1d 12.64±0.60a 0.644±0.009a 1.091±0.015a3d 8.99±0.36ab 0.858±0.029ab 1.268±0.032ab7d 6.76±0.24abc 1.085±0.034abc 1.397±0.016abc模型組

3 討論

當(dāng)組織缺血、缺氧時(shí)，會(huì)導(dǎo)致大量ROS的產(chǎn)生，ROS過量可引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等重要細(xì)胞成分氧化，最終導(dǎo)致細(xì)胞損傷甚至死亡[6]。脂質(zhì)過氧化物中MDA的毒性最大，其含量可作為反應(yīng)組織過氧化損傷程度的客觀指標(biāo)[7]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，模型組各時(shí)間點(diǎn)大腦皮質(zhì)MDA的含量明顯升高，說明腦缺血可造成大鼠腦組織損傷并誘發(fā)了腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)。

過氧化物酶6（PRX6）是含有1個(gè)Cys殘基的Prx單體，具有過氧化物酶和磷脂酶A2活性雙重功能，有抗氧化和清除ROS的作用[8]。PRX6與過氧化物反應(yīng)過程中其Cys殘基被氧化，而氧化的Prx6 Cys殘基可被谷胱甘肽還原，參與過氧化物的還原過程[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，模型組各時(shí)間點(diǎn)PRX6蛋白和mRNA的表達(dá)均明顯升高，并且隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，PRX6蛋白和mRNA的表達(dá)逐漸顯升高、MDA的含量逐漸降低，提示腦缺血時(shí)機(jī)體啟動(dòng)了內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，從而能減輕氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述，大鼠腦缺血時(shí)，大腦皮質(zhì)PRX6的表達(dá)明顯升高，并且隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)PRX6的表達(dá)水平逐漸升高，提示腦缺血可啟動(dòng)機(jī)體的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，從而減輕氧化應(yīng)激損傷。因此，通過上調(diào)PRX6的表達(dá)水平減輕氧化應(yīng)激損傷，可能為改善腦梗死患者的預(yù)后提供新思路。

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CHANGES OF PRX6 EXPRESSION AND MDA CONTENT IN CEREBRAL CORTEX OF RATS AFTER LOCAL CEREBRAL INFARCTION

LIN Zhan-dong, GUO Rui-fang, LUO Fan, et al
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective: To investigate the changes of peroxiredox6 (PRX6) expression and malondialdehyde (MDA) content in cerebral cortex of rats after local cerebral infarction. Methods: 30 male SD rats were randomly divided into control group and model group. Suture method was used to establish middle cerebral artery occlusion rats’ model, and the rats were killed respectively 1d, 3d, 7d after operation. Thiobarbituric acid method was used to detect the MDA content in cerebral cortex, Western blot and qRT-PCR to detect PRX6 protein and mRNA expression in cerebral cortex. Results: The MDA content and PRX6 expression in infarct area of cerebral cortex of rats in model group at each time point were obviously higher than control group (P＜0.01). With time extension after operation, the MDA content declined gradually, while the PRX6 expression increased gradually (P＜0.01). Conclusions: After cerebral farction, the rats may reduce oxidative stress injury by upregulating PRX6 expression.

Local cerebral infarction; PRX6; Oxidative stress ; MDA

R363.2

A

1004-6879（2017）03-0188-03

2016-10-01）

△ 通訊作者