丙磺舒在阿維菌素作用棉鈴蟲細(xì)胞中的增效機(jī)制研究

王贊永，周 勇，馬海昊，劉 佳，朱 航，鄧希樂，譚輝華，周小毛

（1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410125）

丙磺舒在阿維菌素作用棉鈴蟲細(xì)胞中的增效機(jī)制研究

王贊永1，周 勇2，馬海昊2，劉 佳2，朱 航2，鄧希樂2，譚輝華1，周小毛2

（1.廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.湖南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410125）

丙磺舒是ABCC轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑，用系列濃度阿維菌素和200 μmol/L丙磺舒的食物飼喂棉鈴蟲，檢測中腸組織中阿維菌素的含量。結(jié)果表明：與單獨使用阿維菌素相比，混合使用丙磺舒后阿維菌素在中腸中的平均駐留時間（MRT）增加了13%，消除半衰期（t1/2z）增加了27%，藥物峰值提高了2.8倍。細(xì)胞活力測定發(fā)現(xiàn)，亞致死劑量阿維菌素與400 μmol/L丙磺舒混用后，棉鈴蟲細(xì)胞的活力降低了67.1%。表明抑制ABCC轉(zhuǎn)運蛋白可以提高阿維菌素在棉鈴蟲中腸的駐留能力，提高藥物對棉鈴蟲細(xì)胞的毒力。

液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS）；棉鈴蟲；ABC轉(zhuǎn)運蛋白；阿維菌素；丙磺舒

ABC轉(zhuǎn)運蛋白（ATP—binding cassette transporters）是一個包括A-H 8個亞家族的轉(zhuǎn)運蛋白超家族，可以利用水解ATP的能量將藥物泵出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，其功能和表達(dá)的改變參與細(xì)胞多藥耐藥的形成[1-2]。醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，ABC轉(zhuǎn)運蛋白對化療藥物的排出作用是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的重要原因[3]，在病原微生物耐藥機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)，微生物可以通過激活細(xì)胞內(nèi)ABC轉(zhuǎn)運蛋白，將藥物運出細(xì)胞，降低菌體內(nèi)抗生素濃度[4-5]。近年的研究表明，ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因表達(dá)量的提高也和害蟲對殺蟲劑抗藥性增強(qiáng)相關(guān)[6]。有報道表明，昆蟲對來自9種不同化學(xué)類別的27種殺蟲劑抗性與ABC轉(zhuǎn)運蛋白的運輸作用有關(guān)[7]，其中涉及到的ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族集中在包括ABCC、ABCB和ABCG等亞家族[9-10]。

ABC轉(zhuǎn)運蛋白C家族也被稱為多藥耐藥相關(guān)蛋白（Multidrug resistance-associated protein，MRP），在細(xì)胞排出胞內(nèi)有毒物質(zhì)過程中發(fā)揮重要功能。丙磺舒（probenecid）學(xué)名對-[（二丙氨基）磺?；鵠苯甲酸，是一種MRP的競爭性抑制劑，對MPR1-5的藥物外排作用均有不同程度的抑制作用[11]。與抗腫瘤藥物聯(lián)用時，能通過抑制腫瘤細(xì)胞的外排作用而提高藥效[12]，臨床上將丙磺舒和抗生素聯(lián)合使用可以延長抗生素的作用時間[13-14]。

棉鈴蟲是一種世界范圍內(nèi)的主要害蟲，長期以來化學(xué)農(nóng)藥的廣泛使用使棉鈴蟲的抗藥性增強(qiáng)?，F(xiàn)有研究認(rèn)為，昆蟲體內(nèi)存在多種解毒代謝酶系，如酯酶，多功能氧化酶和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶等，能夠有效的降解進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物分子；另外昆蟲體內(nèi)靶標(biāo)蛋白的突變和表皮穿透能力的改變也是害蟲產(chǎn)生抗藥性的主要機(jī)制[1,15]。最近的研究表明棉鈴蟲抗藥性的增強(qiáng)與體內(nèi)ABC轉(zhuǎn)運蛋白C家族的表達(dá)量上調(diào)有關(guān)[16]，推測ABCC轉(zhuǎn)運蛋白通過加速排出體內(nèi)有毒物質(zhì)增強(qiáng)蟲體對農(nóng)藥的耐受性，但目前還缺少直接證據(jù)證明ABCC轉(zhuǎn)運蛋白參與該過程。筆者擬通過混合使用ABCC轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑丙磺舒和阿維菌素，質(zhì)譜檢測抑制ABCC轉(zhuǎn)運蛋白功能后，研究阿維菌素在中腸組織的滯留情況及對棉鈴蟲細(xì)胞的毒力變化，明確ABCC轉(zhuǎn)運蛋白參與昆蟲抗藥性的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

TSQ Endura高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國賽默飛世爾），JY96-MIN超聲細(xì)胞破碎儀（寧波新芝），Pico17冷凍高速離心機(jī)（美國賽默飛世爾），PQX-350H人工氣候箱（中儀國科）Labonova Ultra超純水系統(tǒng)（美國Think-lab）。BHC-1300生物安全柜（蘇州博萊爾），HPS160生化培養(yǎng)箱（北京東聯(lián)哈爾），DSY-L140倒置顯微鏡（北京長恒榮創(chuàng)）。

阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品（100 mg/L，北京壇墨質(zhì)檢）阿維菌素原藥（96.2%，輝豐農(nóng)化），丙磺舒原藥（99.0%，濟(jì)南凱恩醫(yī)藥）丙酮、乙腈（色譜純天津大茂），氯化鈉，氯化鉀磷酸二氫鉀磷酸氫二鈉，二甲基亞砜（分析純，國藥集團(tuán)），甲醇，甲酸（色譜純德國默克Merck），MTT（Solarbio）。

1.2 供試?yán)ハx及細(xì)胞

供試棉鈴蟲Helicoverpa armigera（Hübner）由中國科學(xué)院動物研究所提供，一直使用人工飼料培養(yǎng)，對各種農(nóng)藥敏感。飼養(yǎng)條件：光周期為14 h∶10 h（光照∶黑暗），溫度（25±2）℃，相對濕度70%。室內(nèi)人工飼養(yǎng)采用梁革梅[17]所述方法。

棉鈴蟲胚胎細(xì)胞系QB-Ha-E5[18]由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)李國勛教授惠贈，該細(xì)胞在27℃、含5% FBS的Gibco SF-900II SFM培養(yǎng)基（美國賽默飛世爾）中培養(yǎng)和傳代。

1.3 給藥及取樣方法

按照農(nóng)藥室內(nèi)生測標(biāo)準(zhǔn)——人工飼料混藥法進(jìn)行[19]，首先將阿維菌素和丙磺舒原藥用丙酮溶解，分別配制成1 g/L和10 mmol/L的母液，使用時按比例均勻混入制作好的人工飼料中，終濃度為阿維菌素30 mg/L，丙磺舒200 μmol/L，丙酮1%。對照組食物只加入阿維菌素。

混藥飼料切成合適大小放入24孔養(yǎng)蟲盒中，放入經(jīng)過饑餓處理8 h的5齡1 d棉鈴蟲幼蟲。自由取食1 h后更換至潔凈養(yǎng)蟲盒，用正常人工飼料繼續(xù)飼喂。每組80頭蟲，正常進(jìn)食1 h后開始取樣，每間隔1 h取樣一次，共設(shè)10個取樣時間點每次取6頭棉鈴蟲，解剖取出中腸，去除腸道食物殘留后，稱重，-20℃保存，實驗重復(fù)3次。

1.4 樣品前處理

中腸組織解凍后加入1 mLPBS緩沖液（pH值7.4），于冰水浴中超聲破碎；之后取600 μL裂解液，加入1 mL乙腈，0.2 g氯化鈉，漩渦震蕩1 min，12 000 r/min離心10 min，上清液過0.22 μm微孔濾膜用于HPLC-MS檢測。

1.5 色譜條件

色譜柱：Hypersil GOLD C18 （2.1×100 mm 1.9Micron）；柱溫：35℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；流動相：甲醇-水（含0.1%甲酸）。梯度洗脫程序：0～0.78 min，20%～95%甲醇；0.78～3.1 min，95%甲醇；3.1～4.0 min，95%～20%甲醇。

1.6 質(zhì)譜條件

ESI離子源，正離子掃描模式，掃描范圍m/z500～1 000；離子噴霧電壓3 500 V；霧化氣為N2，壓力40 psi；離子傳輸管溫度300℃，噴針溫度300℃；檢測方式為MRM模式，定性檢測離子m/z 896.4/608.1（碰撞電壓為46 V，保留時間為3.72 s），定量檢測離子m/z 896.4/752.1（碰撞電壓為41 V，保留時間為3.72 s）；射頻透鏡電壓為298 V。

質(zhì)譜數(shù)據(jù)由TSQ Endura工作站收集并計算出峰面積，計算出樣品濃度。按下面公式換算成中腸中阿維菌素含量Cn（μg/g）。

其中C為質(zhì)譜樣品測量濃度，v為萃取液體積，M為中腸樣品質(zhì)量。繪制中腸中阿維菌素含量的濃度-時間曲線，通過DAS 2.0軟件對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析，以統(tǒng)計矩法計算藥物動力學(xué)參數(shù)。

1.7 細(xì)胞活力檢測

采用MTT細(xì)胞染色法，測定阿維菌素對棉鈴蟲細(xì)胞的毒力。分別配制含1、5、10、20、40和60 mg/L阿維菌素的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基。處理組均加入終濃度400 μmol/L的丙磺舒，對照組加入等體積溶劑。將對數(shù)期棉鈴蟲細(xì)胞以1×104個/孔的密度鋪96孔板，27℃培養(yǎng)24 h之后將原培養(yǎng)基吸出替換為不同濃度含藥物培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)6個重復(fù)。繼續(xù)培養(yǎng)48 h進(jìn)行細(xì)胞活力測定，測定方法和數(shù)據(jù)處理參考周青春[20]研究進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

參考侯志廣[21]的阿維菌素檢測方法，在流動相中加入甲酸，通過ESI離子源、正離子模式在m/z 500～1 000范圍內(nèi)掃描，得到[M+Na]+準(zhǔn)分子離子峰m/z=896.4（阿維菌素分子量為887.11），以此作為母離子，進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，得到子離子m/z 752.3和m/z 608.1（圖2b），選擇m/z 752.3作為定量檢測離子，對射頻透鏡電壓和碰撞電壓進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)射頻透鏡電壓為298 V，最適碰撞電壓為41 V。

2.2 色譜條件優(yōu)化

選擇甲醇-水（0.1%甲酸）作為流動相，阿維菌素的準(zhǔn)分子離子峰的離子化效果和穩(wěn)定性均比較好。在流動相中加入體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸，能有效消除峰形拖尾現(xiàn)象，并且響應(yīng)值也大幅提高，穩(wěn)定出峰時間為3.72 s（圖2a）。

圖2 阿維菌素質(zhì)譜圖(1 000 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品)

2.3 分析方法的評價

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢測限 準(zhǔn)確配制1 000、500、100、10和1 μg/L系列的阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述樣品檢測條件測定，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，定量離子的色譜峰平均峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖3），回歸方程為Y=1 809.81+874.513X，R2=0.999 4。在該檢測條件下，阿維菌素的檢出限為0.1 μg/L（S/N=3）定量限為0.3 μg/L（S/N=10），靈敏度較高，適用于中腸組織中低濃度藥物的檢測。

2.3.2 添加回收率及方法精密度 用正常棉鈴蟲中腸制取空白樣品，按1 000、100和10 mg/L 3個濃度添加阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品，每個濃度5個重復(fù)，并經(jīng)前處理后連續(xù)進(jìn)樣。添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）分別為93.6%（RSD為3.0%）、86.1%（RSD為6.7%）、77.0%（RSD為5.2%）。

圖3 阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 棉鈴蟲中腸中阿維菌素的藥物代謝動力學(xué)

棉鈴蟲飼喂藥物后，以正常進(jìn)食的時間為橫坐標(biāo)，以每克中腸組織中阿維菌素含量為縱坐標(biāo)，繪制阿維菌素在棉鈴蟲中腸組織中的代謝曲線（圖4），比較不同時間棉鈴蟲中腸阿維菌素含量差異，發(fā)現(xiàn)在棉鈴蟲中腸組織中1～2 h藥物濃度快速升高，2 h時達(dá)到峰值（腸組織阿維菌素含量為2.4 μg/g），之后藥物濃度快速下降，4 h后下降趨于平緩，6 h后阿維菌素基本完成代謝?；旌鲜褂帽鞘婧螅掴徬x中腸對藥物總體代謝趨勢沒有顯著變化，但藥物峰值提高了2.8倍。根據(jù)圖2，基于藥物代謝動力學(xué)研究方法[22]，使用DAS 2.0軟件計算動力學(xué)參數(shù)（表2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)混用丙磺舒之后，藥物分子在組織中停留時間（MRT）和消除半衰期（t1/2z）各增加了13%和27%。表明使用ABCC轉(zhuǎn)運蛋白抑制劑后，阿維菌素在棉鈴蟲中腸內(nèi)的藥物峰值和駐留時間均顯著提高，推測其對棉鈴蟲的毒力增強(qiáng)。

圖4 人工飼料混藥法給藥后棉鈴蟲中腸中阿維菌素藥物濃度-時間曲線

表2 阿維菌素的主要藥物代謝動力學(xué)參數(shù)（統(tǒng)計矩法）

2.5 阿維菌素對棉鈴蟲的細(xì)胞毒力測定

利用不同濃度的阿維菌素處理棉鈴蟲細(xì)胞24 h，MTT法檢測細(xì)胞活性發(fā)現(xiàn)，阿維菌素對棉鈴蟲胚胎細(xì)胞的毒力存在閾劑量效應(yīng)，當(dāng)培養(yǎng)基中阿維菌素濃度不超過15 mg/L時細(xì)胞活力不受影響，之后隨著培養(yǎng)基中阿維菌素藥物濃度提高，細(xì)胞活力迅速下降。培養(yǎng)基中阿維菌素濃度達(dá)到20 mg/L時，細(xì)胞活力為23.3%。當(dāng)培養(yǎng)基中同時添加丙磺舒后，阿維菌素對棉鈴蟲細(xì)胞的毒力存在劑量累積效應(yīng)，培養(yǎng)基中阿維菌素為1 mg/L時，對細(xì)胞沒有顯著毒力，之后隨著藥物濃度提高，細(xì)胞毒力逐漸增強(qiáng)。EC50為11.971（5.862～18.353）mg/L，毒力方程為y=1.767-1.639lgx (x2=0.156，Sig=0.997)。此時以亞致死劑量阿維菌素處理棉鈴蟲細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)混合使用丙磺舒后細(xì)胞的活力降低了67.1%。表明混用丙磺舒后阿維菌素對棉鈴蟲細(xì)胞的毒力有顯著提高。

圖5 阿維菌素對棉鈴蟲細(xì)胞毒性MTT染色結(jié)果

3 結(jié)論與討論

害蟲的抗藥性是威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全的重要因素，研究昆蟲抗藥性作用機(jī)制有重要的現(xiàn)實意義。隨著研究的深入，昆蟲ABC轉(zhuǎn)運蛋白在害蟲產(chǎn)生抗藥性方面的作用逐漸得到重視，XiaoY等[23]通過RNA干擾抑制ABCC2基因的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲幼蟲對阿維菌素的敏感性增加。KM Seong研究發(fā)現(xiàn)ABCB49、ABCB50和ABCB65這3個ABC轉(zhuǎn)運蛋白功能異?？梢蕴岣吖墝TT的抗性[24]，禾谷縊管蚜抗藥機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)吡蟲啉抗性品系中ABCG20和ABCG23的表達(dá)顯著高于敏感品系[25]。研究通過混合使用ABCC抑制劑丙磺舒，檢測棉鈴蟲中腸組織對阿維菌素的代謝情況，表明ABCC轉(zhuǎn)運蛋白抑制后，棉鈴蟲中腸內(nèi)阿維菌素的藥物峰值增加，另外藥物在細(xì)胞內(nèi)的駐留時間延長。這和醫(yī)學(xué)研究中通過聯(lián)用抑制劑能提高血藥峰濃度和作用時間的結(jié)果是一致的[14,26]，充分說明ABCC轉(zhuǎn)運蛋白參與了棉鈴蟲中腸細(xì)胞對阿維菌素的外排作用。

丙磺舒作為ABCC轉(zhuǎn)運蛋白的抑制劑在臨床上得到大量應(yīng)用，與化療藥物聯(lián)用在人類肺癌，前列腺癌癥和乳腺癌治療中與能極大的提高療效[12]，De Bony報道丙磺舒通過影響肝腎轉(zhuǎn)運，使新一代抗病毒藥擷昔洛韋及其代謝物阿昔洛韋的血藥峰濃度增加[26]。Leader J P等[27]在研究丙磺舒對昆蟲ABC轉(zhuǎn)運蛋白作用機(jī)制時采用200 μmol/L，因此筆者也采用200 μmol/L作為棉鈴蟲中腸的處理濃度，但對昆蟲細(xì)胞的使用濃度還未有報道。丙磺舒干擾ABCC蛋白的功能，本身對細(xì)胞具有一定毒性。Bhaskaracharya A研究發(fā)現(xiàn)，丙磺舒對HEK293細(xì)胞IC50為203 μmol/L[28]，多篇文獻(xiàn)基于此濃度對丙磺舒的作用機(jī)制進(jìn)行研究[29-31]。筆者研究比較了丙磺舒對HEK293和棉鈴蟲細(xì)胞毒性的差異，發(fā)現(xiàn)2種細(xì)胞對丙磺舒耐受能力無顯著差異，且基于這一結(jié)果，筆者對丙磺舒抑制HEK293和棉鈴蟲細(xì)胞活力進(jìn)行了檢測，結(jié)果沒有明顯差異且200～600 μmol/L的丙磺舒對棉鈴蟲細(xì)胞的毒力無顯著差異，因此研究中取400 μmol/L來處理棉鈴蟲細(xì)胞。設(shè)置只加入400 μmol/L丙磺舒的孔作為100%活力空白對照，以排除丙磺舒本身毒性的干擾。實驗結(jié)果表明丙磺舒可以提高藥物分子在棉鈴蟲細(xì)胞內(nèi)的駐留能力，提高藥物毒力，有顯著的增效作用。丙磺舒或可作為一種增效劑與殺蟲劑混合使用以提高藥效，降低農(nóng)藥使用量，但其在昆蟲上使用的效果，以及環(huán)境安全性，還有待進(jìn)一步研究。

總之，研究通過抑制劑阻斷研究，表明ABCC轉(zhuǎn)運蛋白家族參與昆蟲細(xì)胞對有毒物質(zhì)的排出作用，同時證明了丙磺舒在和阿維菌素混用時的增效作用，并闡明了增效機(jī)制，為基于該作用機(jī)制開發(fā)新型增效劑提供了條件。

[1] Linda J G，Yannick P，Heiko V，et al. An ABC transporter mutation is correlated with insect resistance to Bacillus thuringiensis Cry1Ac toxin [J]. Plos Genetics，2010，6（12）：1-11.

[2] Labbé R，Caveney S，Donly C. Genetic analysis of the xenobiotic resistance-associated ABC gene subfamilies of the Lepidoptera [J]. Insect Molecular Biology，2011，20（2）：243.

[3] Ikeda K，Oka M，Yamada Y，et al. Adult T-cell leukemia cells overexpress the multidrug-resistance-protein (MRP) and lung-resistanceprotein (LRP) genes [J]. International Journal of Cancer，1999，82（4）：599.

[4] 張 嬋，莊肅軍，楊麗紅，等. 氟康唑體外誘導(dǎo)白假絲酵母菌耐藥基因表達(dá)的研究[J]. 中國微生態(tài)學(xué)雜志，2013，25（8）：911-913.

[5] Reyes C L，Ward A，Yu J，et al. The structures of MsbA: Insight into ABC transporter-mediated multidrug efflux [J]. FEBS Lett，2006，（580）：1042-1048.

[6] Qi W，Ma X，He W，et al. Characterization and expression profiling of ATP-binding cassette transporter genes in the diamondback moth, Plutella xylostella (L.) [J]. Bmc Genomics，2016，17（1）：760.

[7] 朱 航，王雅菲，周小毛. 小菜蛾ABCG2mRNA表達(dá)特征及茚蟲威對其表達(dá)量的影響[J]. 植物保護(hù)，2015，（6）：117-121.

[8] Dermauw W，Van L T. The ABC gene family in arthropods comparative genomics and role in insecticide transport and resistance [J]. Insect Biochemistry & Molecular Biology，2014，45（1）：89.

[9] Dermauw W，Osborne E J，Clark R M，et al. A burst of ABC genes in the genome of the polyphagous spider mite Tetranychus urticae [J]. BMC Genomics，2013，14（1）：317.

[10] Franco J，F(xiàn)erreira R C，Ienne S，et al. ABCG-like transporter of Trypanosoma cruzi involved in benznidazole resistance：gene polymorphisms disclose inter-strain intragenic recombination in hybrid isolates [J]. Infection Genetics & Evolution，2015，（31）：198-208.

[11] 夏春華，王廣基. 丙磺舒對多藥耐藥相關(guān)蛋白的逆轉(zhuǎn)作用及其對藥代動力學(xué)的影響與應(yīng)用[J]. 中國藥科大學(xué)學(xué)報，2007，38（5）：477-480.

[12] Sirotnak F M，Wendel H G，Bornmann W G B，et al. Coadministration of Probenecid，an Inhibitor of a cMOAT/MRPlike Plasma Membrane ATPase，Greatly Enhanced the Efficacy of a New 10-Deazaaminopterin against Human Solid Tumors in Vivo1 [J]. Clinical Cancer Research，2000，6（9）：3705-3712.

[13] Newell A，Herbert E，Vigus J，et al. Gonorrhoea in a south London genitourinary medicine department [J]. International Journal of Std & Aids，2003，14（9）：625-629.

[14] Spina S P，D E Jr. Effect of chronic probenecid therapy on cefazolin serum concentrations [J]. Annals of Pharmacotherapy，2003，37(5)：621-624.

[15] 劉永杰，沈晉良，楊田堂，等. 氯氟氰菊酯對斜紋夜蛾抗性和敏感種群表皮穿透比較[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，42（7）：2386-2391.

[16] Bretschneider A，Heckel D G，Vogel H. Know your ABCs：Characterization and gene expression dynamics of ABC transporters in the polyphagous herbivore Helicoverpa armigera [J]. Insect Biochemistry &Molecular Biology，2016，（72）：1-9.

[17] 梁革梅，譚維佳，郭予元. 人工飼養(yǎng)棉鈴蟲技術(shù)的改進(jìn)[J]. 植物保護(hù)，1999，25（2）：15-17.

[18] 鄭桂玲，李長友，周洪旭，等. 兩株棉鈴蟲胚胎新細(xì)胞系的建立及其對桿狀病毒侵染的反應(yīng)[J]. 昆蟲學(xué)報，2010，（53）：167-174.

[19] NY/T 1154.10-2008，農(nóng)藥室內(nèi)生物測定準(zhǔn)則殺蟲劑第10部分：人工飼料混藥法[S].

[20] 周青春，洪華珠. 利用MTT法測定殺蟲劑對細(xì)胞的毒力[J]. 植物保護(hù)學(xué)報，1996，23（4）：343-348.

[21] 侯志廣，方永睿，嘧東林，等. 高效液相色譜-三重串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測稻田中阿維菌素與茚蟲威的殘留量[J]. 農(nóng)藥，2015，（10）：744-747.

[22] 邢曉玲，王妲妲，袁小秋，等. 甲砜霉素及HP-β-CD甲砜霉素在家兔體內(nèi)的藥代動力學(xué)比較研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，（12）：11-14.

[23] Xiao Y，Liu K，Zhang D，et al. Resistance to Bacillus thuringiensis Mediated by an ABC Transporter Mutation Increases Susceptibility to Toxins from other Bacteria in an Invasive Insect [J]. Plos Pathogens，2016，12（2）：1-20.

[24] Seong K M，Sun W，Clark J M，et al. Splice form variant and amino acid changes in MDR49 confers DDT resistance in transgenic Drosophila [J]. Sci Rep，2016，（6）：23355.

[25] 康新樂，李玉婷，王 康，等. 禾谷縊管蚜ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因的克隆、分子特性及表達(dá)分析[J]. 昆蟲學(xué)報，2015，58（6）：593-602.

[26] De B F，Tod M，Bidault R，et al. Multiple interactions of cimetidine and probenecid with valaciclovir and its metabolite acyclovir [J]. Antimicrob Agents Chemother，2002，46（2）：458.

[27] Leader J P，O'Donnell M. J. Transepithelial transport of fluorescent p-glycoprotein and MRP2 substrates by insect Malpighian tubules：confocal microscopic analysis of secreted fluid droplets [J]. Journal of Experimental Biology，2005，（208）：4363-4376.

[28] Bhaskaracharya A，Daoung P，Jalilian I，et al. Probenecid Blocks Human P2X7 Receptor-Induced Dye Uptake via a Pannexin-1 Independent Mechanism [J]. Plos One，2014，9（3）：1-8.

[29] Watanabe I，Tatebe J，Namba S，et al. Activation of aryl hydrocarbon receptor mediates indoxyl sulfate-induced monocyte chemoattractant protein-1 expression in human umbilical vein endothelial cells [J]. Circulation Journal Official Journal of the Japanese Circulation Society，2013，77（1）：224-230.

[30] Nzila A，Mberu E，Bray P，et al. Chemosensitization of Plasmodium falciparum by Probenecid In Vitro [J]. Antimicrobial Agents & Chemotherapy，2003，47（7）：2108.

[31] Yu C P，Sweet D H，Peng Y H，et al. Effects of nonsteroidal antiinflammatory drugs on the renal excretion of indoxyl sulfate，a nephrocardiovascular toxin，in rats [J]. European Journal of Pharmaceutical Sciences，2017，（101）：66-70.

（責(zé)任編輯：肖彥資）

TheSynergismMechanismofProbenecidonAvermectinsTreatingHelicoverpaArmigeraCell

WANG Zan-yong1，ZHOU Yong2，Ma Hai-hao2，LIU Jia2，ZHU Hang2，DENG Xi-le2，TAN Hui-hua1，ZHOU Xiao-mao2
（1. College of Agriculture, Guangxi Univeristy, Nanning 530004,PRC; 2. Hunan Agricultural Biotechnology Research Center, Changsha 410125, PRC）

Probenecid is inhibitor of ABC transport. In this research, we use artificial feed contain 30 mg/L avermectins and 200 μmol/ L probenecid to feed Helicoverpa armigera and detect the content of avermectins in Helicoverpa armigera midgut. The results showed that compared with the using avermectin alone, after mixed with probenecid, the average dwell time (MRT) of avermectins in midgut increased by 13%, the Half-life (t1/2 z) increased by 27%, and Peak concentration increased 2.8 times. It was found that after using combination of sublethal dose avermectins and 400 μmol/L probenecid, Ha cell viability reduced by 67.1% by cell vitality determination. These phenomenon indicated that inhibition of ABC transporters can improve intestinal resident ability of avermectins in the Ha midgut, improve drug toxicity to the cells of Ha.

liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry(HPLC-MS); Helicoverpa armigera; ABC transporters; avermectins; probenecid

S482

A

1006-060X（2017）05-0064-05

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.005.018

2017-03-12

國家自然科學(xué)基金（31371966）

王贊永（1987-），男，湖南長沙市人，碩士研究生，研究方向為農(nóng)藥毒理與有害生物抗藥性。

譚輝華，周小毛