絲膠對(duì)2型糖尿病大鼠視網(wǎng)膜NF-κB表達(dá)的影響*

楊 帆，董志軍△，董微麗△，張鐵民，陳志宏，于宏飛

（1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室）

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)

絲膠對(duì)2型糖尿病大鼠視網(wǎng)膜NF-κB表達(dá)的影響*

楊 帆1，董志軍1△，董微麗1△，張鐵民1，陳志宏2，于宏飛1

（1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院眼科，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室）

目的:探討絲膠對(duì)2型糖尿病大鼠視網(wǎng)膜核因子-κB(NF-κB)表達(dá)的影響。方法：48只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組、糖尿病模型組、絲膠治療組和導(dǎo)升明組，每組12只。除正常對(duì)照組外，其余3組大鼠均采用高糖高脂飲食誘導(dǎo)聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素(25mg/kg/d，3d)腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型。待模型建成后，絲膠治療組大鼠給予絲膠(2.4g/kg/d，35d)灌胃治療，導(dǎo)升明組大鼠給予導(dǎo)升明(200mg/kg/d，35d)灌胃。Western blot法檢測(cè)視網(wǎng)膜NF-κB蛋白的表達(dá)，RT-PCR法檢測(cè)視網(wǎng)膜NF-κB mRNA的表達(dá)。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，糖尿病模型組大鼠NF-κB蛋白和mRNA的表達(dá)明顯升高(P＜0.05)；與糖尿病模型組比較，絲膠治療組和導(dǎo)升明組大鼠NF-κB蛋白和mRNA的表達(dá)顯著降低(P＞0.05)。結(jié)論：絲膠可通過(guò)下調(diào)NF-κB表達(dá)，發(fā)揮對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜損傷的保護(hù)作用。

絲膠；糖尿病視網(wǎng)膜病變；NF-κB

隨著生活水平的提高，糖尿病患病人數(shù)逐年增加，其慢性微血管并發(fā)癥之一的糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）亦越來(lái)越受到人們的關(guān)注[1-2]。DR發(fā)生的確切原因不明，近來(lái)有人提出它是一種慢性炎癥性疾病[3]。 核因子-κB(NF-κB)是一種普遍存在于各類(lèi)細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生理病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[4-5]。絲膠是一種蠶繭水提物，已有研究發(fā)現(xiàn)絲膠能有效降低2型糖尿病大鼠的血糖，以及保護(hù)糖尿病時(shí)腎臟和中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷[6]。但關(guān)于絲膠對(duì)DR是否有保護(hù)作用的研究尚少。本研究擬通過(guò)觀察絲膠對(duì)DR大鼠視網(wǎng)膜NF-κB表達(dá)的變化，探究絲膠對(duì)DR微血管病變的保護(hù)作用，為絲膠治療DR提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥物與主要試劑：蠶繭，承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所；導(dǎo)升明，奧地利依比威藥品有限公司；鏈脲佐菌素(STZ)，美國(guó)Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；小鼠抗NF-κB單克隆抗體，英國(guó)Abcam公司；小鼠抗β-actin單克隆抗體，美國(guó)Santa Cruz公司；即用型HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，美國(guó)KPL公司；NF-κB引物，美國(guó)Invitrogen公司；RT-PCR試劑盒，日本Takara公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)象：SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重200-250g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK (京) 2012-0001。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象處理：48只SD大鼠隨機(jī)平分為4組。正常對(duì)照組大鼠給予普通飼料喂養(yǎng)；其余3組大鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，并給予STZ(25mg/kg/d，3d)腹腔注射，以空腹血糖≥11.1mmol/L作為2型糖尿病大鼠成模標(biāo)準(zhǔn)。模型建成后，絲膠治療組大鼠給予絲膠(2.4g/kg/d，35d)灌胃，導(dǎo)升明組大鼠給予導(dǎo)升明(200mg/kg/d，35d)灌胃，其余兩組大鼠給予相同劑量生理鹽水灌胃相同時(shí)間。

1.2.2 標(biāo)本制備：10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后迅速摘除雙側(cè)眼球，分離視網(wǎng)膜組織，液氮中速凍后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中保存，用于NF-κB蛋白和mRNA的檢測(cè)。

1.2.3 Western blot法檢測(cè)視網(wǎng)膜NF-κB蛋白表達(dá)： 提取視網(wǎng)膜組織中總蛋白，BCA蛋白試劑盒測(cè)定蛋白濃度。各組上樣量為50μg，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉TBST封閉2h，分別加入一抗NF-κB(1∶500)和β-actin(1∶1000)，4℃過(guò)夜，二抗室溫?fù)u床孵育1h，ECL超敏發(fā)光液顯影。掃描膠片，應(yīng)用凝膠分析軟件對(duì)條帶光密度值進(jìn)行分析，將β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算NF-κB條帶與β-actin條帶的灰度比值。

1.2.4 RT-PCR法檢測(cè)視網(wǎng)膜NF-κB mRNA的表達(dá)：按TaKaRa總RNA抽提說(shuō)明書(shū)提取大鼠視網(wǎng)膜組織中的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性，2min；94℃變性，30s；56-60℃退火，30s；72℃延伸，45s-1min，第2步起循環(huán)。PCR引物序列及擴(kuò)增條件見(jiàn)表1。取10μl擴(kuò)增產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳(120V，40min)，圖像攝取采用ZF型紫外透射反射分析儀，應(yīng)用凝膠分析軟件進(jìn)行定量分析，將β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算NF-κB條帶與β-actin條帶的灰度比值。

表1 PCR引物序列及擴(kuò)增條件

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠視網(wǎng)膜NF-κB蛋白的表達(dá) Western blot結(jié)果顯示：NF-κB蛋白條帶在蛋白Marker的65KD處可見(jiàn)，β-actin蛋白條帶在蛋白Marker的43KD處可見(jiàn)。視網(wǎng)膜NF-κB蛋白的表達(dá)，在糖尿病模型組大鼠明顯高于正常對(duì)照組大鼠(P＜0.05)；在絲膠治療組和導(dǎo)升明組大鼠明顯低于糖尿病模型組大鼠(P＜0.05)，且二組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜NF-κB mRNA的表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示：NF-κB mRNA條帶在DNA Marker的380bp水平處可見(jiàn)，β-actin mRNA條帶在DNA Marker的452bp水平處可見(jiàn)。視網(wǎng)膜NF-κB mRNA的表達(dá)，在糖尿病模型組大鼠明顯高于正常對(duì)照組大鼠(P＜0.05)；在絲膠治療組和導(dǎo)升明組大鼠明顯低于糖尿病模型組大鼠(P＜0.05)，且二組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見(jiàn)表2：

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜NF-κ B蛋白和mRNA的表達(dá)（±s ）

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜NF-κ B蛋白和mRNA的表達(dá)（±s ）

與糖尿病模型組比較：*P＜0.05；與導(dǎo)升明組比較：#P＞0.05

組別 n NF-κB蛋白 NF-κB mRNA正常對(duì)照組 12 0.6018±0.0261* 0.5252±0.0173*糖尿病模型組 12 1.5317±0.0172 1.4197±0.0135絲膠治療組 12 0.7069±0.1755*# 0.7081±0.0287*#導(dǎo)升明組 12 0.6946±0.0125* 0.6989±0.0158*

3 討論

NF-κB是一種細(xì)胞內(nèi)重要的核轉(zhuǎn)錄因子。在靜息狀態(tài)下，NF-κB在細(xì)胞漿中與其抑制單位κB（IκB）結(jié)合形成無(wú)活性的化合物，受到缺氧、高糖及炎性因子等刺激后，NF-κB從細(xì)胞漿轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核內(nèi)，恢復(fù)其轉(zhuǎn)錄活性，廣泛參與體內(nèi)的炎癥反應(yīng)[7]。同時(shí)，被激活的NF-κB能刺激多種炎癥因子的表達(dá)，包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、血小板源性生長(zhǎng)因子(PDGF)、細(xì)胞間黏附分子(ICAM-1)、白細(xì)胞介素(IL)等，從而加重炎癥反應(yīng)[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB蛋白及mRNA在糖尿病模型組處于高表達(dá)狀態(tài)。糖尿病時(shí)長(zhǎng)期的高血糖可導(dǎo)致全身代謝出現(xiàn)異常，視網(wǎng)膜毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞，從而引起視網(wǎng)膜血流動(dòng)力學(xué)的改變，當(dāng)視網(wǎng)膜長(zhǎng)時(shí)間處于缺血、缺氧狀態(tài)時(shí)，會(huì)引起視網(wǎng)膜局部炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，誘導(dǎo)NF-κB表達(dá)異常升高，進(jìn)而增加多種炎癥因子的基因轉(zhuǎn)錄，從而參與糖尿病及其微血管病變的發(fā)生發(fā)展。由此可見(jiàn)，NF-κB可能是DR的中心調(diào)節(jié)因子。

蠶繭是蠶蛾的繭殼，《本草綱目》中記載：蠶繭，味甘、性溫，無(wú)毒，煮湯治消渴。糖尿病乃中醫(yī)的“消渴癥”，民間早就有用蠶繭泡水降低血糖的方法。以前人們對(duì)蠶絲的利用主要集中在絲素上，而絲膠則作為廢料被丟棄。近年來(lái)，許多研究者們開(kāi)展了對(duì)絲膠的研究，并發(fā)現(xiàn)其具有抑制炎癥反應(yīng)、抑制氧化應(yīng)激、促進(jìn)細(xì)胞增殖等功效[9-11]。本研究結(jié)果顯示：絲膠治療組大鼠視網(wǎng)膜NF-κB蛋白及mRNA的表達(dá)較糖尿病模型組明顯降低，說(shuō)明絲膠可通過(guò)下調(diào)NF-κB的表達(dá)，減輕DR的炎癥反應(yīng)，遏制糖尿病視網(wǎng)膜損傷的進(jìn)展，但絲膠調(diào)控NF-κB表達(dá)的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。由于絲膠是天然的蛋白質(zhì)，具有毒副作用小的優(yōu)點(diǎn)，因此可能為DR提供新的治療方法。

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EFFECTS OF SERICIN ON NF-ΚB EXPRESSION IN RETINA OF TYPE 2 DIABETIC RATS

YANG Fan, DONG Zhi-jun, DONG Wei-li, et al
(Department of Ophthalmology, the Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective: To investigate the effects of sericin on expression of NF-κB in retina of type 2 diabetic rats. Methods: 48 male SD rats were randomly divided into 4 groups(n=12): nomal control group, diabetes model group, sericin treatment group and doxium treatment group. Except rats in nomal control group, the type 2 diabetes model rats were made by high sugar and high fat diet combined with small dose of streptozotocin (25mg/kg/d, 3d) by continuous intraperitoneal injection in the other 3 groups. After the diabetes animal model was successfully established, the rats in sericin treatment group were lavaged with sericin for 35d (2.4g/kg/d), the rats in doxium treatment group were lavaged with doxium for 35d (200mg/kg/d). Western blot and RT-PCR were used to detect the expression of NF-κB protein and mRNA in retina respectively. Results: Compared with nomal control group, the NF-κB expression in retina of rats in diabetes model group increased obviously (P＜0.05). Compared with diabetes model group, the NF-κB expression in retina of rats in sericin treatment group and doxium treatment group decreased obviously (P＞0.05). Conclusions: Sericin has protective effects on diabetic retinophathy by downregulating NF-κB expression in retina.

Sericin; Diabetic retinopathy; NF-κB

R587.1

A

1004-6879（2017）03-0181-03

2016-09-01）

*國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81441133），河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（H2012406018）

△通訊作者