囊盤菌(Ascocoryne)揮發(fā)性氣體成分多樣性及其產(chǎn)烴分析

高 茜，嚴(yán)東輝*，王凱英，李鴻昌，任 菲

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，北京 100091； 2. 中國林業(yè)科學(xué)研究院華北林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，北京 102300)

囊盤菌(Ascocoryne)揮發(fā)性氣體成分多樣性及其產(chǎn)烴分析

高 茜1，嚴(yán)東輝1*，王凱英1，李鴻昌1，任 菲2

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，北京 100091； 2. 中國林業(yè)科學(xué)研究院華北林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，北京 102300)

[目的]內(nèi)生真菌紫膠囊盤菌(菌株NRRL 50072)首次被發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生石化燃料類似成分的揮發(fā)性有機(jī)代謝產(chǎn)物，這為生物質(zhì)能源的發(fā)展開辟了新的途徑，但囊盤菌屬的真菌是否都具有該類代謝屬性需要進(jìn)一步明確。[方法]通過組織表面消毒分離囊盤菌不同菌株，經(jīng)最大似然法構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹明確親緣關(guān)系，利用頂空固相微萃取方法結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(HSSPEM-GC-MS)，進(jìn)行揮發(fā)性成分測定和分析。[結(jié)果]不同囊盤菌菌株均能產(chǎn)生揮發(fā)性烴、醇、酯、醛、酮和酸等代謝產(chǎn)物，但產(chǎn)物存在高度的多樣性，即使近緣的菌株之間其揮發(fā)性產(chǎn)物也存在很大差異。[結(jié)論]囊盤菌屬真菌可能普遍具有產(chǎn)揮發(fā)性烴類的能力，但其代謝產(chǎn)物種類具有菌株?；?。因此，發(fā)現(xiàn)或遺傳工程創(chuàng)造目標(biāo)新菌株資源是深入研究和開發(fā)利用囊盤菌真菌生物柴油的重要基礎(chǔ)。

Ascocoryne；揮發(fā)性氣體；SPEM-GC-MS；生物質(zhì)能；烴類化合物

由于石化燃料終將耗盡,尋求可更新的替代能源資源日趨重要，生物質(zhì)能是極具發(fā)展?jié)摿Φ目商娲茉粗唬绕涫遣粻幐?、能利用農(nóng)林廢棄物木質(zhì)纖維進(jìn)行能源轉(zhuǎn)化的生物質(zhì)資源受到重視[1]。真菌作為地球上最主要的木質(zhì)纖維分解者，不僅成為醇基燃料生物質(zhì)能轉(zhuǎn)化過程中木質(zhì)纖維素酶的重要來源；而且最近研究還發(fā)現(xiàn)，一些植物內(nèi)生真菌在分解利用木質(zhì)纖維的同時，能直接產(chǎn)生類似柴油、汽油和航空用油的成分[1-2]。由于內(nèi)生真菌通常是植物死亡或近于死亡時的第一批分解者[3]，這使得內(nèi)生真菌不僅可以作為提供木質(zhì)纖維素分解酶的來源[4]，也為探索直接利用內(nèi)生真菌分解農(nóng)林廢棄物產(chǎn)生所需燃料奠定了基礎(chǔ)，使之成為可更新和兼容現(xiàn)存引擎基礎(chǔ)設(shè)施的生物質(zhì)能新燃油資源[2]。

目前已發(fā)現(xiàn)多種內(nèi)生真菌能產(chǎn)生類似汽油或柴油的揮發(fā)性成分，如來自Ascocoryne、Muscodor、Hypoxylon等屬的內(nèi)生真菌、以及內(nèi)生菌Nodulisporiumsp.、Phomasp.和Phomopsissp.中的菌株其揮發(fā)性產(chǎn)物中存在烷烴、烯烴、烷基酯、苯衍生物，萜類化合物、多環(huán)芳烴等[2]。其中AscocornyesarcoidesNRRL 50072 由Strobel等在巴塔哥尼亞(Patagonia)的植物Eucryphiacordifolia上分離獲得，并能在木質(zhì)纖維基質(zhì)上產(chǎn)生酸、醇及烷烴的酯類和酮類衍生物[5,6]。該菌最先通過形態(tài)鑒定為Clonostachysrosea(=Gliocladiumroseum)[5]，后經(jīng)分子鑒定，結(jié)合對比參考菌株AscocorynesarcoidesAV-70培養(yǎng)性狀， 更正為Ascocorynesarcoides[7]。該屬真菌屬子囊菌，子實(shí)體常發(fā)現(xiàn)在秋季闊葉林針葉林潮濕環(huán)境中的枯木中產(chǎn)生，但其菌絲在健康樹木組織內(nèi)長期行內(nèi)共生生活，具內(nèi)生真菌屬性，至樹木死亡才在枯木上開始形成子實(shí)體[8]，我國記錄有兩個種，分別為A.sarcoides和A.cylichnium， 其中A.sarcoides是世界廣布性種。該菌菌株(A.sarcoidesRRL 50072) 產(chǎn)生相對豐富的揮發(fā)性烴類，可能與其進(jìn)化有關(guān)；在其基因組上發(fā)現(xiàn)有80多個可能與該生物代謝合成相關(guān)基因簇的存在[9]。并且發(fā)現(xiàn)生長階段，pH、溫度和培養(yǎng)基質(zhì)組成等因素對該菌產(chǎn)生烴類型有顯著的影響[10]。但迄今我們并不清楚產(chǎn)烴代謝途徑只是該菌株的個體遺傳行為，還是該屬同種或近似種共有的群體屬性。因此，我們利用頂空固相微萃取技術(shù)結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用分析儀方法，對來自囊盤菌的不同菌株揮發(fā)性產(chǎn)物進(jìn)行了研究分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)相同環(huán)境背景下，不同菌株所產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝成分具有多樣性。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

供試Ascocoryne屬菌株6株，編號分別為FPYF3013-FPYF3018。其中FPYF3013-FPYF3016采集分離于國內(nèi)海南尖峰嶺和北京霧靈山地區(qū)山毛櫸科樹木上。FPYF3017和FPYF3018購自德國DSMZ菌庫(保藏號分別為DSM4844、DSM4705)。上述6株菌株均保存在中國林科院森林病理室。

1.2 菌株鑒定

培養(yǎng)性狀觀察： 預(yù)先在PDA上培養(yǎng)7 d的菌落作為接種材料。用打孔器在菌落邊緣取直徑約0.5 cm圓片轉(zhuǎn)接入PDA和MEA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)皿直徑為8 cm，23℃培養(yǎng)，隔天觀察記錄菌落生長直徑和培養(yǎng)形狀，至滿皿為止。

分子鑒定： 菌株基因組DNA提取參考植物CTAB法[11]。 用于系統(tǒng)發(fā)育分析的分子標(biāo)記序列為ITS，所用擴(kuò)增引物為真菌通用引物ITS1和ITS4[11]。擴(kuò)增反應(yīng)及程序參考Amar等的方法[11]。擴(kuò)增產(chǎn)物測序由博邁德生物技術(shù)有限公司完成。序列讀取和序列拼接均用Bioedit0.7進(jìn)行。完整ITS序列遞交NCBI獲取序列號。

系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建：參與構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的Ascocoryne參考菌株ITS序列來自NCBI,其序列登錄號見表1，參考菌株的來源地點(diǎn)等背景材料可通過NCBI網(wǎng)站登錄了解。截止到2016年8月，在NCBI中有Ascocoryne的ITS序列錄入數(shù)共52條，其中只有3個明確種，分別是A.sarcoides、A.cylichnium和A.solitaria；其余為不確定種記錄。序列利用MAFFT在線(http://mafft.cbrc.jp/alignment/software/)進(jìn)行聯(lián)配比對，通過MrModel3.0獲得建樹模型(GTR)及其參數(shù)，運(yùn)用PhyML3.1構(gòu)建ML系統(tǒng)發(fā)育樹，自檢值設(shè)定為1000。

1.3 菌株產(chǎn)揮發(fā)性成分分析

1.3.1 頂空固相微萃取(HS-SPME) 將菌種接種到PDA培養(yǎng)基上，每個菌株重復(fù)3次；放置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18天，取出備用。萃取頭老化(氣相法)溫度分別為柱溫150℃，后進(jìn)樣口 溫度250℃，前檢測器 200℃，老化時間15 min。萃取過程：手動操作萃取。用0.6 mm電鉆在培養(yǎng)皿的側(cè)面穿孔，插入萃取針(50/30 μm DVB/CAR/PDMS，SUPELCO)，推出萃取纖維，萃取時間40 min。

表1 參與建樹的參考菌株NCBI登錄號

1.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析(GC-MS) 氣相色譜條件HP-5MS型毛細(xì)管柱(涂層：(5%苯基)-甲基聚硅氧烷,30.0 m×0.25 mm,涂層厚度：0.25 μm)；升溫程序如下：初始溫度33℃，保留2 min；以7℃·min-1的速度升溫至220℃，保留7 min；載氣為氮?dú)?，流速?9 mL·min-1。

質(zhì)譜條件：EI電離源，電子能量70 eV，離子源溫度150℃，質(zhì)譜掃描速率為：5.000 0 scans·s-1。質(zhì)譜范圍41～560 amu(m·z-1)。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理 產(chǎn)物成分鑒定由質(zhì)譜儀中NIST 數(shù)據(jù)庫匹配求得，統(tǒng)計匹配度大于80(最大值為100)的鑒定結(jié)果才予以報道。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株及與A.sarcoidesNRRL 50072菌株間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

供試6菌株的ITS序列同源性搜索結(jié)果顯示，這些菌株各自的最高同源性菌株均來自Ascocoryne。同源性參數(shù)覆蓋率(cover)、E值、一致性(identity)中，除FPYF3014和FPYF3015與各自最高同源Ascocoryne參考菌株的覆蓋率為99%外，其余菌株與各自最高同源參考菌株覆蓋率達(dá)100%；E值和一致性上，所有菌株均分別為0和100%。因此，這些菌株鑒定為Ascocoryne屬的真菌，且依據(jù)最高同源參考菌株，F(xiàn)PYF3013、FPYF3014及FPYF3018可能為A.sarcoides；FPYF3015可能為A.cylichnium； FPYF3016和FPYF3017則可能是A.solitaria。 這結(jié)果與用另一分子標(biāo)記基因ACTIN序列搜索的結(jié)果一致(數(shù)據(jù)未列出)。來自這些菌株的ITS序列已獲得NCBI編號，依FPYF3013-FPYF3018次序分別為KX976479-KX976484。

圖1 基于ITS序列的囊盤菌屬真菌ML系統(tǒng)發(fā)育樹。Fig.1 Phylogenetic analysis on the Ascocoryne strains based on ITS sequences by ML method

依據(jù)ITS序列建立的最大似然法的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)可見，F(xiàn)PYF3013、FPYF3014和FPYF3018與A.sarcoides的菌株聚在一起，聚類支持率68%； FPYF3014和FPYF3018同A.sarcoidesNRRL50072的親緣關(guān)系得到更高的87%支持率。FPYF3015與A. cylichnium的親緣關(guān)系也有近于70%的支持率。而FPYF3016和FPYF3017則散成單系(singleton)，與作為參考的來自Ascocoryne所有菌株無聚類關(guān)系?？梢钥隙ǖ卣J(rèn)為這兩菌株遠(yuǎn)離A.cylichnium和A.sarcoides，而與A.solitaria存在可能的親緣關(guān)系。這與在NCBI中進(jìn)行BLASTn的結(jié)果基本一致。

2.2 菌株生長差異

菌株在PDA和MEA培養(yǎng)基的培養(yǎng)性狀表明，除FPYF3015外，其余5株菌株均向培養(yǎng)基中滲透紫色色素且程度不等，而FPYF3015的菌落不具有該滲透特點(diǎn)。向培養(yǎng)基質(zhì)中分泌滲透性紫色色素是該屬Ascocornye的典型培養(yǎng)性狀之一。6株菌株的生長情況在PDA和MEA上表現(xiàn)有差異(圖2，3)。在PDA上(圖2)，6株菌株菌落的生長速度，F(xiàn)PYF3018最快，F(xiàn)PYF3016最慢，二者菌落擴(kuò)展至滿皿(直徑8cm)的日期相差8天。期間生長速率快慢菌株依次為FPYF3013、3017、3015和3014；并且FPYF3013兩周后生長變緩，菌落直徑上分別被FPYF3017和FPYF3015超過。FPYF3014在試驗(yàn)?zāi)┢?，擴(kuò)增速度出現(xiàn)下降。在MEA培養(yǎng)基上(圖3)，菌株之間的生長情況有些變化，F(xiàn)PYF3018菌落擴(kuò)展速度依舊是最快的，而最慢的菌株是FPYF3015，二者滿皿生長相差10天。其它菌株菌落的擴(kuò)展速度從快到慢依次是FPYF3014、FPYF3013、FPYF3017和FPYF3016。FPYF3013在生長近兩周時，生長速率同PDA中的生長表現(xiàn)出現(xiàn)些微下降，而與FPYF3017相近(圖2)?？傮w上，6菌株在MEA培養(yǎng)基上比在PDA培養(yǎng)基上生長快，依不同菌株菌落擴(kuò)展至滿皿而言，可以有4～10天的生長時間差異，如FPYF3018在PDA和MEA長滿培養(yǎng)皿需要天數(shù)分別是12天(圖1)和16天(圖2)，而FPYF3014則相差10天，這說明不同營養(yǎng)對菌株生長有很大影響。

圖2 囊盤菌6菌株在PDA培養(yǎng)基中25℃條件下的生長速率Fig.2 Growth rates of Ascocoryne fungi in PDA at 25℃

圖3 囊盤菌6菌株在MEA培養(yǎng)基中25℃條件下的生長速率Fig.3 Growth rates of Ascocoryne fungi in MEA at 25℃

2.3 菌株揮發(fā)性成分分析

供試6個菌株在PDA培養(yǎng)基中產(chǎn)出80%以上匹配度的揮發(fā)性成分較多。按烴、醇、酯、醛、酮和酸等大類及具體化合物，分別總結(jié)于表2及表3。從中可見，菌株FPYF3016僅檢測出3類5種揮發(fā)物， FPYF3013-3015菌株能產(chǎn)出5～6類中的10～20種化合物；FPYF3017和FPYF3018檢測出6～7類的30種化合物。其中，F(xiàn)PYF3013和FPYF3015的烴類成分是優(yōu)勢化合物，占各自總成分的55.6%(10/18) 和62.3%(9/14)；FPYF3014、FPYF3017和FPYF3018則是醇類成分占優(yōu)勢，可分別占有各自總成分的41.2%、33.3%(10/30)和40.0%(12/30)；所有菌株都產(chǎn)少量的酯、酮和酸等成分，而醛類僅有FPYF3013產(chǎn)生，且只有1種化合物(表2)。具體成分上(表3)，6株菌株均能產(chǎn)生3-甲基-1-丁醇；除FPYF3017外的5株菌株能產(chǎn)2-甲基-1-丙醇；除FPYF3015外的5株菌株能產(chǎn)乙醇。烷烴類產(chǎn)物上，兩株菌株FPYF3016和FPYF3017未檢出烷烴成分；FPYF3013、3034、3015及FPFY3018菌株共產(chǎn)烷烴12種。這些烷烴產(chǎn)物中，直鏈烷是1個十六烷由FPYF3013產(chǎn)出、1個二十七烷由FPYF3015產(chǎn)生，其余10種全是支鏈烷。這些支鏈烷中，分子量最低的是含兩甲基支鏈共5個C的丙烷，由FPYF3013產(chǎn)生；最高的是含1個甲基支鏈的十六烷，由FPYF3015產(chǎn)生。支鏈庚烷有兩個，分別由FPYF3014和FPYF3018產(chǎn)生；支鏈葵烷有三個，分別由FPYF3014、FPYF3015和FPYF3018產(chǎn)生；十一支烷兩個，分別由FPYF3013和FPYF3018產(chǎn)生；十六支烷一個，由FPYF3015產(chǎn)生。菌株之間沒有相同的烷烴產(chǎn)物。產(chǎn)烯烴情況是，菌株FPYF3016未檢測到烯烴，菌株FPYF3018只檢測到一種烯烴δ-塞林烯，菌株FPYF3014有3種烯烴，分別是α-Muurol烯、環(huán)己烯和萘，其余三株菌株能產(chǎn)5-6種烯烴，這些烯烴主要為C15H24的不飽和烴。

表2 囊盤菌6菌株揮發(fā)性產(chǎn)物歸類統(tǒng)計

表3 囊盤菌6菌株揮發(fā)性產(chǎn)物

續(xù)表3

編號number化合物(英文)compounds分子式molecularformula化合物(中文)compoundsAscocoryne菌株Ascocorynestrains131415161718391H-Cycloprop[e]azulene,1a,2,3,4,4a,5,6,7b-octahydro-1,1,4,7-tetramethyl-,[1aR-(1aα,4α,4aβ,7bα)]-C15H241H-環(huán)丙并[e]薁,1A,2,3,4,4a,5,6,7b八氫1,1,4,7四甲基-[1aR-(1aα,4α,4aβ,7bα)]-√-----40δ-SelineneC15H24δ-塞林烯----√√412-DecanolC10H22O2癸醇-√--√√42BenzaldehydeC7H6O苯甲醛√----√431H-Cycloprop[e]azulene,1a,2,3,4,4a,5,6,7b-octahydro-1,1,4,7-tetramethyl-,[1aR-(1aα,4α,4aβ,7bα)]-C15H241H-環(huán)丙并[e]薁,1A,2,3,4,4a,5,6,7b八氫1,1,4,7四甲基-[1aR-(1aα,4α,4aβ,7bα)]---√-√-44Propanoicacid,2-methylC4H8O2丙酸,2-甲基√-----451-Octanol,2-methylC9H20O1-辛醇,2-甲基----√-461S,2S,5R-1,4,4-Trimethyltricyclo[6.3.1.0(2,5)]dodec-8(9)-eneC15H241S,2S,5R-1,4,4-三甲基三環(huán)[6.3.1.0(2,5)]十二碳-8-(9)-烯√-----472-Isopropenyl-4a,8-dimethyl-1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahydronaphtha-leneC15H242-異丙烯基-4a,8-二甲橋-1,2,3,4,4a,5,6,8a八氫萘--√---48β-HumuleneC15H24β-律草烯√-----49AromandendreneC15H24香橙烯----√-50α-MuuroleneC15H24α-Muurol烯-√--√-512-DodecanoneC12H24O二十二烷酮-----√52Aceticacid,decylesterC12H24O2乙酸,癸酯-----√53β-GuaieneC15H24β-乖烯----√-54Butanoicacid,3-methylC5H10O2丁酸,3-甲基-----√55Hexanoicacid,2-methyl-C7H14O2己酸,2-甲基√-----56Naphthalene,1,2,4a,5,6,8a-hexahydro-4,7-dimethyl-1-(1-meth-ylethyl)-C15H24萘,1,2,4a,5,6,8a-六氫-4,7-二甲基-1-(1-甲基乙基)-√--√-571-Undecanol,acetateC13H26O21十一醇,醋酸----√-58cis-(-)-2,4a,5,6,9a-Hexahydro-3,5,5,9-tetramethyl(1H)benzo-cyclohepteneC15H24順-(-)-2,4a,5,6,9a六氫3,5,5,9四甲基(1H)-苯并環(huán)庚烯----√-593-Cyclohexene-1-methanol,α,α,4-trimethyl-,acetateC12H20O23-環(huán)己烯-1-甲醇,α,α,4-三甲基,乙√-----60α-IononeC13H20Oα-紫羅蘭酮√-----61Cyclohexene,3-methyl-6-(1-methyle-thylidene)-C10H16環(huán)己烯,3-甲基-6-(1-甲基亞乙基)√√----621-DecanolC10H22O1-癸醇-----√63AzuleneC10H8薁--√---64Cyclodecane,methyl-C11H22癸烷,甲基----√-65Formicacid,undecylesterC12H24O2甲酸,十一烷基酯----√-663,6-Octadien-1-ol,3,7-dimethyl-,(Z)-C10H18O3,6-辛二烯-1-醇,3,7-二甲基-,(Z)---√---67n-Tridecan-1-olC13H28O正十三烷-1-醇-----√68BenzylalcoholC7H8O苯甲醇-√----691H-Indene,1-ethylidene-C11H10-1H-茚,1-亞乙基--√---70Naphthalene,1-methyl-C11H10萘,1-甲基--√---71(Z)6-Pentadecen-1-olC15H30OZ-6-十五碳烯-1-醇-----√72PhenylethylAlcoholC8H10O苯乙醇-√--√√731-HexadecanolC16H34O1-十六烷醇-----√741,3a-Ethano(1H)inden-4-ol,octa-hydro-2,2,4,7a-tetramethyl-C15H26O1,3A-Ethano(1H)茚-4-醇,八氫2,2,4,7a四甲基----√-75CyclotetradecaneC14H28環(huán)四癸烷-----√76Phenol,2,4-bis(1,1-dimethyleth-yl)-C14H22O苯酚,2,4-雙(1,1-二甲基乙基)------√77MethylhinokiateC16H24O2甲基hinokiate----√-78Nootkaton-11,12-epoxideC15H22O2香柏酮基-11,12-環(huán)氧----√-

續(xù)表3

編號number化合物(英文)compounds分子式molecularformula化合物(中文)compoundsAscocoryne菌株Ascocorynestrains131415161718792-Naphthalenemethanol,1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahydro-α,α,4a,8-tetramethyl-,[2R-(2α,4aα,8aβ)]-C15H26O2-萘甲醇,-1,2,3,5,6,8a八氫-α,α,4α,8-四甲基-,〔2R-(2α,4aα,8αβ)〕----√-802,4,7,14-Tetramethyl-4-vinyl-tri-cyclo[5.4.3.0(1,8)]tetrade-can-6-olC20H34O2,4,7,14四甲基-4-乙烯基-三環(huán)[5.4.3.0(1,8)]四癸-6-醇----√-

3 討論

囊盤菌屬屬于子囊菌門Ascomycota、柔膜菌目Helotiales、柔膜菌科Helotiaceae，目前在真菌庫(Mycobank，http://www.mycobank.org)列有9種、在全球生物物種名錄(http://www.catalogueoflife.org/)中登記有已知種8種、真菌索引(Index Fungorum，http://www.indexfungorum.org/)中收錄6種。在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中，僅有A.sarcoides、A.cylichnium和A.solitaria這3個種菌株的ITS參考序列，其它種的分子系統(tǒng)發(fā)育分子標(biāo)記核酸序列缺乏，這說明目前該屬真菌認(rèn)識較穩(wěn)定和清楚的只有這3個種的菌株。并且,該屬真菌因?yàn)槠渖鷳B(tài)功能和重要性不被了解和重視，其種類鑒定主要還是依據(jù)形態(tài)特征，缺乏基于核酸序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的認(rèn)識，這種情況常造成菌株在分類地位上不一致。本文用于建系統(tǒng)發(fā)育樹的參考菌株A.cylichnium沒有共聚一個分支的原因，很大程度上與此相關(guān)(圖1)，菌株FPYF3014歸屬種類則主要參考BLASTn結(jié)果中的最高同源性菌株。該屬真菌基于核酸序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系亟待建立。本研究供試的6個菌株涉及該3個種，并且A.sarcoides和A.solitaria各含2個菌株，因此，本研究的結(jié)果對該屬真菌可以具有一定的代表性。我們的研究結(jié)果還顯示，F(xiàn)PYF3013和FPYF3018與已知產(chǎn)烴的A.sarcoidesNRRL 50072菌株親緣關(guān)系高度同源。NRRL 50072菌株是以A.sarcodiesAV-10為參考菌株，從Gliocladiumroseum[5]訂正為A.sarcoides的[7]。本文Ascocoryne屬系統(tǒng)發(fā)育樹中這2株菌株與FPYF3013和FPYF3018菌株，以87%高可信度聚類在同一簇上(圖1)。這結(jié)果支持了菌株AV-10和NRRL 50072之間的這一關(guān)系[7]。同時，由于NRRL 50072的產(chǎn)烴性能，使得同一聚類組中的其他10多個菌株的產(chǎn)烴情況理應(yīng)也受到關(guān)注研究。本文的結(jié)果還表明了所供試的3個種的6個菌株之間，在ITS序列、系統(tǒng)發(fā)育和培養(yǎng)性狀都有明顯的差異(圖1-3)；在生長速度上，不僅種間菌株，種內(nèi)菌株之間也有差異。因此，6個菌株在遺傳背景上是存在差異的。

囊盤菌菌株A.sarcoidesNRRL 50072在PDA培養(yǎng)基上，能產(chǎn)生烴類物質(zhì)2,6-二甲基十一烷(undecane, 2,6-dimethyl)、3,3,5-三甲基葵烷(decane, 3,3,5-trimethyl)、4-甲基環(huán)己烷(cyclohexene,4-methyl)、3,3,6-三甲基葵烷(decane,3,3,6-trimethyl)和4,4-二甲基十一烷(undecane, 4,4-dimethyl)等庚烷、辛烷、苯、和一些支鏈烴揮發(fā)性代謝產(chǎn)物[5]，這些產(chǎn)物中含有不少與現(xiàn)有石化柴油或汽油燃料相同的烴類成分，因此，該菌的揮發(fā)性化合物被稱為“微生物柴油”(mycodisele)[2]。雖然之后在其他屬的內(nèi)生真菌發(fā)現(xiàn)有產(chǎn)類似石化燃料成分的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物[2]，但在Ascocoryne屬真菌的其它菌株上還未見有產(chǎn)該類代謝產(chǎn)物的后續(xù)報道。我們的研究結(jié)果顯示(表2、3)，分別來自A.sarcoides和A.cylichnium的3個菌株中，每株能產(chǎn)生3種以上的烷烴，而來自A.solitaria的2個菌株未見烷烴產(chǎn)物；能產(chǎn)3種以上烯烴成分的菌株有5株，這5株菌株包括來自不產(chǎn)烷烴的A.solitaria1株?？梢婋m然本屬真菌產(chǎn)揮發(fā)烴類物質(zhì)可能是個常規(guī)屬性，至少對來自A.sarcoides和A.cylichnium的菌株而言是如此，但最終的烴產(chǎn)物之間是會存在差別的。結(jié)果中(表3)表明，僅有一種產(chǎn)物2,6,11-三甲基十二烷(產(chǎn)物編號19)在3個菌株的VOC中存在。菌株FPYF3013和FPYF3018所產(chǎn)生的揮發(fā)性烴類(表3中產(chǎn)物編號12、19、20、24和6、15、19)與近緣的A.sarcoidesNRRL 50072相比較[5]，也無相同之處，這顯示出該屬真菌多樣性成員之間的烴產(chǎn)物上也存在多樣性，而這是否是各自的產(chǎn)烴代謝調(diào)控過程或途徑具有多樣性？是個值得進(jìn)一步揭示的問題，也可能與菌株間發(fā)生有不同程度的烴代謝進(jìn)化有關(guān)。A.sarcoidesNRRL 50072 基因組與烴類代謝相關(guān)的基因簇可高達(dá)80個，該菌株能產(chǎn)10多種烷烴類[9 ]。與NRRI 50072菌株產(chǎn)豐富的烴類物質(zhì)比較，本文研究的6個菌株產(chǎn)有限種類的烴產(chǎn)物，這除了上面分析的遺傳進(jìn)化和基因表達(dá)不同外，也與培養(yǎng)條件密切相關(guān)[10]。最后，該屬真菌成員在揮發(fā)性醇類的代謝上較之烴類的代謝更表現(xiàn)有保守性(表3)，尤其在低級醇如乙醇、丙醇和丁醇上。6株菌株均產(chǎn)3-甲基-1-丁醇(產(chǎn)物編號17，表3)，該產(chǎn)物幾乎在每次的測定中均顯著而穩(wěn)定地被檢測出；該產(chǎn)物也始終伴隨在A.sarcoidesNRRL 50072的揮發(fā)性代謝物中[5，10]，說明3-甲基-1-丁醇可能是該屬真菌揮發(fā)性有機(jī)化合物的特征成分。

4 結(jié)論

通過研究在遺傳和代謝上具有多樣性的囊盤菌株所產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)化合物的組成，得出囊盤菌可能普遍具有產(chǎn)揮發(fā)性烴類的能力，但其產(chǎn)物種類具有菌株?；?。該發(fā)現(xiàn)為研究產(chǎn)揮發(fā)性烴類物質(zhì)的真菌代謝途徑提供了參考，也為發(fā)現(xiàn)或通過遺傳工程創(chuàng)造符合目標(biāo)的新菌株，進(jìn)而利用該屬真菌或其他真菌來發(fā)展生物燃料奠定了基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯：崔 貝)

Metabolites Diversity and Hydrocarbons Analysis on Volatile Organic Compounds Produced byAscocoryneStrains

GAO Qian1, YAN Dong-hui1, WANG Kai-ying1, LI Hong-chang1, REN Fei2

(1. Research Institute of Forest Ecology, Environment and Protection, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China; 2. Forestry Experiment Center of North China, Chinese Academy of Forestry, Beijing 102300, China)

[Objective] Endophytic fungusAscocorynesarcoides NRRL 50072 was firstly found to be able to produce volatile compounds similar to those in fossil fuels. This could be a new avenue to biofuel development. The purpose of this study is to clarify whether the other strains from the same species or related species inAscocorynehave similar metabolisms to produce biofuel compounds. [Method] Different strains fromAscocorynewere isolated with tissue-surface sterilization. The evolutionary relationship between the strains in the genus was determined through constituting a ML phylogenetic tree. The compounds in volatile gas from the strains were analyzed and identified in NIST database with HSSPEM-GC-MS. [Result] All the strains studied were able to produce volatile metabolites containing hydrocarbons, alcohols, esters, aldehydes, acids, etc. However, the volatile compounds among the strains were highly diverse, even among closely related strains with significantly different compositions in their volatile compounds. [Conclusion] Most fungi fromAscocorynecould have the capability to produce volatile hydrocarbons. The compounds of hydrocarbons may be strain-specific. Therefore, it is fundamental for discovering or genetic engineering new strains to study and develop myco-diesel fromAscocorynefungi.

Ascocoryne；VOCs；SPEM-GC-MS；bioenergy；hydrocarbon

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.03.003

2016-10-16

水解纖維素產(chǎn)烴樹木內(nèi)生菌資源利用技術(shù)引進(jìn)(2013-4-10)、效應(yīng)物在楊盤二孢半活養(yǎng)方式及親和寄主致病性中的作用(31370645)、芯片通量病原檢測技術(shù)在楊樹病害防控中的應(yīng)用([2016]10)

高茜，博士，助理研究員，環(huán)境生態(tài)學(xué)，E-mail：gq8778@caf.ac.cn

* 通訊作者：嚴(yán)東輝，博士，研究員，主要從事森林病理與樹木微生物學(xué)，E-mail：yandh@caf.ac.cn

S567.3

A

1001-1498(2017)03-0376-08