葛根上調(diào)肝胰島素抵抗HepG2細(xì)胞OB—R IRS2，GLUT1和GLUT2蛋白調(diào)節(jié)糖代謝的研究

黎宇+羅新新+嚴(yán)奉東+魏漳彬+涂珺

[摘要] 研究中藥葛根對人肝癌HepG2細(xì)胞胰島素抵抗（IR）模型糖代謝的改善作用并初步探討葛根降糖的分子作用機制。該實驗采用課題組優(yōu)化方法，1×10-9 mol·L^-1胰島素加3.75×10-6 mol·L^-1地塞米松聯(lián)合給藥HepG2細(xì)胞48 h建立穩(wěn)定的IR模型；CCK-8法檢測葛根含藥血清對細(xì)胞活性的影響；葡萄糖氧化酶法檢測多個時間點（12，15，18，21，24，30，36 h） IR-HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量；蒽酮法檢測細(xì)胞內(nèi)糖原含量；Western blot法檢測胰島素受體底物2（IRS2）、瘦素受體（Ob-R）、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（GLUT1）和GLUT2蛋白表達(dá)水平。研究結(jié)果顯示葛根含藥血清（5%，10%，15%）對IR-HepG2細(xì)胞的活力沒有明顯的影響；5%和10%葛根含藥血清在給藥18，21，24 h均顯著上調(diào)IR-HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量（P<0.01），15%葛根含藥血清除給藥15 h上調(diào)葡萄糖消耗量較弱（P<0.05），18，21，24，30 h都顯著上調(diào)葡萄糖消耗量（P<0.01），呈現(xiàn)一定程度劑量依賴性。葡萄糖消耗時效實驗確認(rèn)24 h是最佳時間點，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)葛根含藥血清作用24 h增加胞內(nèi)糖原含量（P<0.01）；上調(diào)IRS2，Ob-R，GLUT1和GLUT2蛋白表達(dá)量。葛根含藥血清降糖作用可能部分通過上調(diào)Ob-R和IRS2蛋白表達(dá)來調(diào)節(jié)以PI3K/PDK為中心的胰島素信號通路；上調(diào)IR-HepG2細(xì)胞GLUT1和GLUT2表達(dá)量，加速葡萄糖轉(zhuǎn)運進(jìn)入肝細(xì)胞中并增加糖原合成來增強IR-HepG2細(xì)胞的胰島素敏感性來實現(xiàn)的。

[關(guān)鍵詞] 胰島素信號通路； 胰島素受體底物2（IRS2）； 瘦素受體（Ob-R）； 葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（GLUT1）；GLUT2

[Abstract] To observe the anti-hyperglycemic effect of Puerariae Lobatae Radix in hepatocyte insulin resistance（IR） models， and investigate its preliminary molecular mechanism. IR-HepG2 cell model was stably established with 1×10-9 mol·L^-1 insulin plus 3.75×10-6 mol·L^-1 dexamethasone treatment for 48 h according to optimized protocol in our research group. After IR-HepG2 cells were treated with different concentrations（5%，10% and 15%） of Puerariae Lobatae Radix-containing serum， cell viability was detected by CCK-8 assay； the glucose consumptions in IR-HepG2 cells were separately detected at different time points （12， 15， 18， 21， 24， 30， 36 h） by using glucose oxidase method； intracellular glycogen content was detected by anthrone method； and the protein expression levels of leptin receptor （Ob-R）， insulin receptor substrate-2 （IRS2）， glucose transporter 1（GLUT1） and GLUT2 were detected by Western blot assay. The results showed that Puerariae Lobatae Radix-containing serum （5%， 10% and 15%） had no significant effect on IR-HepG2 cell viability； 5% and 10% Puerariae Lobatae Radix-containing serum significantly increased glucose consumption of IR-HepG2 cells （P<0.01） at 18， 21 and 24 h； 15% Puerariae Lobatae Radix-containing serum elevated the glucose consumption of IR-HepG2 cells at 15 h （P<0.05）， and significantly elevated the glucose consumption at 18， 21， 24 and 30 h （P<0.01） in a dose-dependent manner. The optimized time of anti-hyperglycemic effect was defined as 24 h， and further study showed that Puerariae Lobatae Radix-containing serum could increase intracellular glycogen content after 24 h treatment （P<0.01）， and up-regulate IRS2， Ob-R， GLUT1 and GLUT2 protein expression levels. Our results indicated that Puerariae Lobatae Radix-containing serum could achieve the anti-hyperglycemic effect through important PI3K/PDK signaling pathway partially by up-regulating the expression levels of Ob-R and IRS2， GLUT1 and GLUT2 in IR-HepG2 cells， accelerating the glucose transport into hepatocytes and increasing hepatic glycogen synthesis to enhance the anti-hyperglycemic effect of IR-HepG2 cells.

[Key words] insulin resistance （IR）； IRS2； Ob-R； GLUT1； GLUT2

眾多臨床實踐發(fā)現(xiàn)中藥在降糖調(diào)脂及治療2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）中注重調(diào)節(jié)人體的整體機能，作用溫和，長期使用具有較強的競爭優(yōu)勢[1]。在中藥臨床辨證治療，葛根為主的系列經(jīng)方廣泛用于糖尿病發(fā)生發(fā)展的不同階段。采用分子網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，葛根主要成分葛根素、大豆苷元、染料木苷等均作用于胰島素信號PI3K，JNK通路，PI3K，JNK通路在胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起著重要的作用，其異常的表達(dá)可能會影響葡萄糖轉(zhuǎn)運和合成、脂質(zhì)代謝等[2]。已有研究發(fā)現(xiàn)葛根顆粒劑可明顯改善肥胖小鼠的糖脂代謝紊亂[3]。葛根煎劑能顯著降低糖尿病大鼠空腹血糖、游離脂肪酸、TNF-α的含量來提高胰島素敏感指數(shù)[4]。葛根主要藥效成分葛根素能改善T2DM患者血糖[5]，葛根素治療糖尿病的主要作用機制可能與降血糖、抗氧化應(yīng)激、抑制蛋白質(zhì)非酶糖基化等相關(guān)[6]。

本課題組研究發(fā)現(xiàn)重用葛根的葛根芩連湯配伍干預(yù)糖尿病大鼠呈現(xiàn)更好的降糖降脂藥效，可有效減輕胰島素抵抗（insulin resistance，IR）。本課題組已采用血清藥理學(xué)方法發(fā)現(xiàn)葛根含藥血清可明顯提高IR-3T3-L1脂肪細(xì)胞降糖降脂作用，干預(yù)多個糖脂代謝相關(guān)基因表達(dá)來改善脂肪IR的作用[7]。本實驗采用先期優(yōu)化胰島素加地塞米松的穩(wěn)定體外肝IR細(xì)胞模型[8]，研究葛根含藥血清對IR-HepG2細(xì)胞糖代謝的影響及并初步探討降糖的相關(guān)分子機制，為葛根的方劑配伍和臨床精準(zhǔn)用藥提供理論指導(dǎo)。

1 材料

1.1 藥物 人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞購于北京鼎國生物科技有限公司（源于協(xié)和細(xì)胞庫）。葛根（批號912014，產(chǎn)地廣西，江西匯仁藥業(yè)有限公司），葛根素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.4%，符合2015年版《中國藥典》標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 動物 SPF級雄性SD大鼠，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號11400700119627。

1.3 試劑 葡萄糖測定試劑盒（上海榮盛生物藥業(yè)有限公司，GOD-POD法，批號361500）；DMEM高糖培養(yǎng)基（Hyclone公司，批號NAE1396）；胰島素（Sigma分裝）；地塞米松（Sigma公司，批號#BCBC92609V）；Cell Counting Kit-8（同仁化學(xué)研究所，批號JH620）；鹽酸二甲雙胍（中國食品藥品檢定研究院，批號41DF-4HDKM）；非諾貝特（中國食品藥品檢定研究院，批號41DF-4HKJM）；GLUT1抗體（美國Millipore公司，批號#2430566）；GLUT2抗體（美國Abcam公司，批號#ab921599）；Ob-R抗體（美國Santa公司，批號L2673）；IRS-2（美國CST公司，批號3089S）；辣根酶標(biāo)記山羊抗鼠二抗（聯(lián)科生物公司，批號#5103930）。

1.4 儀器 倒置顯微鏡（日本Olympus CKX41）；CO2培養(yǎng)箱[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；全波長酶標(biāo)儀（Spectra Max Plus384，美國Molecular Devices）；電泳儀、水平和垂直電泳槽、轉(zhuǎn)移槽（美國Bio-Rad公司）；化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 葛根含藥血清的制備及含量測定 參考本課題組已發(fā)表文獻(xiàn)的方法制備[7]，簡述如下：稱取葛根藥材并加入8倍藥重的水，浸泡30～60 min；煮沸40 min后，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮制備葛根水提液（1 g·mL^-1），保存于4 ℃?zhèn)溆?。SD雄性大鼠60只，體重（280±20） g，隨機分為空白血清組（40只），葛根含藥血清組（20只）。含藥血清組按每100 g大鼠體重給藥量2.5 mL給予葛根水提液灌胃制備，分裝-20 ℃保存。UPLC-MS檢測葛根成分葛根素和大豆苷元出峰時間及含量。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的HepG2細(xì)胞用15%FBS轉(zhuǎn)至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞接觸性抑制后，用10%FBS的DMEM培養(yǎng)基每3 d按1∶3傳代1次，待細(xì)胞從復(fù)蘇適應(yīng)2周后，于對數(shù)生長期進(jìn)行實驗。

2.3 IR-HepG2細(xì)胞模型建立 參考本課題先期優(yōu)化肝IR模型建立方法[8]，用1×10-9mol·L^-1胰島素加3.75×10-6 mol·L^-1地塞米松培養(yǎng)誘導(dǎo)48 h后，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，再用培養(yǎng)基37 ℃孵育20 min；重復(fù)上述過程1次，換上無血清培養(yǎng)液孵育24 h后，檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)基上清液中葡萄糖含量，計算葡萄糖消耗量。

2.4 對IR-HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響 復(fù)制2.3項中的模型，給藥分組為正常組，IR組，二甲雙胍組（2 mmol·L^-1），5%，10%，15%葛根含藥血清分組，每組都補大鼠空白血清至總血清含量為15%，在給藥12，15，18，21，24，30，36 h分別采用葡萄糖氧化酶法檢測其上清液中葡萄糖含量，參照文獻(xiàn)加以改進(jìn)[9]，以無細(xì)胞的空白孔為對照，以起始葡萄糖濃度減去各時間點葡萄糖濃度來計算葡萄糖消耗量。

2.5 對HepG2細(xì)胞活性的影響 IR-HepG2細(xì)胞模型建立參照2.3項，細(xì)胞分組如2.4項。參照文獻(xiàn)方法[8]，給藥24 h后，每孔加10 μL CCK-8測定液，孵育1 h后，酶標(biāo)儀檢測490 nm吸光度A，計算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=A模型組/A對照組×100%。

2.6 對IR-HepG2細(xì)胞糖原含量的影響 復(fù)制2.3項中的模型，細(xì)胞分組如2.4項。給藥24 h時，將培養(yǎng)基棄去，用PBS清洗消化后，1 000 r·min^-1， 5 min收集細(xì)胞。棄去上清后加入1 mL PBS將細(xì)胞吹打均勻后分為2份后離心棄上清。一份加入糖原裂解液提取細(xì)胞內(nèi)的糖原，以蒽酮法測定糖原含量[10]；另一份加入細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞蛋白，用BCA試劑盒測定細(xì)胞內(nèi)總蛋白含量。細(xì)胞糖原合成量=糖原量/細(xì)胞總蛋白量。

2.7 對IR-HepG2細(xì)胞IRS2，Ob-R，GLUT1和GLUT2蛋白表達(dá)影響 將培養(yǎng)基棄去加入裂解液覆蓋細(xì)胞表面，放冰上10 min后4 ℃離心，14 000 r·min^-1，15 min后取上清；用BCA測定蛋白濃度。取各組蛋白樣品40 μg，以10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白，然后濕轉(zhuǎn)法（280 mA，1 h）將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，再用含5%脫脂奶粉的1×TBST室溫下封閉1 h后加入一抗蛋白，4 ℃過夜后，1×TBST洗膜3次，每次10 min；辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗蛋白，室溫輕搖1 h，充分洗滌后加入ECL工作液，放入化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀檢測，采用BIO-RAD公司的Image Lab軟件分析。

2.8 統(tǒng)計分析 所有數(shù)據(jù)以±s表示。2組間比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。采用德國Qiagen公司的Ingenuity Pathway Analysis（IPA）通路軟件對差異蛋白進(jìn)行功能分析，網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)并繪制相應(yīng)示意圖。

3 結(jié)果

3.1 葛根含藥血清對IR-HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響 在1×10-9 mol·L^-1胰島素加3.75×10-6 mol·L^-1地塞米松聯(lián)合培養(yǎng)48 h之后，與正常組相比，IR組葡萄糖消耗量顯著降低（P<0.01）；與IR組相比，5%和10%葛根含藥血清在給藥18，21，24 h均顯著上調(diào)IR-HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量（P<0.01），15%葛根含藥血清除給藥15 h上調(diào)葡萄糖消耗量較弱（P<0.05），18，21，24，30 h都顯著上調(diào)葡萄糖消耗量（P<0.01），呈現(xiàn)一定程度劑量依賴性。時效數(shù)據(jù)表明葛根含藥血清在給藥24 h增加IR-HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗量效果最好，見表1，認(rèn)定24 h為最佳藥效時間點。葛根含藥血清按作用24 h進(jìn)行后續(xù)糖原與蛋白實驗。

3.2 葛根含藥血清對IR-HepG2細(xì)胞活性的影響 不同劑量葛根含藥血清作用于IR-HepG2細(xì)胞24 h后，與正常組相比沒有明顯差異，表明葛根含藥血清對IR-HepG2細(xì)胞的活性沒有明顯影響，見表2。

3.3 葛根含藥血清對IR-HepG2細(xì)胞糖原含量影響 與正常組相比，IR組細(xì)胞糖原含量顯著降低（P<0.01）。給藥24 h后，與IR組相比，葛根含藥血清（5%，10%，15%）顯著增加IR-HepG2細(xì)胞的糖原含量，以10%和15%葛根含藥血清更為顯著（P<0.01），見表3。

3.4 對IRS2，Ob-R，GLUT1和GLUT2蛋白表達(dá)差異影響 與IR組相比，10%和15%葛根含藥血清作用24 h能顯著上調(diào)IRS2， Ob-R和GLUT2蛋白表達(dá)量（P<0.01）；葛根含藥血清（5%，10%，15%）明顯升高GLUT1蛋白表達(dá)，以5%和15%葛根含藥血清更為顯著（P<0.01），見圖1。根據(jù)干預(yù)蛋白表達(dá)差異繪制葛根含藥血清干預(yù)糖代謝途徑的示意圖，見圖2。

4 討論

糖尿病藥物研發(fā)以前多集中在單靶點的單成分藥物上，目前多靶點開發(fā)的西藥復(fù)方藥物不斷研發(fā)上市并獲得較為廣泛的接受。單味中藥和復(fù)方含有多個有效活性成分，可以多通路多靶點在多層次多水平多器官上作用于機體，可以產(chǎn)生較好療效，長期使用具有較小副作用，具有天然用藥優(yōu)勢。

眾所周知，T2DM的主要病理基礎(chǔ)是IR，IR貫穿T2DM發(fā)生發(fā)展的整個過程。IR主要表現(xiàn)為機體三大外周組織（脂肪、肝臟和骨骼?。┘?xì)胞膜上轉(zhuǎn)運和利用葡萄糖效率下降[11]。許多T2DM藥物的研發(fā)是基于影響胰島素信號通路的靶點來研發(fā)的，因為胰島素信號傳導(dǎo)障礙被認(rèn)為是誘發(fā)糖尿病系統(tǒng)性IR的主因。胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是胰島素和細(xì)胞膜表面的胰島素受體結(jié)合后，磷酸化胰島素受體底物（insulin receptor substrate，IRS），與PI3K形成蛋白復(fù)合物，磷酸化的PI3K進(jìn)一步通過PKB/Akt，PKC和一些下游通路，影響到葡萄糖轉(zhuǎn)運和糖原合成[12]。

葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（glucose transporter，GLUT）是介導(dǎo)哺乳動物細(xì)胞內(nèi)葡萄糖轉(zhuǎn)運和代謝的關(guān)鍵限速因子。GLUT蛋白表達(dá)和結(jié)構(gòu)異常與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，從血糖調(diào)節(jié)角度來說值得關(guān)注[13]。GLUT1分布最為廣泛，在哺乳動物各組織和細(xì)胞中均有表達(dá)，在細(xì)胞的基礎(chǔ)糖代謝中發(fā)揮重要作用。GLUT1的調(diào)節(jié)同GLUT4類似，可分為糖代謝前期的快調(diào)節(jié)和后期的慢調(diào)節(jié)2種形式，快調(diào)節(jié)主要是GLUT1從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上，慢調(diào)節(jié)主要是增加GLUT1的合成或減少GLUT1的降解來增加GLUT1蛋白總量[12]。筆者的實驗結(jié)果顯示肝IR造成細(xì)胞外液葡萄糖堆積形成高糖環(huán)境導(dǎo)致GLUT1表達(dá)下調(diào)，與以往研究結(jié)果相一致[13]。多個劑量組葛根含藥血清可通過慢調(diào)節(jié)顯著增加IR-HepG2細(xì)胞中GLUT1蛋白總量。此外，葛根含藥血清升高肝細(xì)胞IRS2蛋白表達(dá)，可能增強磷酸化PI3K/ PDK/αPKC信號通路，加速GLUT1轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上[14]。推測葛根可能以快慢2種方式調(diào)節(jié)GLUT1的數(shù)量和位置來主動調(diào)節(jié)IR-HepG2細(xì)胞的糖代謝，減輕肝葡萄糖轉(zhuǎn)運障礙。

除了GLUT1采用主要運輸?shù)霓D(zhuǎn)運方式外，其他GLUTs主要以易化擴(kuò)散的被動運輸方式來穿過細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙分子層實現(xiàn)葡萄糖的轉(zhuǎn)運。GLUT2是一種和葡萄糖結(jié)合力很低但具有高轉(zhuǎn)運能力的蛋白，主要分布在肝腎和胰島β細(xì)胞中，GLUT2可與葡萄糖激酶共同形成葡萄糖感受器，轉(zhuǎn)運葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞中，經(jīng)一系列信號傳遞，促成胰島β細(xì)胞的胰島素合成與分泌。GLUT2也是肝細(xì)胞中負(fù)責(zé)葡萄糖轉(zhuǎn)運的最主要媒介，可為糖原合成提供原料幫助抑制肝糖輸出來維持血糖穩(wěn)態(tài)[13-14]。GLUT2不同于GLUT1/GLUT4從胞漿外翻至細(xì)胞質(zhì)膜上執(zhí)行功能，則主要是從細(xì)胞質(zhì)膜上轉(zhuǎn)運葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞后內(nèi)吞至胞漿內(nèi)代謝[15]。本實驗研究結(jié)果顯示在無血清培養(yǎng)基孵育24 h后，正常HepG2細(xì)胞中GLUT2表達(dá)非常低，圖1上未見明顯條帶，與體外正常肝細(xì)胞中GLUT2可見明顯條帶不一致，推測原因可能是細(xì)胞外液葡萄糖堆積較少，加之作為癌細(xì)胞HepG2中GLUT1基礎(chǔ)表達(dá)較高，因而抑制GLUT2表達(dá)。IR細(xì)胞適應(yīng)高糖環(huán)境升高肝細(xì)胞膜表面GLUT2的表達(dá)，但仍不足以快速消耗外液中過量堆積的葡萄糖。10%和15%葛根含藥血清明顯上調(diào)GLUT2的表達(dá)，加速葡萄糖轉(zhuǎn)運進(jìn)入肝細(xì)胞中，為更多的肝糖原提供合成原料增強降糖效應(yīng)，與其他復(fù)方制劑芪蛭降糖膠囊升高GLUT2表達(dá)相一致[16]。

瘦素是多功能多靶器官的神經(jīng)免疫內(nèi)分泌調(diào)節(jié)激素，可抑制食欲減少脂肪過度堆積。瘦素與Ob-R結(jié)合參與多種信號傳導(dǎo)，可在體內(nèi)外調(diào)節(jié)胰島素誘導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)。Ob-R和瘦素的突變與胰島素分泌異常密切相關(guān)，且相互緊密關(guān)聯(lián)[17]。瘦素抵抗會明顯抑制胰島素受體的表達(dá)從而加重機體IR程度。正常的瘦素信號可以增強IRS和PI3K的結(jié)合。人肝細(xì)胞主要表達(dá)IRS2，是抑制肝糖異生必須的蛋白。IRS2是肝細(xì)胞中PI3K-Akt級聯(lián)中關(guān)鍵調(diào)控節(jié)點，缺失肝IRS2信號可導(dǎo)致營養(yǎng)過剩和肝能量代謝紊亂[18]。本實驗研究表明，與IR組相比，10%和15%葛根含藥血清增強IR-HepG2細(xì)胞Ob-R和IRS2表達(dá)。結(jié)合其他研究結(jié)果，推測葛根增強Ob-R和IRS2表達(dá)來減輕瘦素對胰島素受體表達(dá)抑制，增強IRS2和PI3K的結(jié)合，調(diào)節(jié)以磷酸化PI3K/PDK為中心節(jié)點的胰島素信號通路，通過PKC及其下游通路調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運，上調(diào)GLUT1和GLUT2表達(dá)及可能增加GLUT1的轉(zhuǎn)位到肝細(xì)胞膜上，從而減輕葡萄糖轉(zhuǎn)運障礙；通過PKB/Akt及其下游通路增加肝細(xì)胞內(nèi)糖原合成來改善糖代謝來增強胰島素敏感性。

總之，葛根含藥血清能夠有效調(diào)節(jié)肝糖代謝來改善IR，具體的調(diào)節(jié)機制還需要對胰島素信號通路上重要節(jié)點IRS2，Ob-R，PI3K和AKT等蛋白磷酸化水平及活性進(jìn)一步深入研究。對葛根體外細(xì)胞糖代謝的系列基礎(chǔ)研究將有助于從理論上指導(dǎo)以葛根為主要配伍的降糖復(fù)方制劑開發(fā)。

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[責(zé)任編輯 張寧寧]