辣椒炭疽病菌抗啶氧菌酯突變體滲透壓敏感性及交互抗性

石玉星，曹俊宇，任璐，2，劉慧平

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801；2.農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原030031）

辣椒炭疽病菌抗啶氧菌酯突變體滲透壓敏感性及交互抗性

石玉星1，曹俊宇1，任璐1，2，劉慧平1

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801；2.農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西太原030031）

為了探討辣椒炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides敏感菌株與抗啶氧菌酯突變體對(duì)滲透壓敏感性的差異，室內(nèi)誘導(dǎo)獲得了C.gloeosporioides對(duì)啶氧菌酯的抗性突變體，在此基礎(chǔ)上，對(duì)其抗感菌株滲透壓敏感性及交互抗性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，抗感菌株在供試葡萄糖濃度下均可生長(zhǎng)，相比無(wú)糖培養(yǎng)基，在含有葡萄糖的培養(yǎng)基上菌落直徑顯著增加；隨著培養(yǎng)基中NaCl濃度的升高，抗感菌株菌絲生長(zhǎng)均受到抑制，且敏感菌株與不同抗性水平抗性突變體對(duì)高濃度NaCl滲透壓均敏感，但滲透壓敏感性沒(méi)有顯著差異。啶氧菌酯與嘧菌酯、醚菌酯、多菌靈、咪鮮胺的交互抗性測(cè)定結(jié)果顯示，啶氧菌酯與同屬甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑的嘧菌酯、醚菌酯之間存在正交互抗性，與多菌靈、咪鮮胺之間均無(wú)交互抗性產(chǎn)生。該研究結(jié)果可為指導(dǎo)生產(chǎn)中合理用藥提供理論依據(jù)。

辣椒炭疽病菌；啶氧菌酯；滲透壓敏感性；交互抗性

辣椒既有一年生植物也有多年生植物，一般在溫帶多為一年生草本植物，而在熱帶是多年生灌木[1]。辣椒是一種大眾化蔬菜和調(diào)味品，是山西省蔬菜產(chǎn)業(yè)的主要栽培項(xiàng)目之一[2]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)其研究報(bào)道主要集中在栽培技術(shù)、品種比較、病害防治以及生理等方面[3-6]。辣椒炭疽病是辣椒生產(chǎn)中一種常發(fā)病害，對(duì)辣椒果實(shí)的危害尤為嚴(yán)重，導(dǎo)致辣椒腐爛，失去經(jīng)濟(jì)價(jià)值[7]。目前，生產(chǎn)上運(yùn)用化學(xué)殺菌劑防治辣椒炭疽病在其病害綜合防治中占有重要地位，常用殺菌劑主要有芳烴類(lèi)、有機(jī)硫類(lèi)及苯并咪唑類(lèi)殺菌劑等。由于殺菌劑的過(guò)量使用及不合理使用導(dǎo)致炭疽病菌對(duì)多種常用殺菌劑已產(chǎn)生較高水平的抗藥性[8]，而病原菌一旦產(chǎn)生抗藥性，藥劑的防治效果會(huì)顯著下降[9]。李洋等[10]就遼寧省葡萄炭疽菌對(duì)多菌靈敏感性測(cè)定結(jié)果顯示，某些地區(qū)已產(chǎn)生了抗性水平較高的菌株。葉佳等[11]對(duì)浙江地區(qū)的葡萄炭疽菌群體進(jìn)行抗藥性研究，發(fā)現(xiàn)該病菌對(duì)甲基硫菌靈敏感性降低，表現(xiàn)出一定程度的抗藥性。上述報(bào)道進(jìn)一步說(shuō)明，由于該類(lèi)殺菌劑的施用，已出現(xiàn)某些植物病原菌對(duì)其敏感性下降的現(xiàn)象[12]。

啶氧菌酯（Picoxystrobin）是甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑中內(nèi)吸活性最強(qiáng)的，主要用于防治麥類(lèi)的葉面病害如葉枯病、葉銹病、白粉病等，以及辣椒炭疽病、葡萄黑痘病等經(jīng)濟(jì)作物病害。啶氧菌酯通過(guò)抑制細(xì)胞線粒體氧化呼吸所必經(jīng)的細(xì)胞色素b和c1之間的電子轉(zhuǎn)移來(lái)阻斷生物的呼吸路徑，從而起到殺菌效果[13]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)啶氧菌酯抗藥性的相關(guān)報(bào)道還很鮮見(jiàn)。

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院蔬菜病害化學(xué)防治課題組在山西省范圍內(nèi)采集分離的辣椒炭疽病菌經(jīng)鑒定主要由Colletotrichum gloeosporioides和Colletotrichum capsici引起。啶氧菌酯作為甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑中的新品種，抗藥性分子突變位點(diǎn)單一，抗藥性風(fēng)險(xiǎn)較高，且啶氧菌酯還未在山西省的辣椒產(chǎn)區(qū)廣泛應(yīng)用，因此，本研究在誘導(dǎo)辣椒炭疽病菌對(duì)啶氧菌酯抗性突變體的基礎(chǔ)上，對(duì)其抗感菌株滲透壓敏感性及交互抗性進(jìn)行研究，旨在為指導(dǎo)生產(chǎn)中合理用藥提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試病原菌在山西省晉中市3個(gè)未使用過(guò)甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑的辣椒種植區(qū)采集、分離并純化獲得45株辣椒炭疽病菌，經(jīng)鑒定為Colletotrichum gloeosporioides。敏感菌株經(jīng)過(guò)室內(nèi)誘導(dǎo)得到6株低抗突變體和2株中抗突變體。

1.1.2 供試藥劑95%啶氧菌酯（Picoxystrobin）原藥：湖北健源化工有限公司，用丙酮制成10000μg/mL的母液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

嘧菌酯（Azoxystrobin）：陜西恒田化工有限公司，有效成分為250 g/L懸浮劑，采用無(wú)菌水配成10 000 μg/mL母液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

醚菌酯（Kresoxim-methyl）：陜西恒田化工有限公司，有效成分為250 g/L懸浮劑，用無(wú)菌水配成10 000 μg/mL母液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

90%多菌靈（Carbendazim）：四川國(guó)光農(nóng)化有限公司，可濕性粉劑，用無(wú)菌水配成1 000 μg/mL母液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

25%咪鮮胺（Prochloraz）：河北省農(nóng)藥化工有限公司，用無(wú)菌水配成1 000 μg/mL的母液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～17 g、水1 000 mL。

含藥培養(yǎng)基：若為原藥先用適量丙酮溶解，之后用蒸餾水配制成10 mg/mL或1 mg/mL的母液（若為制劑則可直接用蒸餾水配制成10 mg/mL或1 mg/mL的母液），用時(shí)再用無(wú)菌水配制成適合的濃度，按照藥劑與培養(yǎng)基1∶9的比例進(jìn)行稀釋?zhuān)p輕搖晃混勻即可得到含藥培養(yǎng)基（加藥時(shí)應(yīng)先冷卻培養(yǎng)基至50℃左右，以防藥劑在高溫中不穩(wěn)定）。

1.2 方法

1.2.1 抗感菌株滲透壓敏感性測(cè)定選取敏感菌株JX3，SN13，YZ6與抗性突變體JX3R2，SN13R1，YZ6R2，JX3MR3，YZ6MR4共8株，采用菌絲生長(zhǎng)速率法進(jìn)行滲透壓敏感性測(cè)定。

在PDA培養(yǎng)基中加入所需濃度的葡萄糖或NaCl，使得培養(yǎng)基中葡萄糖終質(zhì)量濃度為10，20，40，80，100 g/L，NaCl終質(zhì)量濃度為10，20，40，60，80 g/L。在已活化7 d的抗感菌株的菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅，分別接入含梯度濃度葡萄糖及NaCl的PDA平板上，每處理設(shè)3次重復(fù)，放置到25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。6 d后，用十字交叉法測(cè)量其菌落直徑（cm）。

1.2.2 交互抗性測(cè)定選取敏感菌株JX1，JX3，JX8，JX11，SN5，SN7，SN13，YZ3，YZ6，YZ13和抗性突變體JX3R1，JX3R2，SN13R1，YZ6R1，YZ6R2，YZ6R3，共16株，采用菌絲生長(zhǎng)速率法，分別測(cè)定對(duì)醚菌酯、嘧菌酯、多菌靈和咪鮮胺的敏感性（EC50），用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件（IBMSPSSStatistics 20）計(jì)算相關(guān)系數(shù)r值和顯著水平P值，分析啶氧菌酯與供試藥劑兩兩間是否存在交互抗性。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗感菌株的滲透壓敏感性測(cè)定

表1 不同葡萄糖質(zhì)量濃度下抗感菌株菌落直徑cm

從表1可以看出，抗感菌株在供試葡萄糖質(zhì)量濃度下均可生長(zhǎng)，相比無(wú)糖培養(yǎng)基，在含有葡萄糖的培養(yǎng)基上菌落直徑顯著增大，說(shuō)明葡萄糖在質(zhì)量濃度小于100 g/L時(shí)，其提供營(yíng)養(yǎng)的作用大于滲透抑制作用。親本菌株JX3，SN13，YZ6與低抗突變體SN13R1，YZ6R2均在葡萄糖質(zhì)量濃度為80 g/L的培養(yǎng)基中，菌落直徑最大，而低抗突變體JX3R2和中抗突變體JX3MR3，YZ6MR4分別在葡萄糖質(zhì)量濃度為40，10 g/L時(shí)最大。

由表2可知，抗感菌株菌落直徑均隨NaCl質(zhì)量濃度升高而呈現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)。當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度為60 g/L時(shí)，抗感菌株菌落直徑均非常??；當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度為80 g/L時(shí)，供試抗感菌株均不能生長(zhǎng)。說(shuō)明敏感菌株與不同抗性水平突變體對(duì)高鹽濃度滲透壓均都很敏感。

表2 不同NaCl質(zhì)量濃度下抗感菌株菌落直徑cm

2.2 交互抗性測(cè)定

參照范子耀等[14]、馬建英等[15]的方法，進(jìn)行線性回歸分析，由圖1可知，啶氧菌酯與其他4種藥劑（咪鮮胺、多菌靈、嘧菌酯、醚菌酯）的顯著水平P值分別為0.178，0.117，0.000和0.000。多菌靈和咪鮮胺的P值均大于0.05，在5%水平上差異不顯著，說(shuō)明啶氧菌酯與這2種殺菌劑之間不存在交互抗性。嘧菌酯和醚菌酯的P值均小于0.05，在5%水平上差異顯著，說(shuō)明啶氧菌酯與這2種殺菌劑之間存在正交互抗性。

3 結(jié)論與討論

ELLIS等[16]研究顯示，產(chǎn)生抗藥性可能會(huì)影響滲透壓的調(diào)節(jié)能力。因此，本試驗(yàn)制成含不同質(zhì)量濃度NaCl和葡萄糖的PDA培養(yǎng)基用以模擬滲透壓變化的環(huán)境，以此來(lái)衡量抗感菌株滲透壓調(diào)節(jié)能力的大小。結(jié)果表明，相比無(wú)糖培養(yǎng)基，在含有葡萄糖的培養(yǎng)基上菌落直徑會(huì)明顯增加，說(shuō)明了葡萄糖在質(zhì)量濃度低于100 g/L時(shí)，其提供營(yíng)養(yǎng)作用大于滲透抑制作用，且抗感菌株對(duì)于葡萄糖滲透壓變化均不敏感。而在高鹽環(huán)境下，抗感菌株菌落直徑相比無(wú)鹽環(huán)境均明顯受到抑制。這一結(jié)果與ELLIS等[16]報(bào)道的病原菌在滲透壓較高的情況下，需要消耗大量能量用以合成甘油來(lái)保持細(xì)胞膨壓，從而度過(guò)高滲透壓這種極端環(huán)境，因此，病原菌本身生長(zhǎng)就被抑制這一結(jié)果相一致。

通過(guò)對(duì)啶氧菌酯與咪鮮胺、多菌靈、嘧菌酯與醚菌酯4種藥劑的交互抗性研究表明，啶氧菌酯與醚菌酯、嘧菌酯這2種同屬甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑之間存在正交互抗性，與甾醇合成抑制劑殺菌劑咪鮮胺及苯并咪唑類(lèi)殺菌劑多菌靈等作用機(jī)理不同的殺菌劑之間沒(méi)有交互抗性。因此，在生產(chǎn)中應(yīng)該注意避免啶氧菌酯與同類(lèi)殺菌劑同時(shí)或連續(xù)使用，建議與不同作用機(jī)制殺菌劑交替使用，延緩抗藥性的產(chǎn)生，延長(zhǎng)藥劑的使用壽命。

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Osmotic Pressure Sensitivity and Cross-resistance ofColletotrichum gloeosporioidesResistant Mutants to Picoxystrobin

SHI Yuxing1，CAOJunyu1，RENLu1，2，LIUHuiping1
（1.College ofAgronomy，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；2.Shanxi Province KeyLaboratoryofIntegrated Pest Management in Agriculture，Taiyuan 030031，China）

To investigate the osmotic pressure sensitivity of Colletotrichum gloeosporioides picoxystrobin-resistant mutants and sensitive strains,the research induced and obtained C.gloeosporioides resistant mutants to picoxystrobin.On this basis,the osmotic pressure sensitivity and the cross-resistance were studied.The results showed that all isolates could growwell on the PDA medium with all of glucose concentrations and the colony diameters increased obviously in the medium containing glucose compared with no glucose. But all isolates grew poor with the increase of NaCl concentration and both resistant and parent sensitive isolates were sensitive to high NaCl concentration.The results of cross-resistance showed that picoxystrobin had positive cross-resistance with azoxystrobin and kresoxim-methyl,while no cross-resistance was detected between picoxystrobin and other type fungicides,such as carbendazim and prochloraz.The research results provide theoretical basis for the guidance of pesticides use in production.

Colletotrichum gloeosporioides;picoxystrobin;osmotic pressure sensitivity;cross-resistance

S436.418.1＋1

：A

：1002-2481（2017）06-1002-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.06.34

2017-01-13

農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題（YHSW2015002）

石玉星（1993-），女，山西臨汾人，在讀碩士，研究方向：農(nóng)藥毒理與生物農(nóng)藥。劉慧平為通信作者。