羧基甜菜堿型親水作用色譜柱的制備及性能研究

常宇陽+戴小軍+龔波林

摘 要 以甲基丙烯酰氧乙基二甲基乙酸銨（CBMA）為功能單體，利用表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（Surfaceinitiated atom transfer radical polymerization， SIATRP）技術(shù)，將CBMA接枝到硅膠表面，得到接枝聚合物CBMA的親水作用色譜固定相（SilicaCBMA）。通過改變SIATRP反應(yīng)體系中單體的濃度，制備了3種不同接枝量的親水作用色譜固定相。考察了SilicaCBMA固定相對有機酸類化合物的分離性能以及流動相中pH值、鹽濃度、水含量等因素對溶質(zhì)保留行為的影響。結(jié)果表明，在親水作用色譜模式下，SilicaCBMA固定相對有機酸類化合物的分離是離子交換作用與親水作用的混合色譜模式。流動相中鹽濃度增大，溶質(zhì)保留減弱，符合離子交換作用特征； 固定相和溶質(zhì)的離子化程度受流動相pH值影響較大，pH值增大，溶質(zhì)保留增強； 而溶質(zhì)的保留時間隨流動相水含量增加而降低則是典型的親水作用色譜特征。使用自制SilicaCBMA柱，建立了蘆丁片中維生素C、蘆丁含量的親水作用色譜測定方法，操作方法簡單，為強極性樣品的分離測定提供了新方法。

關(guān)鍵詞 親水作用色譜； 固定相； 羧基甜菜堿； 原子轉(zhuǎn)移自由基聚合

1 引 言

親水作用色譜（Hydrophilic interaction liquid chromatography，HILIC）作為一種分離強極性化合物的液相色譜模式，最早由Alpert于1990年提出[1]，其主要特征是使用極性固定相和水/水溶性有機溶劑（通常是乙腈）做流動相。作為HILIC分離的核心，HILIC固定相功能基的結(jié)構(gòu)直接影響其對溶質(zhì)的選擇性和分離效率。常見HILIC固定相可分為兩類，一類為小分子鍵合相，功能基為二醇基、氰基、氨基、酰胺基、半胱氨酸基、麥芽糖基[2]等的固定相； 另一類為聚合物鍵合相，功能基為聚琥珀酰亞胺[3]，聚磷酰膽堿[4]和聚磺酸基甜菜堿[5]的固定相。

含兩性甜菜堿型配基的固定相，功能基同時含有兩種相反電荷，結(jié)構(gòu)新穎，在20世紀80年代作為兩性離子固定相進入色譜領(lǐng)域[6]。在HILIC領(lǐng)域，普遍應(yīng)用的是含硫代甜菜堿功能基和含磷酰膽堿功能基兩性離子的商品柱，在蛋白組學、藥物分析、糖類化合物的分離中得到了廣泛應(yīng)用[7～9]。據(jù)報道，在溶液pH值3.0～8.0范圍內(nèi)，這2種兩性離子功能基表面改性的色譜固定相的ζ電勢均為負值，相當于色譜固定相表面被負離子修飾而帶負電荷[10，11]。相比較而言，在此pH值范圍內(nèi)，羧基甜菜堿兩性離子改性的色譜固定相的表面帶正電荷[12]。羧基甜菜堿兩性離子固定相在色譜領(lǐng)域最早報道是Elefterov等 [13]用賴氨酸類羧基甜菜堿兩性離子固定相分離金屬離子； Colman等[14]在硅膠基質(zhì)C18整體柱表面鍵合羧基甜菜堿改性涂層，應(yīng)用在離子色譜中，有效分離無機陰離子； Violeta等[15]使用交聯(lián)羧基甜菜堿型兩性離子固定相，選擇性分離無機鹽溶液中多種二，三價的重金屬離子。而羧基甜菜堿型功能單體在親水作用色譜領(lǐng)域中罕有報道。

表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合（Surfaceinitiated atom transfer radical polymerization， SIATRP）技術(shù)是近年發(fā)展起來的一種新型聚合技術(shù)，可在基材表面形成高密度聚合物分子鏈[16]，且兼具活性聚合和接枝鏈長可控等優(yōu)點[17]，在色譜固定相的制備方面也得到廣泛應(yīng)用。Pan等[18]通過SIATRP技術(shù)制備將2甲基丙烯酸3（2，4，5三羥基3氨基6羥甲基四氫吡喃）聚合物鏈接枝在硅膠微球表面，形成殼層結(jié)構(gòu)，可提供更多結(jié)合位點，有效固定植物凝聚素且提高了負載量； Takuya等[19]通過SIATRP技術(shù)將N異丙基丙烯酰胺接枝在聚苯乙烯整體柱上，與接枝N異丙基丙烯酰胺的空心毛細管柱相比，在水溶液環(huán)境中更有效地分離地塞米松，可的松等生物活性溶質(zhì)。

本研究使用甲基丙烯酰氧乙基二甲基乙酸銨（CBMA）作為功能單體，采用SIATRP技術(shù)，以硅膠為基質(zhì)，在鍵合引發(fā)劑的硅膠表面進行聚合反應(yīng)，通過改變功能單體的加入量，制備了接枝量不同的SilicaCBMA親水作用色譜固定相。使用有機酸類化合物作為探針，研究了流動相pH值、鹽濃度、水含量等因素對溶質(zhì)在SilicaCBMA固定相上保留的影響，建立了蘆丁片中維生素C含量的HILIC測定方法。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

島津LC20AT（SPDM20A 二極管陣列檢測器）高效液相色譜儀（日本島津公司）； PE Frontier 紅外光譜儀（美國珀金埃爾默公司）； Bruker Avance 400 MHz核磁共振儀（瑞士Bruker公司）； KQ3200E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）； BS224S型電子天平（德國賽多利斯科學儀器有限公司）； V77192US型高壓氣動泵（德國柏林諾爾公司）； Vario EL Ⅲ型元素分析儀（德國Elementar 公司）硅膠（粒徑：10 μm，平均孔徑： 10 nm，蘇州納微科技有限公司）； 氯乙酸鈉、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（DMAEMA）、2，2′聯(lián)二吡啶（Bpy）、溴化亞銅（CuBr）、三乙胺（TEA）、2溴異丁酰溴、苯甲酸、對甲苯磺酸、阿魏酸、肉桂酸、維生素C（分析純，阿拉丁試劑（上海）有限公司）； 乙腈（ACN，色譜級，美國Sigma公司）； 甲酸銨（分析純，廣州化學試劑廠）； 四氫呋喃（THF，加入金屬鈉回流6 h，干燥備用）、甲苯（加入金屬鈉回流6 h，干燥備用）、濃氨水、甲醇（分析純，天津市大茂化學試廠）； 復(fù)方蘆丁片（國藥準字：H31021092； 上海朝暉藥業(yè)有限公司）。

2.2 實驗方法

2.2.1 甲基丙烯酰氧乙基二甲基乙酸銨功能單體的制備 功能單體參照文獻[20]制備。將5.505 g氯乙酸鈉以適量的去離子水溶解，用NaOH調(diào)節(jié)至pH 7.0，置于恒壓滴液漏斗中。將7.704 g DMAEMA以少量去離子水溶解后置于250 mL三口圓底燒瓶中，全程通N2保護，50℃時開始滴加氯乙酸鈉溶液，約10 min滴完，升溫到60℃反應(yīng)3 h。反應(yīng)完畢，向圓底燒瓶加入乙醇，振搖后抽濾，將濾餅溶解在甲醇中，重結(jié)晶，得到甲基丙烯酰氧乙基二甲基乙酸銨（CBMA）功能單體，共計4.429 g，產(chǎn)率67.5%，見圖1。

2.2.2 用SIATRP技術(shù)制備SilicaCBMA固定相 稱取0.5 g CBMA功能單體溶于70 mL甲醇中，置于100 mL圓底燒瓶。將3.0 g溴代硅膠（參照文獻[21]制備）、 0.166 g CuBr、 0.362 g 2，2′聯(lián)吡啶置于200 mL圓底燒瓶中，將兩個燒瓶密封充氮氣30 min后，溶解CBMA的甲醇溶液轉(zhuǎn)移至含溴代硅膠圓底燒瓶中，在N2保護下， 60℃反應(yīng)24 h，反應(yīng)結(jié)束后抽濾，將濾餅依次用大量0.1 mol/L EDTA2Na溶液、甲醇、丙酮洗滌多次，60℃真空干燥過夜，即得SilicaCBMA固定相，反應(yīng)步驟見圖2。

2.2.3 色譜柱的填充 稱取2.0 g上述合成的固定相，以甲醇為勻漿液和頂替液，超聲分散均勻后，在40 MPa壓力下裝入不銹鋼柱管（150 mm × 4.6 mm I.D.）中。

2.2.4 液相色譜條件 流動相為乙腈甲酸銨溶液（9∶1， V/V），甲酸銨溶液濃度10 mmol/L，pH=4.0，流動相流速1.0 mL/min； 柱溫25℃； 進樣體積20 μL； 檢測波長為254 和355 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 單體的表征

3.1.1 功能單體的核磁表征 1HNMR（D2O， 400 MHz） δ： 6.00 （d， H， a）； 5.61 （d， H， b）； 1.78 （t， 3H， c）； 4.47 （t， 2H， d）； 3.95 （t， 2H， e）； 3.16 （s， 6H， f）。目標產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)式如下，其特征位移化學峰與文獻[20]相符。

3.1.2 功能單體的紅外表征 FTIR （KBr）如圖3所示， 338203 cm1處為OH 的伸縮振動吸收峰； 1713.79 cm1處為酯羰基的伸縮振動峰； 1134.50 cm1處為酯 COC的伸縮振動峰； 原料 ClCH2COONa 在 769.96 cm1處的CCl 伸縮振動峰消失； 915.34 cm1處的吸收峰是羧基甜菜堿中R3N+的吸收峰，證明ClCH2COONa 與 DMAEMA 進行了季銨化反應(yīng)。在1382.03和1610.07 cm1處出現(xiàn)了COO對稱伸縮振動峰和COO不對稱伸縮振動峰，與文獻[20]相符。

3.2 不同接枝量的SilicaCBMA固定相制備及表征

合成3種不同CBMA單體接枝量的SilicaCBMA固定相， 研究接枝聚合物接枝量對固定相性能的影響。在SIATRP反應(yīng)中，通過改變單體加入量、聚合時間、引發(fā)劑濃度等條件，可以控制聚合物鏈長。本實驗選擇保持引發(fā)劑濃度、聚合時間等其它條件不變，只改變單體的濃度，按照催化劑、配體與單體的物質(zhì)的量比分別為1∶2∶1、1∶2∶2、1∶2∶4制備得到了CBMA單體接枝量不同的固定相SilicaCBMA 1、SilicaCBMA 2和SilicaCBMA 3。

式（1）[22]中， Cp是接枝聚合后增加的碳百分含量； Cp（calcd.）是單體分子中碳的理論百分含量； Ci 是固定引發(fā)劑后增加的碳含量； Ci（calcd.）是引發(fā)劑單元分子中碳的理論百分含量； A 是硅膠的比表面積。

利用元素分析對制備的3種SilicaCBMA固定相進行表征，由式（1）計算CBMA功能單體接枝量，結(jié)果見表1，接枝CBMA單體后的SilicaCBMA固定相與溴代硅膠相比，C， H和N 3種元素的含量明顯增加，表明CBMA單體已經(jīng)成功接枝在硅膠表面，且接枝聚合物的鏈長隨初始單體濃度的增加而增長[23]。

3.3 SilicaCBMA固定相接枝量對柱效的影響

以有機酸類化合物為探針化合物，在流動相pH=6的條件下，研究CBMA功能單體接枝量對分離性能的影響。隨著CBMA單體的接枝量增大，溶質(zhì)的保留時間延長。這是因為在實驗條件下，SilicaCBMA固定相帶正電荷[12]，且表面正電荷密度隨兩性單體的接枝量增加而增大[24]，酸性溶質(zhì)電離帶負電荷，所以溶質(zhì)的保留時間隨單體的接枝量增加而延長。但接枝量過大時，溶質(zhì)與固定相作用力增加會導(dǎo)致峰形變差，結(jié)果見圖4。

3.4 pH值對溶質(zhì)保留的影響

在流動相pH值4.0～8.0的范圍內(nèi)考察有機酸類化合物的保留情況。由圖5可見，酸性溶質(zhì)保留時間都隨著甲酸銨溶液pH值增大而延長，且在3種SilicaCBMA固定相上保留規(guī)律相同。這是因為在甲酸銨溶液pH值從4.0增至8.0的過程中，SilicaCBMA固定相功能基電離程度變大[25]，酸性溶質(zhì)電離且極性也變大[26]，二者間的靜電作用增強使得溶質(zhì)保留增強。

3.5 鹽濃度對溶質(zhì)保留的影響

在甲酸銨溶液濃度10～250 mmol/L的范圍內(nèi)考察了有機酸類化合物的分離情況。由圖6可見，隨著甲酸銨溶液濃度的提高，5種溶質(zhì)保留時間都隨之降低，且在3種不同接枝量的SilicaCBMA固定相上保留規(guī)律相同。這是因為，固定相表面帶正電荷，酸性溶質(zhì)電離帶負電荷，兩者之間存在離子交換作用，溶質(zhì)保留隨流動相鹽濃度提高而減弱符合離子交換色譜的特征[27]。

3.6 水含量對溶質(zhì)保留的影響

在流動相pH=5.0條件下改變流動相水含量（5%～30%），同時保持流動相中甲酸銨總濃度為10 mmol/L不變，探測水含量對有機酸類化合物保留的影響。

由圖7可見，流動相中乙腈與甲酸銨溶液的體積比從95∶5到70∶30，隨著流動相強洗脫劑水含量的增加，酸性溶質(zhì)保留都減弱，這是典型的親水作用色譜特征，可見酸性溶質(zhì)在此SilicaCBMA柱子上的保留是離子交換作用與親水作用共同作用的混合模式[28]。

3.7 復(fù)方蘆丁片中維生素C、蘆丁含量的測定

復(fù)方蘆丁片主要含有蘆丁和維生素C兩種成分，用于高血壓腦病、腦出血、視網(wǎng)膜出血等癥狀的輔助治療[29]。本研究采用自合成的SilicaCBMA親水色譜固定相測定復(fù)方蘆丁片中維生素C、蘆丁的含量。

3.7.1 線性范圍的測定 稱取適量維生素C、蘆丁對照品，分別用50 %甲醇定容為10～250 mg/L的對照品系列溶液。取上述對照品系列溶液，分別按照2.2.4節(jié)進樣并平行測定3次，以質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，維生素C標準曲線方程y=4196.5x + 106，相關(guān)系數(shù)r=0.9991， 線性范圍為10～200 mg/L； 蘆丁標準曲線方程y=33096.0x-17120，相關(guān)系數(shù)r= 0.9994，線性范圍為20～120 mg/L。結(jié)果表明，維生素C、蘆丁對照品溶液的質(zhì)量濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

3.7.2 重復(fù)性實驗 維生素C、蘆丁供試品溶液的制備：取復(fù)方蘆丁片5片，研細，精密稱取相當于1片的質(zhì)量，置于100 mL容量瓶中，加適量50%甲醇超聲溶解后，再用50%甲醇定容，用45 μm微孔濾膜過濾。分別準確移取5 mL濾液于5個50 mL容量瓶中，用50%甲醇定容，作為供試品溶液。

測得5份供試品溶液中維生素C含量為55.5 mg，RSD為1.5%； 蘆丁的含量為40.3 mg，RSD為1.8%，表明本方法測定蘆丁片中維生素C、蘆丁含量的重復(fù)性良好。

3.7.3 加標回收實驗 取3.7.2節(jié)的2份供試品溶液，分別加入濃度不同的3組維生素C、蘆丁對照品溶液，每組平行測定3次，計算加標回收率，結(jié)果見表2。

4 結(jié) 論

本研究采用SIATRP技術(shù)， 將CBMA接枝到硅膠表面， 通過控制反應(yīng)條件，得到了CBMA不同接枝量的SilicaCBMA固定相，此固定相可有效分離有機酸類化合物。對酸性溶質(zhì)而言，溶質(zhì)在固定相上的保留隨鍵合量增大而增強。酸性溶質(zhì)在固定相上的保留是親水作用和離子交換作用共同起作用的混合模式。溶質(zhì)的保留隨流動相鹽濃度增大而減弱，隨流動相pH值增大而增強，符合離子交換色譜的特征； 溶質(zhì)的保留隨流動相中水含量提高而減弱，表現(xiàn)出親水作用色譜的保留特征。將所得固定相應(yīng)用于蘆丁藥品中維生素C、蘆丁含量的測定，操作方法簡單，線性關(guān)系、精密度良好，為強極性樣品的分離提供了新方法。

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