在線固相萃取—HPLC測定4種蟲草類藥材中蟲草素和2′—脫氧腺苷

田野+王傳喜+錢正明+李周+周妙霞+孫萬陽+姚新生+李文佳+高昊

[摘要] 該文建立一種同時(shí)測定4種蟲草類藥材（冬蟲夏草、蛹蟲草、蟲草菌絲體和蟬花）中蟲草素（3′-脫氧腺苷）和2′-脫氧腺苷含量的在線固相萃取-高效液相色譜分析方法。供試品經(jīng)ZORBAX SB-AQ（4.6 mm×12.5 mm，5 μm）色譜柱富集，水-甲醇（91∶9）洗脫；ZORBAX SB-AQ（4.6 mm×150 mm，5 μm）色譜柱分離，流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液-甲醇（91∶9），檢測波長260 nm，柱溫40 ℃，流速1.0 mL·min^-1，分別對(duì)4種蟲草類藥材中蟲草素和2′-脫氧腺苷含量進(jìn)行檢測。結(jié)果表明冬蟲夏草、蟲草菌絲體和蟬花樣品中僅檢測到2′-脫氧腺苷，蛹蟲草樣品中僅檢測到蟲草素，早期報(bào)道的在冬蟲夏草中檢測到的蟲草素色譜峰可能是其同分異構(gòu)體2′-脫氧腺苷色譜峰或以2′-脫氧腺苷為主的與蟲草素的共洗脫色譜峰。該方法重復(fù)性好，準(zhǔn)確度高，分析時(shí)間短，可用于蟲草類藥材中蟲草素和2′-脫氧腺苷的分析。

[關(guān)鍵詞] 固相萃??； 高效液相； 蟲草素（3′-脫氧腺苷）； 2′-脫氧腺苷

[Abstract] An online SPE-HPLC method for simultaneous determination of cordycepin （3′-deoxyadenosine） and 2′-deoxyadenosine in Cordyceps genus （C. sinensis，C. militaris，Hirsutella sinensis and C. sobolifera） was developed. The samples were enriched on a ZORBAX SB-AQ （4.6 mm×12.5 mm，5 μm） column with isocratic elution by 9% methanol solution. The separation of analytes was performed on a ZORBAX SB-AQ （4.6 mm×150 mm，5 μm） column with gradient elution by 0.1% formic acid solution and methanol （91∶9）. The flow rate was 1.0 mL·min^-1. Column temperature was 40 ℃ and detection wavelength was 260 nm. This method has been applied for analysis of different Cordyceps genus. The 2′-deoxyadenosine was detected in C. sinensis，Hirsutella sinensis and C. sobolifera. The cordycepin was detected in C. militaris. In summary，the cordycepin chromatographic peak from C. sinensis in some past reports may be the 2′-deoxyadenosine chromatographic peak or the mixture peak of 2′-deoxyadenosine and cordycepin in which 2′-deoxyadenosine content was higher than cordycepin. The developed method is suitable for analysis of cordycepin and 2′-deoxyadenosine in Cordyceps genus.

[Key words] SPE； HPLC； cordycepin （3′-deoxyadenosine）； 2′-deoxyadenosine

冬蟲夏草是麥角菌科真菌冬蟲夏草菌Cordyceps sinensis（BerK.）Sacc.寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座和幼蟲尸體的復(fù)合體，具有補(bǔ)肺益腎，止血化痰的功效[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，冬蟲夏草具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、保護(hù)肝臟、保護(hù)腎臟、保護(hù)心血管、延緩衰老等功效[2-5]。蛹蟲草為蛹草真菌C. militaris以蟲蛹為寄主或在人工培養(yǎng)基上形成的子實(shí)體，蟲草菌絲體為中華被毛孢真菌Hirsutella sinensis通過液體發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)的菌絲體，蟬花為蟬花真菌C. sobolifera寄生于蟬類若蟲形成的菌蟲復(fù)合體[6]。

蟲草素（3′-脫氧腺苷）具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、清除自由基等多種藥理作用[7-8]，有觀點(diǎn)認(rèn)為其是冬蟲夏草的主要活性成分，也有研究認(rèn)為冬蟲夏草中蟲草素不存在或含量極微，而含有的是2′-脫氧腺苷[9-10]。蟲草素與其同分異構(gòu)體2′-脫氧腺苷結(jié)構(gòu)相近，液相分離困難，容易造成錯(cuò)誤指認(rèn)。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蟲草素在蛹蟲草中含量相對(duì)較高，但在冬蟲夏草中含量很低，定量困難，精確指認(rèn)不易[11]。因此有必要開發(fā)一種能夠有效分離蟲草素和2′-脫氧腺苷，并準(zhǔn)確定量的分析方法，對(duì)蟲草類藥材中存在的蟲草素或2′-脫氧腺苷進(jìn)行定性和定量分析。蟲草素和2′-脫氧腺苷在蟲草類藥材的含量通常較低，本研究通過固相萃取法對(duì)蟲草類藥材中的蟲草素和2′-脫氧腺苷進(jìn)行富集，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)定量分析。

固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）是色譜分析中極其重要的一種樣品前處理方法，主要目的是把痕量被測組分進(jìn)行濃縮、富集、凈化和介質(zhì)轉(zhuǎn)移（把被測組分從樣品基體中轉(zhuǎn)移到溶劑或氣體中）[12]，具有節(jié)省時(shí)間，溶劑用量少和不易乳化等優(yōu)點(diǎn)[13]。自20世紀(jì)70年代后期商品化產(chǎn)品問世以來，SPE技術(shù)發(fā)展迅速，目前已被廣泛應(yīng)用于中藥材中的微量物質(zhì)分析[14-15]。在線SPE以柱切換系統(tǒng)為核心，通過程序控制多通道切換實(shí)現(xiàn)樣品前處理與分離分析的偶聯(lián)，能夠自動(dòng)化實(shí)現(xiàn)從生物樣品前處理到數(shù)據(jù)分析的全部過程[16-17]。

本研究采用在線SPE-HPLC聯(lián)用技術(shù)建立了同時(shí)測定蟲草素和2′-脫氧腺苷的分析方法，并成功運(yùn)用于冬蟲夏草、蛹蟲草、蟲草菌絲體和蟬花的分析。

1 材料

冬蟲夏草樣本20份，蛹蟲草樣本4份，蟲草菌絲體樣本4份，蟬花樣本4份，實(shí)驗(yàn)樣本經(jīng)廣東東陽光藥業(yè)有限公司國家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)研究室錢正明博士鑒定，分別是冬蟲夏草C. sinensis、蛹蟲草C. militaris、蟲草菌絲體Hirsutella sinensis和蟬花C. sobolifera，見表1。

Agilent1260高效液相色譜儀，配有2個(gè)二元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、六通閥、VWD紫外檢測器（美國Agilent公司），KQL-100B1超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司），Votex-Genie 2渦旋儀（美國Scientific industries公司），XS205 1/10萬天平（瑞士Mettler-Toledo公司），5424離心機(jī)（德國Eppenfdorf公司）。

對(duì)照品蟲草素（上海融禾醫(yī)藥有限公司，批號(hào)150306）、2′-脫氧腺苷（百靈威科技有限公司，批號(hào)151008），純度均大于98%。甲酸（色譜純，阿拉丁公司）、磷酸（色譜純，成都科龍化工試劑廠）、甲醇（色譜純，美國spectrum公司）、超純水（美國Millipore公司）。

2 方法

2.1 色譜條件

固相萃取柱為ZORBAX SB-AQ（4.6 mm×12.5 mm，5 μm）；分析柱為ZORBAX SB-AQ（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流速為1 mL·min^-1，柱溫為40 ℃，檢測波長為260 nm；儀器安裝見圖1，首先，六通閥切換至固相萃取柱與廢液收集器聯(lián)用位置見圖1A，進(jìn)樣體積為40 μL，使待測組分質(zhì)量濃度達(dá)到檢測限，在線固相萃取流動(dòng)相為水-甲醇（91∶9），等度洗脫3 min，除去雜質(zhì)；六通閥切換至固相萃取柱、分析柱和檢測器聯(lián)用位置見圖1B，流動(dòng)相為0.1%甲酸水-甲醇，梯度洗脫3～5 min，水-甲醇（91∶9）～0.1%甲酸水-甲醇（91∶9）；5～17 min，0.1%甲酸水-甲醇（91∶9）。

2.2 對(duì)照品貯備液的配制

精密稱取蟲草素對(duì)照品20.14 mg，置于100 mL量瓶中，用超純水溶解并定容至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為201.4 mg·L^-1的蟲草素對(duì)照品溶液；精密稱取2′-脫氧腺苷對(duì)照品19.85 mg，置于100 mL量瓶中，用超純水溶解并定容至刻度，搖勻，得濃度為198.5 mg·L^-1的2′-脫氧腺苷對(duì)照品溶液；精密量取兩對(duì)照品溶液1 mL，置于100 mL量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻，得混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品粉碎成細(xì)粉，過6號(hào)篩。取2.5 g樣品粉末，精密稱定，置于100 mL量瓶中，加入超純水80 mL，密塞，放置1 h，時(shí)時(shí)振搖，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，超純水定容至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，過0.22 μm水系濾膜，即得供試品溶液。

3 結(jié)果與分析

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 專屬性試驗(yàn) 本試驗(yàn)色譜條件下的專屬性，結(jié)果見圖2，在對(duì)應(yīng)蟲草素和2′-脫氧腺苷色譜峰的保留時(shí)間處，陰性對(duì)照液的色譜圖中不存在色譜峰，冬蟲夏草、蟲草菌絲體和蟬花供試品在2′-脫氧腺苷色譜峰的保留時(shí)間處有色譜峰，蛹蟲草在蟲草素色譜峰的保留時(shí)間處有色譜峰，證明蟲草素和2′-脫氧腺苷的色譜峰沒有受到干擾，方法的專屬性符合要求。

3.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、定量限和檢測限 取混合對(duì)照品溶液，用超純水稀釋配成系列濃度梯度，按2.1項(xiàng)下色譜條件測定，記錄色譜圖。以溶液濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，用最小二乘法進(jìn)行回歸計(jì)算，求得回歸方程和相關(guān)系數(shù)。取混合對(duì)照品溶液，用超純水逐級(jí)稀釋，進(jìn)樣分析，信噪比（S/N）約為10時(shí)的相應(yīng)濃度確定最低定量限，S/N約為3時(shí)的相應(yīng)濃度確定最低檢測限，見表2。結(jié)果表明，蟲草素和2′-脫氧腺苷在相應(yīng)的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.1.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液40 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，測得蟲草素和2′-脫氧腺苷的日內(nèi)精密度（RSD）分別為0.10%和0.20%。精密吸取混合對(duì)照品溶液40 μL，每天進(jìn)樣2次，連續(xù)進(jìn)樣3 d，記錄峰面積，測得蟲草素和2′-脫氧腺苷的日間精密度（RSD）分別為0.20%，0.30%。表明該方法精密度良好。

3.1.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批冬蟲夏草（S1）藥材6份，按2.3項(xiàng)下制備供試品溶液，測定樣本中蟲草素和2′-脫氧腺苷的含量，并計(jì)算RSD。樣品中未檢測到蟲草素，2′-脫氧腺苷RSD為2.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.1.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取重復(fù)性試驗(yàn)供試品1份，分別放置0，1，2，4，8，12 h后，測定蟲草素和2′-脫氧腺苷的含量，計(jì)算RSD，樣品中未檢測到蟲草素，2′-脫氧腺苷RSD為2.9%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.1.6 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取蛹蟲草（S22）藥材6份，準(zhǔn)確加入蟲草素對(duì)照品，另精密稱取冬蟲夏草（S1）藥材6份，準(zhǔn)確加入2′-脫氧腺苷對(duì)照品。按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算蟲草素和2′-脫氧腺苷的平均回收率及RSD。蟲草素和2′-脫氧腺苷的平均回收率分別為100.6%，100.4%，RSD分別為2.9%，3.2%，結(jié)果見表3。

3.2 含量測定

取蟲草類藥材（冬蟲夏草、蛹蟲草、蟲草菌絲體和蟬花樣本），按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析檢測，見圖2，結(jié)果見表4。

4 討論

本研究采用固相萃取-高效液相色譜聯(lián)用方法同時(shí)對(duì)4種蟲草類藥材中的蟲草素和2′-脫氧腺苷進(jìn)行定量分析，為了獲得滿意的分離度、較短的分析時(shí)間、較好的靈敏度和準(zhǔn)確的含量測定結(jié)果，試驗(yàn)分別對(duì)供試品提取條件和色譜條件進(jìn)行了考察。

4.1 提取條件優(yōu)化

本試驗(yàn)分別采用超純水和80%甲醇水溶液為提取溶劑，制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件分析。結(jié)果表明，采用超純水制備的供試品溶液能夠檢測到2′-脫氧腺苷，80%甲醇水溶液制備的供試品溶液2′-脫氧腺苷色譜峰未達(dá)檢測限，可能原因是2′-脫氧腺苷的水溶性強(qiáng)于醇溶性，文獻(xiàn)報(bào)道中蟲草素具有相似的性質(zhì)[18]，因此選擇超純水作為制備供試品的提取溶劑。

取冬蟲夏草（S1），分別采用超純水超聲提取法（如2.3項(xiàng)下方法）和超純水加熱回流提取法（回流提取30 min），制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件分析。結(jié)果表明，加熱回流提取法制備供試品中2′-脫氧腺苷平均含量為0.032 mg·g^-1，與超聲提取法制備供試品中測得的2′-脫氧腺苷含量（0.034 mg·g^-1）相近，且均未檢測到蟲草素色譜峰?？紤]到操作的簡便性，確定超純水超聲提取法為供試品溶液的制備方法。

4.2 色譜條件的優(yōu)化

4.2.1 預(yù)分離條件的優(yōu)化 在前期研究基礎(chǔ)上[19]，選擇能夠耐受高比例水相的ZORBAX SB-AQ（4.6 mm ×12.5 mm，5 μm）色譜柱作為固相萃取柱。固相萃取柱后端連接紫外檢測器，分別以水-甲醇系統(tǒng)和0.1%甲酸水-甲醇系統(tǒng)為洗脫劑進(jìn)行洗脫，流速1 mL·min^-1，檢測波長260 nm。結(jié)果表明，當(dāng)以0.1%甲酸水-甲醇（91∶9）系統(tǒng)作為洗脫劑時(shí)，混合對(duì)照品保留時(shí)間小于1 min，不足以和雜質(zhì)有效分離；當(dāng)以水-甲醇（91∶9）系統(tǒng)作為洗脫劑時(shí)，混合對(duì)照品在3.5 min時(shí)被洗脫，見圖3A，而蛹蟲草供試品中雜質(zhì)在3 min內(nèi)被充分洗脫，見圖3B。因此選擇水-甲醇（91∶9）系統(tǒng)作為固相萃取柱的洗脫溶劑，沖洗3 min，使樣品中的大量雜質(zhì)不經(jīng)分析柱直接進(jìn)入廢液收集裝置，從而保護(hù)色譜柱。當(dāng)雜質(zhì)被完全洗脫時(shí)，六通閥切換至分析流路位置，見圖1B，進(jìn)行定量分析。

4.2.2 色譜分離條件的優(yōu)化 本試驗(yàn)選擇ZORBAX SB-AQ（4.6 mm ×150 mm，5 μm）色譜柱作為分析柱，分別比較了水-甲醇系統(tǒng)和0.1%甲酸水-甲醇系統(tǒng)對(duì)蟲草素和2′-脫氧腺苷的分離效果，結(jié)果顯示水-甲醇系統(tǒng)能夠?qū)οx草素和2′-脫氧腺苷實(shí)現(xiàn)分離，但出峰時(shí)間大于40 min，見圖4A；采用0.1%甲酸水-甲醇系統(tǒng)（91∶9）洗脫時(shí)，蟲草素和2′-脫氧腺苷分離效果較好（分離度為1.60），且二者在10 min實(shí)現(xiàn)基線分離，顯著減少了分析時(shí)間，見圖4B，因此選擇0.1%甲酸水-甲醇系統(tǒng)（91∶9）作為分析柱洗脫溶劑。

4.3 含量測定結(jié)果分析

本研究采用SPE-HPLC對(duì)冬蟲夏草、蛹蟲草、蟲草菌絲體和蟬花樣本中蟲草素和2′-脫氧腺苷進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明蟲草素在蛹蟲草樣品中質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高（0.799～1.893 mg·g^-1），在冬蟲夏草、蟲草菌絲體和蟬花樣品中含量均低于定量限，不能用常規(guī)紫外檢測器進(jìn)行定量。在本實(shí)驗(yàn)色譜條件下，2′-脫氧腺苷在冬蟲夏草（0.017～0.046 mg·g^-1）、蟲草菌絲體（0.041～0.052 mg·g^-1）和蟬花（0.036～0.051 mg·g^-1）中被檢出，在蛹蟲草中未見明顯色譜峰。本研究組前期報(bào)道[19]的色譜條件不能對(duì)蟲草素和2′-脫氧腺苷有效分離，可能存在共洗脫現(xiàn)象，在冬蟲夏草中檢測到的微量蟲草素，可能是把2′-脫氧腺苷色譜峰或蟲草素與2′-脫氧腺苷共洗脫色譜峰錯(cuò)誤指認(rèn)為蟲草素色譜峰。本文通過固相萃取技術(shù)對(duì)蟲草類藥材中微量的蟲草素和2′-脫氧腺苷進(jìn)行富集，并通過優(yōu)化色譜條件將二者分離，并準(zhǔn)確定量。

5 結(jié)論

本研究建立了一種同時(shí)測定蟲草類藥材中蟲草素和2′-脫氧腺苷含量的固相萃取-高效液相色譜分析方法，使得二者在15 min實(shí)現(xiàn)基線分離并準(zhǔn)確定量，極大縮短分析時(shí)間，適用于蟲草類藥材的分析。我們前期研究中所建立的分析方法不能對(duì)蟲草素和2′-脫氧腺苷有效分離而可能產(chǎn)生共洗脫現(xiàn)象，因此本文通過固相萃取和高效液相色譜聯(lián)用方法對(duì)蟲草類藥材中的蟲草素和2′-脫氧腺苷分離并定量分析。結(jié)果顯示，在本文所述檢測條件下，冬蟲夏草、蟲草菌絲體和蟬花樣品中僅檢測到2′-脫氧腺苷，蛹蟲草樣品中僅檢測到蟲草素；在冬蟲夏草樣品中未檢測到蟲草素，早期報(bào)道的在冬蟲夏草中檢測到的蟲草素色譜峰可能是其同分異構(gòu)體2′-脫氧腺苷色譜峰或以2′-脫氧腺苷為主的與蟲草素的共洗脫色譜峰。

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[責(zé)任編輯 丁廣治]