肺泡灌洗液中MicRNA表達(dá)譜分析在重癥肺炎中的應(yīng)用

王昭君，劉勤富，王曉紅，王妍柏，張 珺，周文杰，楊曉軍

·論 著·

肺泡灌洗液中MicRNA表達(dá)譜分析在重癥肺炎中的應(yīng)用

王昭君1，劉勤富1，王曉紅1，王妍柏2，張 珺1，周文杰1，楊曉軍1

目的 探討ICU中重癥肺炎患者肺泡灌洗液中微小RNA(MicRNA)表達(dá)與重癥肺炎的關(guān)系。方法 采用MicRNA芯片技術(shù)對(duì)5例重癥肺炎患者和5例非呼吸道感染術(shù)后患者的肺泡灌洗液MicRNA進(jìn)行篩選，最終篩選出其中上調(diào)表達(dá)、下調(diào)表達(dá)的MicRNA；再通過(guò)RT-PCR的方法，驗(yàn)證上述芯片檢測(cè)的結(jié)果。結(jié)果 建立重癥肺炎患者肺泡灌洗液的MicRNA異常表達(dá)譜，從中篩選出40個(gè)上調(diào)表達(dá)的MicRNA和113個(gè)下調(diào)表達(dá)的MicRNA。通過(guò)與非呼吸道感染患者對(duì)比，重癥肺炎組上調(diào)表達(dá)基因miR-3686、miR-4455及下調(diào)表達(dá)基因miR-1323、miR-127-5p差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 miR-3686、miR-4455、miR-1323、miR-127-5p在重癥肺炎患者的肺泡灌洗液中明顯表達(dá)，提示其與重癥肺炎的發(fā)生有一定的相關(guān)性。

重癥肺炎；肺泡灌洗液；MicRNA

重癥肺炎是造成重癥監(jiān)護(hù)病房患者死亡的重要原因[1-2]，雖然隨著各種新型抗菌藥物的不斷研發(fā)，同時(shí)臨床工作中的抗感染力度逐漸增強(qiáng)，重癥肺炎發(fā)病率及死亡率并無(wú)明顯下降[3]。近期有基礎(chǔ)與臨床研究表明，肺泡灌洗液中微小RNA(MicRNA)在肺部損傷機(jī)制中有重要的作用[4-5]。MicRNA 是一組廣泛存在于真核細(xì)胞生物中，長(zhǎng)度為21～25個(gè)，核苷酸內(nèi)源性單鏈非編碼RNA分子，是已知的最大基因家族中的一名成員，通過(guò)與信使RNA(mRNA)的3＇非翻譯區(qū)(UTR) 結(jié)合，可引起翻譯抑制和(或)mRNA的降解，從而抑制了蛋白質(zhì)合成，最終達(dá)到基因調(diào)控的目的[6]。有研究發(fā)現(xiàn)，MicRNA可以被釋放到細(xì)胞外環(huán)境中，在多種人體的生物標(biāo)本比如人血漿、血清、體液和各種組織中可以被檢測(cè)到，從而這也使得MicRNA成為對(duì)臨床疾病的診斷及預(yù)后有重要意義的生物學(xué)標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料：選取2015年1月-2015年12月入住寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院ICU的患者。依據(jù)美國(guó)感染疾病學(xué)會(huì)/美國(guó)胸科學(xué)會(huì)(IDSA/ATS)2007年修訂版《成人CAP處理的共識(shí)指南》[7]，其重癥肺炎的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)如下：符合1項(xiàng)主要標(biāo)準(zhǔn)或3項(xiàng)次要標(biāo)準(zhǔn)以上者。主要標(biāo)準(zhǔn)：①需要有創(chuàng)機(jī)械通氣；②感染性休克需要血管收縮劑治療。次要標(biāo)準(zhǔn)：①呼吸頻率≥30 次/min；②氧合指數(shù)(PaO2/FiO2)≤250；③多肺葉浸潤(rùn)；④意識(shí)障礙/定向障礙；⑤氮質(zhì)血癥(BUN≥20 mg/dl)；⑥白細(xì)胞減少(WBC<4.0×109/L);⑦血小板減少(<10.0×109/L)；⑧低體溫(<36 ℃)；⑨低血壓，需要強(qiáng)力的液體復(fù)蘇。非呼吸道感染組納入標(biāo)準(zhǔn)：ICU中非呼吸道感染(需要呼吸機(jī)輔助通氣)的術(shù)后患者，需排除腫瘤、自身免疫性疾病等。

1.2 方法

1.2.1 肺泡灌洗液樣本采集及運(yùn)送：利用電子纖維支氣管鏡，對(duì)入選患者肺段和亞肺段進(jìn)行鹽水灌洗后，采集肺泡表面襯液，即BALF 20 mL(避免患者經(jīng)口污染環(huán)節(jié))，分裝到2支無(wú)菌集痰管中，放入-80 ℃凍存，一份進(jìn)行基因芯片檢測(cè)及PCR驗(yàn)證，一份送我院微生物室進(jìn)行肺泡灌洗液的細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)。采集和運(yùn)送標(biāo)本的過(guò)程嚴(yán)格按照無(wú)菌操作規(guī)程進(jìn)行。

1.2.2 MicRNA測(cè)序

1.2.2.1 肺泡灌洗液中RNA的提取：使用TRIzol法提取肺泡灌洗液RNA，并用RNasey Mini Kit(QIAGEN)進(jìn)行純化。使用NanoDrop ND-1000測(cè)量純化后的RNA濃度，電泳方法檢測(cè)RNA的完整性。

1.2.2.2 肺泡灌洗液RNA的標(biāo)記與芯片雜交：肺泡灌洗液RNA標(biāo)記和雜交根據(jù)Exiqon提供的方法進(jìn)行，即抽提的肺泡灌洗液RNA通過(guò)質(zhì)檢后，使用miRCURYTM Array Power Labeling kit (Cat #208032-A,Exiqon)對(duì)microRNA進(jìn)行標(biāo)記。具體步驟如下：①1 μg RNA加水至2 μl、加1 μl的CIP buffer and CIP酶(Exiqon)，混合后置于37 ℃下30 min。② 樣品置于95 ℃下5 min終止反應(yīng)，加入3 μl labeling buffer、1.5 μl fluorescent label (Hy3TM)、2.0 μl DMSO、2.0 μl labeling enzyme，在16 ℃下反應(yīng)1 h。③ 樣品置于65 ℃下15 min終止反應(yīng)。④標(biāo)記完成以后，將樣品與miRCURYTM LNA Array (v.19.0) (Exiqon)芯片雜交，根據(jù)Exiqon的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。⑤25 μl 樣品與25 μl 雜交緩沖液混合，95 ℃下變性2 min，然后置于冰上2 min。⑥與芯片在56 ℃下雜交16～20 h，雜交系統(tǒng)為Nimblegen Systems,Inc.,Madison,WI,USA。雜交完成以后，使用Wash buffer kit (Exiqon)清洗芯片，使用Axon GenePix 4000B芯片掃描儀進(jìn)行掃描。

2 結(jié)果

2.1 重癥肺炎患者肺泡灌洗液MicRNA異常表達(dá)譜的篩選：通過(guò)Fold change和P-value 2項(xiàng)指標(biāo)篩選2組間的差異表達(dá)MicRNA譜(圖1，目錄后)，具體篩選條件為Fold change>1.5倍變化且P<0.05。最終本實(shí)驗(yàn)篩選出40個(gè)上調(diào)表達(dá)的MicRNA和113個(gè)下調(diào)表達(dá)的MicRNA。

2.2 重癥肺炎與非肺部MicRNA差異表達(dá)結(jié)果的比較：對(duì)5例重癥肺炎和5例非肺部感染患者的肺泡灌洗液進(jìn)行MicRNA基因芯片檢測(cè)，用qRT-PCR技術(shù)，以驗(yàn)證芯片技術(shù)的結(jié)果。對(duì)其中miR-208b-3p、miR-1323、miR-4455、miR-4764-3p、miR-483-3p、miR-3686、miR-3124-3p、miR-127-5p采用定量PCR驗(yàn)證，內(nèi)參選用U6。與非呼吸道感染患者相比，結(jié)果分析表明上調(diào)基因miR-3686、miR-4455及下調(diào)基因miR-127-5p、miR-1323的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2-圖3，目錄后)，miR-208b-3p、miR-4764-3p、miR-483-3p、miR-3124-3p的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1-表2。

表1 上調(diào)表達(dá)MicRNA的對(duì)比分析

表2 下調(diào)表達(dá)MicRNA的對(duì)比分析

3 討論

重癥肺炎在重癥監(jiān)護(hù)室中具有高發(fā)病率、高死亡率的特點(diǎn)，特別是受到耐藥細(xì)菌感染的患者。目前，大部分研究集中在細(xì)菌耐藥機(jī)制方面，而對(duì)于感染后肺部損傷發(fā)病機(jī)制依然尚不清楚?，F(xiàn)有研究認(rèn)為，炎性細(xì)胞因子與局部微生態(tài)環(huán)境以及炎癥免疫反應(yīng)失衡，導(dǎo)致宿主呼吸道與全身免疫防御系統(tǒng)損害，從而加重肺部的損傷[8]。但是，針對(duì)上述有關(guān)炎癥因子損傷給予相應(yīng)的治療后，并未改善預(yù)后，因而在感染患者基因水平變化方面引起了眾多研究者的關(guān)注。隨著第二代MicRNA測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用，快速預(yù)測(cè)已知的MicRNA和新的可能的MicRNA，已經(jīng)成為研究感染性疾病發(fā)病機(jī)制的強(qiáng)有力工具[8-9]。

有關(guān)MicRNA在肺內(nèi)炎癥反應(yīng)中的作用同樣也受到很多研究者的關(guān)注，MicRNA可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄后水平下調(diào)炎性因子和炎性因子信號(hào)通路的受體來(lái)調(diào)控失衡的炎癥反應(yīng)，在炎癥反應(yīng)中起了重要的調(diào)控作用[8-9]，這也使得MicRNA 成為了對(duì)臨床疾病診斷及預(yù)后有重要意義的生物標(biāo)志物和多種疾病的治療靶點(diǎn)[10-11]。Aganov 等[12]研究了病原體源性物質(zhì)脂多糖刺激人單核系后 MicRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌內(nèi)毒素的刺激可以引起巨噬細(xì)胞中 miR132、miR146a、miR155 表達(dá)水平增加，細(xì)菌成分及TLR2 、TLR4、TLR5的配體可以明顯刺激 miR146 的表達(dá)上調(diào)。而 miR146 通過(guò)調(diào)節(jié)TLR/IL1β信號(hào)通路 TRAF6及IRAK1 減少炎癥因子的釋放，對(duì)防止過(guò)度炎癥有重要作用[13]。此外，鼠巨噬細(xì)胞經(jīng)脂多糖刺激后 miR125 表達(dá)水平降低[14]。Rodriguez 等[15]研究了miR155在小鼠肺部炎癥中的作用，提示缺乏 miR155 的小鼠肺支氣管肺泡中白細(xì)胞數(shù)量增加，這證明了miR155在肺部炎癥反應(yīng)方面的重要作用。本研究通過(guò)生物芯片技術(shù)對(duì)重癥肺炎患者肺泡灌洗液進(jìn)行了MicRNA表達(dá)譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重癥肺炎患者M(jìn)icRNA的表達(dá)譜與非呼吸道感染患者是有差異的，在眾多差異表達(dá)MicRNA中，miR-3686、miR-4455表達(dá)上調(diào)，miR-127-5p、miR-1323表達(dá)下調(diào)；這與以往的研究發(fā)現(xiàn)不同[16-20]，可能與留取的標(biāo)本來(lái)源不同有關(guān)。本組樣本均來(lái)源于肺泡灌洗液，其對(duì)肺損傷的機(jī)制可能有一定的研究?jī)r(jià)值，其可能參與了重癥肺炎肺損傷的調(diào)控，但如何調(diào)控還需要后續(xù)進(jìn)一步的研究。

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Differential expressions of MicRNAs in bronchoalveolar lavage fluid of patients with severe
pneumonia and the function of MicRNA in severe pneumonia

WANGZhaojun1，LIUQinfu1，WANGXiaohong1，WANGYanbo2，ZHANGJun1，ZHOUWenjie1，YANGXiaojun1
1.IntensiveCareUnit，GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity，Yinchuan750004，China；2.DepartmentofCerebrospinalFluidResearch，GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China

YANGXiaojun，Email:yxjicu@163.com

Objective To observe the expressions of MicRNA in bronchoalveolar lavage fluid of patients with severe pneumonia in Intensive Care Unit (ICU).Methods The differential expressions of MicRNA in BALF of patients with SP (n=5) and non-SP patients (5 cases who needed mechanical ventilation after surgery) were screened by MicRNA chip technique.Screen out the MicRNA which were up-regulated and down-regulated and the results were verified by RT-PCR chip.Results Abnormal expression spectrum of MicRNA in severe pneumonia patients was initially built，in which 40 MicRNA were up-regulated and 113 MicRNA were down-regulated.Compared with non-SP patients，the expressions of miR-3686，miR-4455，miR-1323 and miR-127-5p were significant difference in SP patients than those in non-SP patients (P<0.05).Conclusion The expressions of miR-3686，miR-4455，miR-1323 and miR-127-5p are significant difference in BALF of patients with severe pneumonia，which may relate to pulmonary injury.

Severepneumonia；Bronchoalveolarlavagefluid；MicRNA

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81450031)；寧夏自然科學(xué)基金項(xiàng)目(NZ14142)

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，寧夏 銀川 750004 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腦脊液研究室，寧夏 銀川 750004

王昭君(1987-)，女，山西籍，碩士學(xué)位，治醫(yī)醫(yī)師，主要從事重癥醫(yī)學(xué)研究方向。

楊曉軍，Email：yxjicu@163.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170508.1147.004.html

10.13621/j.1001-5949.2017.05.0392

R373

A

2016-09-13 [責(zé)任編輯]李 潔