多肽在金納米粒子表面偶聯(lián)反應(yīng)效率研究

張強+李瑞雪+陳鑫+何興興+韓愛玲+方國臻+劉繼鋒+王碩

摘 要 以大豆磷脂為主要的表面活性劑，制備適合毛細管電動色譜使用的不同構(gòu)成比的微乳體系， 應(yīng)用溶劑化參數(shù)模型研究了中性溶質(zhì)在其中的定量結(jié)構(gòu)保留關(guān)系。使用動態(tài)涂層毛細管， 以二甲基亞砜和十二烷基苯分別作為電滲流和微乳液滴遷移的標記物， 測定了26個具有不同結(jié)構(gòu)小分子中性化合物在17種微乳電動色譜體系下的保留因子， 建立了線性溶劑化能量關(guān)系（LSER）方程。通過比較兩體系的LSER方程系數(shù)比較體系相似性。結(jié)果表明， 本研究建立的磷脂微乳電動色譜體系在線性溶劑化特征上和其它構(gòu)成的微乳電動色譜體系相似。對溶質(zhì)保留貢獻較大的是溶質(zhì)體積和有效氫鍵堿度， 油相種類及濃度對溶質(zhì)的保留選擇性無明顯影響。

關(guān)鍵詞 微乳電動色譜； 大豆磷脂； 保留因子； 線性溶劑化能量關(guān)系

1 引 言

微乳電動色譜（Microemulsion electrokinetic chromatography， MEEKC）是使用微乳作為分離介質(zhì)的電泳技術(shù)， 具有分離效率高、適用范圍廣和樣品消耗少等優(yōu)勢， 已廣泛應(yīng)用于分離科學(xué)領(lǐng)域[1，2]。中性物質(zhì)在MEEKC系統(tǒng)中依據(jù)其在水相和假固定相（微乳液滴）的分配系數(shù)不同而實現(xiàn)分離， 而帶電物質(zhì)除了在兩相間的分配系數(shù)不同外， 還有物質(zhì)間的靜電作用。MEEKC的選擇性通過假固定相的改變實現(xiàn)， 不同的表面活性劑、油相、助表面活性劑和有機改性劑的加入都會改變微乳對分離物的選擇性。盡管MEEKC的應(yīng)用已有20余年， 已有許多關(guān)于微乳體系構(gòu)成的報道[3]， 但最常用的仍是以十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate， SDS）作為表面活性劑制備的微乳。Lucangioli等[4，5] 最初將磷脂類生物表面活性劑引入MEEKC體系中， 并將其應(yīng)用于免疫抑制劑倍他米松及其衍生物的正辛醇/水分配系數(shù)（nOctanol/water partition coefficient， lgP）測定， 發(fā)現(xiàn)用磷脂類生物表面活性劑制備的微乳體系預(yù)測以上藥物的lgP值更準確。但是該研究僅檢測了4種藥物， 且未見應(yīng)用該系統(tǒng)進行其它藥物集合lgP值測定的報道， 因此磷脂類微乳電動色譜體系提高藥物lgP值預(yù)測準確性的結(jié)論尚不十分肯定。磷脂類微乳與其它構(gòu)成的微乳體系是否存在保留機制的差別也未見報道。

線性溶劑化能量關(guān)系（Linear solvation energy relationship， LSER）模型廣泛用于各種色譜體系的溶質(zhì)保留機制研究[6～8]以及正辛醇水分配系數(shù)[7]和藥物體內(nèi)透膜過程的預(yù)測[9，10]。通過方程系數(shù)間的比較， 可以發(fā)現(xiàn)不同分配體系的相似性， 選擇合適的色譜體系用于藥物膜通透性的篩選[7，11]。本研究采用LSER模型， 對應(yīng)用大豆磷脂制備的微乳體系進行MEEKC分離時的溶質(zhì)保留機制進行研究， 比較了不同磷脂構(gòu)成比、不同油相及油相含量對LSER方程系數(shù)的影響， 同時將磷脂微乳體系與其它表面活性劑構(gòu)成的微乳或膠束體系進行了比較， 擬闡明磷脂類成分和油相組分在微乳分離體系中的作用， 為進一步應(yīng)用磷脂類微乳電動色譜體系進行藥物膜通透性的預(yù)測提供理論依據(jù)。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Beckman P/ACE MDQ毛細管電泳儀、DAD檢測器（美國Beckman公司）；彈性石英毛細管柱（河北永年光導(dǎo)纖維廠， 60 cm×50 μm， （id）， 有效長度50 cm）；Malvern Zetasizer Nano ZS90型激光粒度散射儀（英國Malvern公司）；KQ3200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；BP211D電子分析天平（德國賽多利斯公司）； pH3C型pH計（上海雷磁儀器廠）

十二烷基硫酸鈉（石家莊市拜昂生物技術(shù)有限公司）；聚凝胺（PB， 美國Sigma公司）；葡聚糖硫酸鹽（DS， 美國Sigma公司）；大豆磷脂（注射級， 上海太偉藥業(yè)股份有限公司）；膽酸鈉（美國Sigma公司， BioXtra ≥ 99%）；脫氧膽酸鈉（SigmaAldrich 公司）；十七氟辛烷磺酸四乙基銨鹽（Aldrich 公司）；十六烷三甲基溴化銨、十二烷基苯（Sigma公司）；肉豆蔻酸異丙酯（上海源葉生物科技有限公司）；正丁醇、正辛醇、正庚烷（分析純， 天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；全氟辛基磺酸鉀（Aldrich 公司）；二甲基亞砜（DMSO， 分析純， 天津市標準科技有限公司）；甲醇（色譜純， 天津市康科德科技有限公司）；實驗用水為某品牌純凈水。

待測化合物見表1， 其中間二甲苯、對二甲苯由河北科技大學(xué)提供， 其余均由河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供。

2.2 微乳和化合物儲備液的制備

優(yōu)化的微乳處方構(gòu)成見表2。稱取適量的表面活性劑于密封性容器內(nèi)， 用水相（20 mmol/L NaH2PO4）溶解， 依次加入助表面活性劑、油相， 混勻、超聲30 min， 室溫靜置（12 h 以上）至微乳溶液搖晃后仍澄清， 表明形成穩(wěn)定微乳， 最后用飽和NaOH調(diào)至所需pH值， 備用， 使用前用0.45 μm濾膜過濾。

根據(jù)Vitha等[12]對建立溶劑化方程的溶質(zhì)集合篩選提出的指導(dǎo)原則， 共收集了26個具有不同結(jié)構(gòu)特征的小分子中性化合物及其Abraham分子描述符（見表1）， 分別用甲醇溶解， 配制成3～100 mg/mL儲備液， 進樣前用微乳液稀釋至0.1～3 mg/mL。

1 mL微乳液中加入6 μL苯甲酰胺甲醇溶液（30 mg/mL）、6 μL鄰甲苯胺甲醇溶液（100 mg/mL）、4 μL 2萘酚甲醇溶液（100 mg/mL）和6 μL 電滲流標記物DMSO、4 μL 微乳標記物十二烷基苯， 作為標準混合液。

2.3 保留因子的測定

2.3.1 毛細管預(yù)處理 （1）毛細管活化 用甲醇沖洗新管3 min， 再依次用水沖洗0.5min、 0.1 mol/L HCl 沖洗15 min、水沖洗0.5 min、1 mol/L NaOH 沖洗15 min。（2）毛細管涂層 毛細管活化后靜置30 min， 先用5% PB溶液沖洗20 min， 靜置20 min后， 再用3%DS溶液沖洗20 min， 靜置30 min， 使用前用水沖洗5 min即可。

2.3.2 測定條件 毛細管柱總長度60 cm（有效長度50 cm， 內(nèi)徑50 μm）， ±20 kV恒壓分離， 檢測波長208 nm， 壓力進樣（0.8 psi， 8 s）， 柱溫25℃。

2.3.3 不同MEEKC體系下保留因子的測定與計算 陰離子型微乳（表2中ME1ME16）采用+20 kV電壓， 陽離子型微乳（表2中ME17）采用20 kV電壓分離， 柱溫25℃。保留因子k按下式計算 [13]：

2.3.4 保留因子與Abraham描述符間LSER的建立 LSER理論是基于腔穴模型， 解釋溶質(zhì)在兩相間轉(zhuǎn)移[14]， LSER方程一般描述如下：

SP作為給定系統(tǒng)的一種溶劑化性能， 例如溶劑的保留行為的對數(shù)（lgk）、正辛醇/水分配系數(shù)（lgP）、穩(wěn)態(tài)血腦藥物濃度比（lgB）等；方程中的大寫字母是Abraham溶質(zhì)描述符， E表示摩爾折射率， S表示溶質(zhì)偶極/極化率， B和A分別表示有效氫鍵堿度和酸度， V代表特征體積；小寫字母 e， s， a， b和v是通過多元線性回歸得到的各個變量的系數(shù)， 反映了給定系統(tǒng)的性質(zhì)即溶劑化參數(shù)對系統(tǒng)的貢獻大小， 其中e代表分配系統(tǒng)中的溶質(zhì)分子與溶劑的π或n電子的作用；s反映系統(tǒng)兩相間的偶極/極化率；b和a分別代表系統(tǒng)的有效氫鍵堿度和酸度；v代表系統(tǒng)的空穴的形成能力或內(nèi)聚能；常數(shù)c是方程的截距， 由溶質(zhì)和系統(tǒng)間恒定的相互作用產(chǎn)生， 如相體積比。

本研究將不同微乳體系下測得的26個化合物的保留因子（lgk）與Abraham描述符間建立了LSER方程。

3 結(jié)果與討論

3.1 微乳體系構(gòu)成

通過改變表面活性劑及油相的種類和濃度制備的穩(wěn)定微乳處方組成見表 2。

文獻[15]報道， 制備微乳時各組分的加入順序會影響微乳的形成， 但是本實驗發(fā)現(xiàn)， 超聲和靜置有助于微乳的形成， 即使改變組分的加入順序， 仍能夠形成穩(wěn)定的微乳體系。微乳制備和保存都應(yīng)在密封的容器內(nèi)進行， 以防止油相和丁醇等成分的揮發(fā)影響微乳的構(gòu)成。運行MEEKC時， 洗脫時間窗口的大小與微乳中助表面活性劑及表面活性劑的濃度相關(guān)， 本研究控制時間窗都在20 min以上， 以保證洗脫窗內(nèi)能夠容納較多的溶質(zhì)。

3.2 微乳穩(wěn)定性

通過外觀、粒徑和電位變化考察了微乳的穩(wěn)定性， 部分檢測結(jié)果見表3。從表中粒徑和Zeta電位值可知， 微乳室溫存放30天， 粒徑和表面電位無明顯變化。

3.3 溶質(zhì)保留時間和保留因子重現(xiàn)性

以ME5為電動色譜流動相， 用標準混合液進樣， 考察動態(tài)涂層條件下溶質(zhì)保留時間的重復(fù)性， 圖1是典型的色譜圖。結(jié)果表明， 應(yīng)用文獻[16]報道的涂層方法（見2.3.1節(jié)毛細管涂層）， 使用同批次微乳液， 連續(xù)測定3天， 總進樣60針（每針運行時間在20 min以上）， 化合物的遷移時間RSD<2.5%。隨著進樣針數(shù)的增加和進樣時間的延長， 遷移時間RSD變大， 原因可能是樣品在毛細管內(nèi)壁的吸附或涂層有損壞。因此測定樣品過程中， 需要用標準混合溶液進行重復(fù)性檢測， 如標準樣品的遷移時間出現(xiàn)較大偏差， 則需對毛細管進行沖洗；沖洗后無改善則需重新涂層處理， 以確保溶質(zhì)遷移時間的重復(fù)性。從表4可見， 各被測物保留時間與保留因子測定的重復(fù)性均良好。但為了保證保留因子測定的準確性， 每個樣品溶液中都加入DMSO和十二烷基苯， 以盡量減少遷移時間變化帶來的保留因子測定誤差。

3.4 不同微乳體系下的LSER方程

收集26個不同結(jié)構(gòu)的小分子中性化合物， 以表2中的微乳體系作為分離介質(zhì)， 測定溶質(zhì)的保留因子， 用SPSS 19.0進行保留因子與溶質(zhì)描述符間的多元線性回歸， 建立LSER方程， 結(jié)果見表5。

總體上看， 實驗中得出的各個微乳電動色譜體系的LSER方程系數(shù)都比較接近， 其中v和b的系數(shù)絕對值較大， 表明溶質(zhì)的體積和氫鍵堿性對溶質(zhì)保留貢獻較大。 v絕對值較大表明體系中油滴形成腔穴對溶質(zhì)保留所需能量低于水相； b值為負值表明微乳氫鍵堿性小于緩沖液， 隨著溶質(zhì)氫鍵堿性的增加將不利于溶質(zhì)進入假固定相中。 a值在各體系LSER方程中大部分為負值且接近于0， 表明溶劑氫鍵受體能力在油水兩相間的性能相似； s和 e的絕對值較小， 表明在溶質(zhì)保留機制中偶極/極化率和溶質(zhì)分子與溶劑的π或n電子的作用較弱[7，17]。

微乳相對于膠束溶液來說， 主要不同在于加入了助表面活性劑和油相[18]， 本研究系統(tǒng)比較了不同油相種類和含量對體系特征的影響。從表5中ME1～ME3， ME4～ME6體系的LSER方程可見， 在其它組成不變的情況下， 庚烷從0到1.0%， 辛醇從0到1.5%， LSER系數(shù)沒有明顯變化。 從ME2， ME5， ME7的方程系數(shù)可見， 不同油相種類（庚烷、辛醇、IPM）對體系特征也無影響。這些結(jié)果表明油相對MEEKC測定中性化合物的分離選擇性沒有明顯影響。若待測化合物有一定的解離性， 則其分離選擇性可能與油相有關(guān)[2]。助表面活性劑一般為短鏈醇， 它的加入可以改變微乳液滴的表面電荷密度和微乳結(jié)構(gòu)的剛性， 有利于溶質(zhì)的溶解和洗脫[10]。

表面活性劑的種類直接影響微乳的表面特性。SDS是MEEKC系統(tǒng)常用的表面活性劑， 本實驗對以大豆磷脂和碳氟表面活性劑作為表面活性劑的新型微乳體系的溶劑化特征進行了研究（ME1， ME4， ME8， ME17）。結(jié)果表明， 大豆磷脂的加入， 沒有改變微乳體系的基本特征。而據(jù)文獻[19，20]報道， 在碳氟表面活性劑構(gòu)成的膠束溶液中， 因碳原子上的所有氫原子被氟原子取代， 在溶質(zhì)分配行為中氫鍵酸度作用貢獻增加， 甚至強于氫鍵堿度， 與SDS膠束體系中氫鍵酸度貢獻很小的結(jié)果顯著不同。但本研究未得到一致結(jié)果， 在PFOSK或PFOSNH4形成的微乳體系中， 依然是氫鍵堿度的作用突出。這可能是因為本研究PFOSK或PFOSNH4體系中加入了SDS、SDC和丁醇等， 而SDS和SDC的氫鍵堿度作用貢獻較大。

此外， 本實驗還發(fā)現(xiàn)， 陽離子型表面活性劑CTAB建立的MEEKC體系的LSER方程系數(shù)與陰離子型表面活性劑構(gòu)成MEEKC體系（ME1ME9）相比也無較大差異， 表明微乳液滴只是作為一個相對于水相極性較弱的假固定相， 其表面電荷性質(zhì)不影響中性化合物的分離選擇性。

3.5 與文獻報道的其它色譜系統(tǒng)的比較

其它應(yīng)用LSER模型研究溶質(zhì)保留機制的色譜系統(tǒng)有磷脂膜色譜、膠束、微乳電動色譜系統(tǒng)等[21～27]， 本研究應(yīng)用Lázaro 等提出的矢量距離法[28]比較了所建新型MEEKC系統(tǒng)與其它色譜系統(tǒng)間的接近程度。距離參數(shù)d的計算方法如下方程：

其中， p代表v， s， e， b， a中的任一系數(shù)， u代表標準化， i和j指待比較的兩系統(tǒng)。本研究建立的體系與文獻[13～19]報道的常見系統(tǒng)的比較見表6。

根據(jù)文獻[6，29]報道， 系統(tǒng)間的距離d<0.25， 表明兩系統(tǒng)特征較相似。從表6可見， 所建立的各種微乳體系彼此間距離d<0.1， 說明彼此間特征相近。所建微乳體系與正辛醇/水分配系數(shù)（lgP）、MEEKCSDS和磷脂膜色譜（pH 7.4）系統(tǒng)間的d值均約為0.25， 表明MEEKC、磷脂膜色譜與正辛醇水系統(tǒng)所測得的親脂性參數(shù)一致， 表明MEEKC是預(yù)測lgP值的實用工具[7]。本研究中所用的磷脂微乳體系與其它MEEKC體系相比， 基線穩(wěn)定性更好， 分離能力更強。

4 結(jié) 論

對于本研究測定的中性化合物， 無論是在大豆磷脂、SDS、CTAB， 還是碳氟類表面活性劑制備的微乳電動色譜中， 所得保留因子的LSER方程的基本特征相似， 都是v和b較大， 即溶質(zhì)的體積和氫鍵堿度對其在微乳中的保留影響較大， 前者利于保留， 后者減弱保留。各體系之間距離也非常接近， 說明表面活性劑類型和油相組成對中性溶質(zhì)在微乳體系中的保留選擇性均無明顯影響。若不考慮油相對微乳液滴剛性結(jié)構(gòu)的影響， 微乳體系或許可以稱為助表面活性劑修飾的膠束體系。

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