河內白曲霉酸性α－淀粉酶高產菌株的誘變選育*

張玉然 張曉云 郭蘭英 張海林

（1濟寧醫(yī)學院生物科學學院 山東日照 276826 2山東徐旭酒曲有限公司 山東濟寧 272000）

酸性α－淀粉酶屬于液化酶（α－淀粉酶）的一種，可在低pH值條件下隨機切斷淀粉分子內的α－1，4糖苷鍵，迅速將其降解為糊精、寡糖等小分子［1－2］。 酸性 α－淀粉酶廣泛應用于釀酒、制糖、紡織、飼料、造紙等行業(yè)，具有良好的社會和經濟效益［3］。

在淀粉質原料的水解制糖工藝中，由于α－淀粉酶和糖化酶最適反應pH值的差異，淀粉質原料液化后進入糖化前需加入大量酸試劑調低pH值。開發(fā)耐酸性的α－淀粉酶，使其最適反應pH值與糖化酶相近，可節(jié)省大量酸試劑的消耗，節(jié)約成本［4－5］。

目前，研究者對黑曲霉和枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵生產酸性α－淀粉酶的研究較多，并通過多種方法選育獲得了高產菌株，廣泛應用于醫(yī)藥、紡織和環(huán)境治理等領域［6－8］。 但在釀酒行業(yè)，由于白酒香味和口感的特殊需求，常利用河內白曲霉（Hanoiwhite starter）固態(tài)發(fā)酵生產酸性α－淀粉酶，并將生產出的含酸性α－淀粉酶的固態(tài)白曲直接應用于白酒生產。目前研究者對該菌株的研究較少，固態(tài)發(fā)酵的酸性α－淀粉酶酶活力普遍較低，篩選具有高產酸性α－淀粉酶能力的河內白曲霉勢在必行。

本研究以河內白曲霉為出發(fā)菌株，采用不同濃度的DES誘變處理萌發(fā)過夜的河內白曲霉孢子，后根據透明圈法篩選高產突變株，進一步搖瓶復篩，以期獲得產量高、穩(wěn)定性好的河內白曲霉突變株。

1 材料與方法

1.1 材料

1）菌種。河內白曲霉為實驗室保存。

2）培養(yǎng)基。

①改良的PDA培養(yǎng)基：土豆浸出汁 30%，瓊脂 2%，自然pH值。②篩選培養(yǎng)基：玉米淀粉2%，酵母 0.5%，KCl 0.1%，KH2PO40.03%，MgSO4·7H2O 0.05%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.0002%，瓊脂 2%，pH 6.5～7.0。③固體發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮12.5 g，自來水12.5 mL，置于500 mL三角燒瓶。

1.2 菌株的誘變篩選

1.2.1 孢子懸液的制備 于麥芽汁斜面培養(yǎng)基中刮取孢子，加入含25 mL 2 g/L葡萄糖的三角瓶中，混勻打散，稀釋至孢子數為107CFU/mL，于室溫下靜置萌發(fā)過夜。

1.2.2 DES誘變及初篩 取5 mL過夜萌發(fā)的孢子懸液，分別加入DES至終濃度為0%、1%、3%、5%、6%、7%、9%、12%，混勻，30℃，220 r/min 振蕩處理20 min后，各組分別加入等體積的25%Na2S2O3溶液終止反應。將誘變處理后的孢子懸液適當稀釋，涂布于篩選培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)3～4 d，以未經誘變處理的出發(fā)菌株為對照，計算致死率。挑選長勢良好、透明圈與菌落直徑比值（HC）較大的單菌落進行復篩。

1.2.3 搖瓶復篩 挑取2環(huán)孢子，接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)，分別于第 24 h、36 h、48 h各翻曲一次，測定不同突變株酸性α－淀粉酶的酶活力。

1.2.4 傳代培養(yǎng) 將誘變篩選出的突變株連續(xù)傳代培養(yǎng)，測定各批次酸性α－淀粉酶酶活力。

1.3 酶活力測定 方法參照相關參考文獻［9］進行。

2 結果與分析

2.1 不同濃度DES的致死率 誘變育種是獲得高產菌株的常用方法［10－11］，將誘變致死率控制在75%～85%時誘變效果較佳，易獲得高產突變菌。利用不同濃度DES處理河內白曲霉孢子20 min后的致死率曲線如圖1所示。由圖1可知，使用1%DES誘變處理20 min時，對河內白曲霉的致死率為84.3%。

圖1 不同濃度DES誘變河內白曲霉的致死率

2.2 高產酸性α－淀粉酶突變株的初篩 將1%DES誘變處理20 min的河內白曲霉孢子懸液適當稀釋涂布，培養(yǎng)觀察并計算HC比值。從502株突變株中挑選出HC比值較高的突變株列于表1，可知突變株Hanoi white starter 4的HC比值最大，且長勢良好。

表1 酸性α-淀粉酶高產突變株的初篩

2.3 高產酸性α－淀粉酶突變株的搖瓶復篩 對表1中初篩獲得的突變株進行搖瓶復篩，各突變株發(fā)酵產酸性α－淀粉酶的能力如表2所示。可知，Hanoiwhite starter 4發(fā)酵酶活力最高，達20.8 U/g，較出發(fā)菌株提高了61.2%，這也與其HC比值最高相對應。

表2 高產酸性α-淀粉酶突變株的復篩

2.4 突變株Hanoi white starter 4的遺傳穩(wěn)定性將高產酸性α－淀粉酶的突變株Hanoi white starter 4于麩皮固體發(fā)酵培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)6次，測定每批次的酸性α－淀粉酶酶活力，結果如圖2所示?？芍?，該菌株產酸性α－淀粉酶的遺傳穩(wěn)定性良好，可用于后續(xù)工業(yè)放大生產。

圖2 高產酸性α-淀粉酶突變株的遺傳穩(wěn)定性

3 結論

在釀酒行業(yè)，鑒于酒品質的高要求，該行業(yè)常使用河內白曲霉固態(tài)發(fā)酵生產酸性α－淀粉酶，為使淀粉質原料水解制糖工藝中α－淀粉酶和糖化酶最適反應pH值相近，節(jié)省大量酸試劑的消耗，節(jié)約成本，篩選耐酸性的α－淀粉酶十分必要。本研究以河內白曲霉為出發(fā)菌株，采用不同濃度DES誘變處理萌發(fā)的河內白曲霉孢子，根據透明圈大小初篩、搖瓶復篩高產酸性α－淀粉酶的突變株。研究結果表明，將萌發(fā)的孢子于1%DES處理20 min后，對河內白曲霉的致死率為84.3%，后經涂布篩選獲得一株高產酸性α－淀粉酶的突變株Hanoi white starter 4，發(fā)酵后酶活力達20.8 U/g，較出發(fā)菌株提高61.2%。該突變株產酸性α－淀粉酶的遺傳穩(wěn)定性良好，可用于后續(xù)工業(yè)放大生產。

［1]王建玲，陳志鑫，劉逸寒，等.產耐酸性α－淀粉酶菌株的分離、鑒定、酶學特性研究及發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化.生物技術通報，2014，30(4)：159.

［2]Sharma A，Satyanarayana T.Microbial acid－stable α－amylases：characteristics，genetic engineering and applications.Process Biochemistry，2013，48(2)：201.

［3]Kalpana B J，Pandian S K.Halotolerant，acid－alkali stable，chelator resistant and raw starch digesting α－amylase from a marine bacterium Bacillus subtilis S8－18.Journal of Basic Microbiology，2014，54(8)：802.

［4]Liu JH，Xia W G，Abdullahi A Y，et al.Purification and partial characterization of an acidic α－amylase from a newly isolated Bacillus subtilis ZJ－1 that may be applied to feed enzyme.Preparative Biochemistry and Biotechnology，2015，45(3)：259.

［5]張玉然，張曉云，田田，等.酸性α－淀粉酶研究進展.濟寧醫(yī)學 院 學 報，2015，38(5)：310.

［6]錢萍.酸性淀粉酶菌株的誘變選育及酶學性質研究.食品工業(yè) 科 技，2012，33(11)：184.

［7]王發(fā)祥，俞健，王建輝，等.1株產酸性α－淀粉酶黑曲霉原生質體制備和再生條件優(yōu)化.食品科學，2014，35(1)：156.

［8]Sharma A，Satyanarayana T.Production of acid－stable and high－maltose－forming α－amylase of Bacillus acidicola by solid－state fermentation and immobilized cells and its applicability in baking.Applied Biochemistry and Biotechnology，2012，168(5)：1029.

［9]賀勝英，楊云娟，許波，等.白曲霉Asp－amy1固體發(fā)酵生產酸性淀粉酶的初步研究.釀酒科技，2009(8)：42.

［10]田豐偉，程傳榮，袁維涵，等.原生質體誘變選育ε－聚賴氨酸高產菌株.微生物學通報，2010，37(10)：1457.

［11]劉俊梅，王慶，王丹，等.紫外線和硫酸二乙酯復合誘變選育PHB 高產菌株.微生物學通報，2016，43(10)：2242.