抗褐化劑對天女木蘭芽外植體褐化與酚酸氧化的影響

高紅兵，杜鳳國，王 歡

(北華大學林業(yè)與生態(tài)環(huán)境省重點實驗室，吉林 吉林 132013)

抗褐化劑對天女木蘭芽外植體褐化與酚酸氧化的影響

高紅兵，杜鳳國，王 歡

(北華大學林業(yè)與生態(tài)環(huán)境省重點實驗室，吉林 吉林 132013)

[目的]確定引起天女木蘭褐化現(xiàn)象的酚酸種類，篩選出最佳抗褐化劑及使用最適濃度。[方法]在B5培養(yǎng)基中分別添加各種抗褐化劑，芽外植體培養(yǎng)30 d后計算出褐化率，對褐化率結果進行統(tǒng)計分析，并比較三種抗褐化劑的抗褐化效果；另外，在組培過程中定期取樣，利用HPLC測定芽外植體中咖啡酸、綠原酸和對香豆酸含量變化。[結果]表明：天女木蘭芽外植體褐化過程中咖啡酸和綠原酸含量下降幅度較大，而對香豆酸含量下降幅度較小，說明咖啡酸和綠原酸容易被氧化，而對香豆酸較為穩(wěn)定；三種抗褐化劑控制褐化現(xiàn)象發(fā)生的最佳效果排序為VC>PVP>CA；盡管PVP控制酚酸氧化效果不如CA，但是預防褐化效果確強于CA，其原因是由于二者抗褐化機理不同所致；VC使用的最適濃度為500 mg·L-1，如果超過此濃度會導致外植體褐化率增加； PVP最適濃度為1 000～1 500 mg·L-1, CA最適濃度為300 mg·L-1。[結論]天女木蘭芽外植體褐化底物是咖啡酸和綠原酸，而與對香豆酸無關；VC、PVP和CA三種抗褐化劑抗褐化機理各不相同，綜合比較VC抗褐化效果最好，其次是PVP,CA排在最后。

天女木蘭，外植體，抗褐化劑，酚酸氧化

天女木蘭(MagnoliasieboldiiK. Koch)又名小花木蘭，為木蘭科(Magnoliaceae)木蘭屬(Magnolia)的落葉小喬木，是國家三級瀕危植物。天女木蘭在組培過程中外植體褐化非常嚴重，嚴重影響了其組培成功率。木本植物與草本植物相比褐化現(xiàn)象更為嚴重，其原因是木本植物含較多的酚類化合物。多酚氧化酶(PPO)是末端氧化酶，在正常情況下植物體酚類物質與醌類分布在細胞內不同區(qū)域，酚類物質分布在液泡內，PPO分布在質體和細胞質中與膜結合呈潛伏狀態(tài)，當外植體被切割后膜結構遭到破壞，PPO與酚類物質接觸，在外植體傷口處發(fā)生氧化作用，酚類物質被氧化成醌類物質，醌類物質再經非酶促反應聚合形成褐色物質，并對植物產生毒害作用[1-5]。為了控制外植體褐化，人們在培養(yǎng)基中添加抗褐化劑達到預防褐化目的，比如：維生素C、檸檬酸、半胱氨酸、聚乙烯吡咯烷酮和活性炭等。目前，有少量使用抗褐化劑抑制天女木蘭組培褐化方法的研究報道[6-7]，而關于抗褐化劑控制天女木蘭外植體褐化機理的研究還未見報道。本文以天女木蘭芽作為外植體，在培養(yǎng)基中分別添加維生素C、檸檬酸和聚乙烯吡咯烷酮三種類型抗褐化劑，在組織培養(yǎng)過程中定期取樣，利用高效液相色譜儀測定芽外植體中主要酚酸含量動態(tài)變化，確定引起天女木蘭褐化現(xiàn)象的主要酚酸種類，從外植體褐化率及外植體主要酚酸含量動態(tài)變化兩方面，比較三種抗褐化劑的抗褐化效果，確定酚酸種類與褐化的關系，為解決天女木蘭組培褐化問題及揭示不同類型抗褐化劑的作用機理提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)材料與培養(yǎng)方法

于4月初采集天女木蘭成年樹上一年生枝條，放置在實驗室進行水培8～10 d，待芽萌動膨大時剪取頂芽和側芽，芽長0.5～1.0 cm，用洗潔精浸泡20 min，流水沖洗2 h。在超凈工作臺內將芽放入質量分數(shù)為75%的乙醇溶液中消毒30 s，用無菌水沖洗3次，然后用0.1%氯化汞處理7 min，無菌水沖洗5次，接種。

1.2 培養(yǎng)基配制、培養(yǎng)條件及褐化率計算、統(tǒng)計分析方法

在B5培養(yǎng)基中分別添加不同濃度維生素C(以下簡稱VC)、檸檬酸(以下簡稱CA)和聚乙烯吡咯烷酮(以下簡稱PVP)三種抗褐化劑，其余添加成份相同，分別添加0.5 mg·L-1六芐基腺嘌呤(6-BA)、0.3 mg·L-1吲哚丁酸(IBA)、蔗糖30 g·L-1，調pH 5.6～5.8。試驗設一個對照(CK)和三個不同濃度(T1、T2和T3)處理，每個處理培養(yǎng)30瓶，重復3次。各處理添加抗褐化劑濃度詳見表1。培養(yǎng)溫度25℃，光照1 500～2 000 lx，培養(yǎng)30 d統(tǒng)計外植體褐化率。褐化率計算方法為：褐化率=褐化瓶數(shù)/培養(yǎng)瓶數(shù)×100%。試驗采用單因素方差分析及多重比較，利用Spass 18.0版軟件對褐化率進行統(tǒng)計分析。

1.3 取樣與酚酸測定方法

1.3.1 取樣 接種10 d后開始取樣，取樣時間為10 d、20 d 和30 d，選取具有代表的芽外植體，液氮冷凍，存放于-80℃超低溫冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 酚酸提取及測定方法 參考 Rosa等[8]發(fā)表的方法略加改動。稱取冷凍樣品 2.0 g，加液氮研磨，用 16 mL 60% 乙醇超聲波提取 30 min，重復提取3次，過濾，濾液合并。用旋轉蒸發(fā)儀 35℃低壓蒸出乙醇剩水相，用 6 mol·L-1鹽酸溶液調水相 pH至 2.0，用 30 mL 乙酸乙酯萃取 3次，合并酯相。在35℃下濃縮至干，殘渣用 60%甲醇溶解，定容至 5 mL，用 0.45μm 濾膜過濾，上樣檢測。

1.3.3 HPLC測定酚酸的條件及方法 高效液相色譜儀(型號LC-20A，島津公司生產)；二極管陣列檢測器(型號SPD-M20A)；InertSustainC18色譜柱(規(guī)格4.6 mm ×250 mm,5 μm)。使用A和B雙泵系統(tǒng)，流速0.8 mL·min-1, 柱溫30℃。流動相A為1%(體積分數(shù))乙酸水溶液，流動相B為1%乙酸甲醇溶液；采用梯度洗脫，洗脫梯度：起始濃度10% B;0～15 min,18% B;15～35 min,25% B;35～45 min,35% B;45～60 min,50% B;60～65 min,95% B。甲醇和乙酸均為色譜純，咖啡酸、綠原酸和對香豆酸純度>99%(Sigma公司生產)。定量方法采用孫洪圳[9]等介紹的方法進行，每個樣品重復三次進樣測定，測定結果取平均值。

2 結果與分析

2.1 抗褐化劑對芽外植體褐化的影響

三種抗褐化劑對外植體褐化率的影響見表1。從表1得出，除VC(T3)處理之外，其余各處理褐化率與對照相比差異均極顯著。三種抗褐化劑處理褐化率最低的前三名排序為VC (T2)、VC (T1)和PVP(T3)處理，VC表現(xiàn)出良好的抗褐化效果，但是其三個不同濃度處理褐化率差異較大，VC(T2)處理褐化率最低為12.2%，其次是VC(T1)處理16.7%，二者差異不顯著，但是VC(T3)處理褐化率高達48.9%，與T1、T2處理相比差異極其顯著，而與CK處理褐化率差異不顯著，其原因在后面討論中進行。PVP抗褐化效果僅次于VC(T1和T2)處理，PVP處理褐化率變化比較有規(guī)律性，隨著添加PVP濃度增加，外植體褐化率下降，T1、T2和T3處理褐化率分別為26.7%、18.9%和17.8%。CA處理的褐化率最高，其T1、T2和T3處理的褐化率分別為 36.7%、26.7%和27.8%，T2和T3處理抗褐化效果明顯好于T1處理，差異十分顯著，但是T2和T3處理之間差異不顯著。

表1 不同濃度抗褐化劑處理對外植體褐化的影響

表中褐化率一欄數(shù)據(jù)為褐化率平均值±標準誤，不同小寫字母表示差異極顯著(α=0.01)。

褐化程度分輕、中和重度三級，分別用“+”、“++”和“+++”表示。

Values represent the means ±SE,and different small letters within the column indicated significance atα=0.01 level.

Browning degree is categorized into light, moderate, and severe levels, represented by +”, “++”and “+++”, respectively.

2.2 VC處理對芽外植體中酚酸含量變化影響

不同濃度VC處理對天女木蘭芽中咖啡酸含量變化影響見圖1A。在培養(yǎng)第10～30 d，各處理咖啡酸含量均呈下降趨勢，其中CK處理咖啡酸含量下降幅度高達66.4%，而T1、T2和T3分別下降43.4%、12.8%和66.7%，T2處理咖啡酸下降幅度最小，其次是T1處理，T3處理咖啡酸下降幅度最大，其下降幅度還略高于CK處理下降幅度；在培養(yǎng)初期第10 d時，T1和 T2處理與CK處理相比咖啡酸含量高出8.21%和15.56%，而T3處理咖啡酸含量比CK處理低28.3%。外植體中咖啡酸的下降幅度越大，說明咖啡酸氧化程度高。試驗結果顯示T2處理預防咖啡酸氧化效果最好，其次是T1處理，T3處理從結果看似乎是咖啡酸氧化加劇，但是其原因比較復雜，這一現(xiàn)象在后面討論中進行。

圖1B顯示VC處理對綠原酸含量變化的影響。各處理綠原酸含量均呈下降趨勢，第10～30 d，CK處理綠原酸含量下降70.9%，而T1、T2和T3處理綠原酸下降幅度分別為32.9%、24.5%和67.4%，其中T2處理下降幅度最小，其次是T1處理，T3處理下降幅度最大；在第10 d，CK處理綠原酸含量分別比T1和T2處理下降4.9%和7.6%，而與T3處理相比綠原酸含量還高16.7%；在第10～30 d，CK處理綠原酸含量一直低于T1和T2處理，但高于T3處理，綠原酸與咖啡酸含量變化具有相同規(guī)律。

圖1C顯示VC處理對對香豆酸含量變化的影響。在第10 ～30 d，對香豆酸含量整體呈下降趨勢，其中CK處理對香豆酸含量下降僅為7.4%，遠遠低于咖啡酸和綠原酸CK處理66.4%和70.9%的下降幅度。T1、T2和T3處理對香豆酸含量下降幅度分別是7.4%、6.1%和13.8%，T1和T2處理與CK處理相差不大，而T3處理與CK處理相比下降幅度相對較大。

圖1 不同濃度VC處理對芽中咖啡酸(A)、綠原酸(B)和對香豆酸(C)含量變化的影響 Fig.1 Effects of different VC levels on content changes of caffeic acid (A), chlorogenic acid (B), and p-coumaric acid (C) in buds

從圖1(A、B和C)的試驗結果可以看出，天女木蘭外植體芽中咖啡酸和綠原酸化學性質非常活躍易被氧化。在培養(yǎng)初期，外植體中咖啡酸和綠原酸含量下降幅度較大，VC可以阻止二者含量大幅下降的趨勢，即具有預防咖啡酸和綠原酸被氧化的功能。培養(yǎng)基中添加VC濃度在250～500 mg·L-1范圍時，隨著VC濃度增加預防酚酸氧化效果越好，當培養(yǎng)基中VC濃度達750 mg·L-1時，VC起到加速咖啡酸和綠原酸下跌作用，即失去了保護酚酸的功效。對香豆酸含量在芽組培過程中變化幅度不大，說明其較為穩(wěn)定，不易被氧化。培養(yǎng)基中添加VC濃度250～500 mg·L-1時，對其含量變化無太大影響，但VC濃度達到750 mg·L-1時，對香豆酸含量亦會快速下降。

2.3 CA處理對芽外植體中酚酸含量變化影響

CA對咖啡酸含量變化影響見圖2A，在第10～30 d，各處理咖啡酸含量整體均呈下降趨勢，其中T2處理咖啡酸含量下降44.8%，下降幅度最小，其次是T3處理下降47.2%，T1處理下降幅度最大為63.1%。三處理咖啡酸含量下降幅度均低于CK處理66.4%下降幅度；在第10 d時，CK處理與T1、T2和T3處理相比，咖啡酸含量分別下降4.9%、6.3%和6.9%，至第20 d，下降幅度加大，分別為13.4%、43.0%、40.7%。

圖2B顯示CA對綠原酸含量變化的影響。綠原酸含量變化規(guī)律與咖啡酸很相似，整體呈現(xiàn)下降趨勢。在第10～30 d，T1、T2和T3處理綠原酸含量下降幅度分別為50.5%、34.2%和36.2%，均低于CK處理 70.9%下降幅度；在第10 d時，CK處理綠原酸含量與T1、T2和T3處理相比分別低4.8%、6.5%和6.6%，至第20 d時下降幅度加大，分別低 30.8%，23.4%和 22.0%。

對香豆酸含量變化見圖2C，在第10～30 d，各處理對香豆酸含量均小幅呈下降趨勢， T1、T2和T3處理對香豆酸含量下降幅度分別為6.2%、8.1%和5.2%，與CK組7.4%的下降幅度相比，差別不大。

圖2 不同濃度CA對咖啡酸(A)、綠原酸(B)和對香豆酸(C)含量變化的影響Fig.2 Effects of different CA levels on content changes of caffeic acid (A), chlorogenic acid (B), and p-coumaric acid (C) in buds

從圖2(A、B和C圖)可以得出，CA對咖啡酸和綠原酸具有顯著的保護作用，在100～300 mg·L-1范圍內隨著CA濃度增加，二者含量下降幅度減小，即CA預防酚酸氧化能力增強；當CA濃度達到500 mg·L-1時，預防酚酸氧化效果并未增強。CA與VC均具有防止咖啡酸和綠原酸被氧化的功能，不同之處在于，高濃度VC會導致咖啡酸和綠原酸含量大幅下降，而CA則未出現(xiàn)此現(xiàn)象。在培養(yǎng)過程中對香豆酸含量變化幅度不大，CA對其保護作用不顯著。

2.4 PVP對酚酸含量變化的影響

不同濃度PVP對咖啡酸含量變化的影響見圖3A。 在第10～30 d，各處理咖啡酸含量均呈下降趨勢， T1、T2和T3處理咖啡酸含量分別下降63.3%、59.1%和49.3%，均低于CK組66.4%的下降幅度；第10 d時，CK處理咖啡酸含量與T1、T2和T3處理相比變化幅度不大，變化在5%范圍內，至20 d時，下降幅度分別為11.7%、19.6%和34.8%，下降幅度開始加大。

PVP對綠原酸含量變化影響見圖3B，各處理綠原酸含量整體呈下降趨勢，在第10～30 d，T1、T2和T3處理綠原酸含量下降幅度分別為60.7%、57.1%和55.2%，低于CK對照 66.4%的下降幅度；第10 d時，各處理處理綠原酸含量與CK處理相比相差不大，CK處理咖啡酸含量略高于T1和T2處理，低于T3處理，至第20 d時，CK組綠原酸含量與T1、T2和T3處理相比下降幅度加大，分別為26.0%、32.9%和35.9%。

PVP處理與對香豆酸含量變化關系見圖3C，在培養(yǎng)第10～30d，各處理香豆酸含量均呈小幅下降趨勢，T1、T2和T3處理對香豆酸含量下降幅度分別為5.6%，5.6%和5.3%，略低于CK處理7.4%的下降幅度，PVP處理對對香豆酸含量變化影響不大。

從圖3(A、B和C)可以得出，PVP亦具有預防咖啡酸和綠原酸含量下降作用，即對外植體內咖啡酸和綠原酸具有保護功能，但是通過與VC和CA處理咖啡酸和綠原酸含量變化比較，PVP對咖啡酸和綠原酸的保護效果不如VC和CA處理。對香豆酸化學性質相對穩(wěn)定，PVP處理與VC和CA處理對其含量變化影響不大。

圖3 不同濃度PVP處理對咖啡酸(A)、綠原酸(B)和對香豆酸(C)含量變化的影響Fig.3 Effects of different PVP levels on content changes of caffeic acid (A), chlorogenic acid (B), and p-coumaric acid (C) in buds

3 結果與討論

3.1 主要酚酸與外植體褐化之間關系

酚類物質是植物體內次生物質，其種類繁多，主要包括酚酸、黃酮、單寧和木質素。植物組培褐化現(xiàn)象產生經常由于不同種酚類物質造成，如板栗與蝴蝶蘭褐化主要是由于單寧氧化引起[10-12]，綠原酸是造成蘋果、油橄欖和甜菜褐化的主要底物[13-15]。印芳等對蝴蝶蘭研究發(fā)現(xiàn)蝴蝶蘭褐化與總酚含量有關，其中綠原酸、咖啡酸、兒茶酚和對香豆酸等可能是褐化底物[16-17]。天女木蘭組培褐機理研究尚未見報道，我們曾利用HPLC儀對天女木蘭芽中咖啡酸、綠原酸、對香豆酸、沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、槲皮素、阿魏酸、香豆素和蘆丁等十種酚酸進行了定性定量測定，僅檢測到了對香豆酸、咖啡酸和綠原酸三種酚酸，其中對香豆酸含量最高，其次是咖啡酸，綠原酸含量最低。

綜合本文研究結果分析，CK處理與抗褐化劑處理相比褐化率最高，而其外植體中咖啡酸和綠原酸下降幅度亦最大，說明二者被氧化程度高，外植體中大量咖啡酸和綠原酸被氧化成醌類物質導致其含量大幅下降，CK處理結果顯示咖啡酸和綠原酸氧化與褐化率密切相關；另外，從抗褐化劑處理試驗結果亦可以得出相同結論，抗褐化劑各處理外植體褐化率均低于CK處理，證明抗褐化劑對咖啡酸和綠原酸具有保護作用，具有預防酚酸氧化功能，在抗褐化劑理中VC(T3處理除外)處理褐化率最低，而其外植體在培養(yǎng)過程中咖啡酸和綠原酸的下降幅度最小，說明二種酚酸被氧化程度低，外植體褐化率與咖啡酸和綠原酸氧化程度呈正相關。試驗結果表明，咖啡酸和綠原酸是天女木蘭組培褐化底物，盡管在天女木蘭芽外植體中對香豆酸含量高于咖啡酸和綠原酸，但是在組培期間，CK處理對香豆酸含量下降幅度僅為7.4%，抗褐化劑處理(VC T3處理除外)對其含量變化影響也不大，說明對香豆酸化學性質穩(wěn)定不易被氧化，與外植體褐化關系不大，因此我們認為對香豆酸不是天女木蘭褐化底物。

3.2 三種抗褐化劑抗褐化效果比較

植物中酚酸類物質由于具有活躍的羥基，其化學性質非?；钴S。酚酸根據(jù)結構分為苯甲酸型和肉桂酸型兩種類型，常見的苯甲酸型有沒食子酸、香草酸、原兒茶素等，咖啡酸、芥子酸、阿魏酸屬于肉桂酸型， Sroka[18]和RiceEvans[19]等人認為酚酸的活性與結構密切相關，羥基的數(shù)量和位置都會影響到酚酸活性，羥基越多越活躍，羥基數(shù)量相同時，取代位置不同活性不同，如果取代位置相同時，肉桂酸型活性強于苯甲酸型酚酸?？Х人岷蛯ο愣顾釋儆谌夤鹚嵝头铀幔G原酸是咖啡酸與奎寧酸的脂化物，所以它們的化學活性非常強易被氧化。

VC作為一種強抗氧化劑，因其具有較好抗褐化效果而被廣泛使用，現(xiàn)有研究資料表明，人們使用VC作為抗褐化劑的方法性研究較多，而關于VC抗褐化機理研究報道相對較少。本試驗結果發(fā)現(xiàn)，在組培期間，CK處理外植體中咖啡酸和綠原酸含量大幅下降，說明二者化學性質活躍容易被氧化。VC具有顯著預防咖啡酸和綠原酸氧化的作用，培養(yǎng)基添加VC濃度不超過500 mg·L-1時，隨著VC濃度增加抑制酚酸氧化效果增強，但是培養(yǎng)基中添加VC濃度超過500 mg·L-1會導致外植體中咖啡酸和綠原酸含量大幅下降，褐化現(xiàn)象加劇。VC抗褐化機理很復雜，它可以作為醌類物質還原劑，將醌類物質還原，同時又具有PPO抑制劑功能，螯合PPO的輔基銅離子起到抗褐化作用[20]。VC作為還原劑還原醌類物質時，其使用濃度非常重要，濃度低還原效果不顯著，濃度過高時氧化形成的酮化合物與氨化合物發(fā)生非酶褐變使外植體褐變加重[21]，本實驗結果也證明該觀點。所以，使用VC作為抗褐化劑要根據(jù)培養(yǎng)植物材料不同，選用不同濃度，因為不同植物材料酚類物質含量不同。

CA屬于多酚氧化酶抑制劑，經常被用作抗褐化劑使用。從試驗結果可以看出，CA對天女木蘭外植體中的咖啡酸和綠原酸氧化具有一定的預防作用，培養(yǎng)基中添加濃度CA濃度不超過300 mg·L-1時，隨著CA濃度的增加預防酚酸氧化效果越顯著。與VC相比，無論是外植體褐化率還是預防酚酸氧化，CA均不如VC效果顯著，劉均偉等對紫薯PPO活性的研究發(fā)現(xiàn)，VC對PPO活性的抑制作用強于CA[21]；彭思佳等對荻外植體褐化研究結果顯示，VC處理抑制外植體褐化效果好于CA處理[22]，本試驗結果他們的研究結論基本一致。

PVP是酚類物質吸附劑，可以用來吸附外植體釋放的酚類物質，阻止酚類物質被氧化成醌類物質，從而達到預防外植體褐化的目的[23]。試驗結果表明PVP對預防咖啡酸和綠原酸氧化亦具有一定效果，隨著添加PVP濃度的增加，抑制酚酸氧化效果增強。在抑制酚酸氧化效果方面，三種抗褐化劑排序為VC(T3處理除外)效果最好，其次為CA，PVP排在最后；在控制外植體褐化率方面，VC處理(T3處理除外)褐化率最低，其次是PVP處理，CA處理褐化率最高。在外植體褐化率排序與控制酚酸氧化效果排序上CA和PVP的位置略有不同，其原因可能是PVP抗褐化機理與CA不同所致，PVP屬于吸附劑，能吸附外植體由于切割釋放的酚類物質，以及酚類物質氧化形成的醌類物質，從而達到預防褐化的目的，而CA主要通過抑制PPO氧化酶活性角度來達到抗褐化的目的，所以在防止酚酸氧化方面強于PVP。

VC、PVP和CA三種抗褐化劑在預防天女木蘭外植體褐化均具有一定效果，綜合比較VC抗褐化效果最好。培養(yǎng)基中添加抗褐化劑時還應考慮外植體細胞的生長、分裂和分化，培養(yǎng)基中添加抗褐化劑濃度應該控制在即具有顯著抗褐化效果，又不影響外植體的生長、分裂和分化，所以在使用時盡量減小使用濃度。

4 結論

本文在培養(yǎng)基中添加三種類型抗褐化劑進行天女木蘭芽外植體的培養(yǎng)，并定期取樣，利用HPLC定量測定芽外植體中咖啡酸、綠原酸和對香豆酸含量的動態(tài)變化，初步確定天女木蘭褐化底物是咖啡酸和綠原酸，盡管外植體中對香豆酸含量高于咖啡酸和綠原酸，但它并不是褐化底物。通過褐化率和三種酚酸的含量變化比較得出：VC處理外植體褐化率最低，其次是PVP，CA處理褐化率最高；VC在預防酚酸氧化方面也表現(xiàn)出良好效果，但是應注意使用濃度，使用濃度不易過高，PVP在預防酚酸氧化效果不如CA處理，但是在控制外植體褐化率方面強于CA處理，可能是其抗褐化機理與CA不同所致。

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(責任編輯：張 研)

Effects of Browning Inhibitors on Bud Explants Browning and Phenolic Acids Oxidation ofMagnoliasieboldiiK. Koch

GAO Hong-bing , DU Feng-guo, WANG Huan

(The Provincial Key Laboratory on Forestry and Ecological Environment, Beihua University, Jilin 132013, Jilin, China)

[Objective]To identify the types of phenolic acids that result in bud explants browning ofMagnoliasieboldiiand determine the most effective anti-browning agent at an optimum concentration. [Method] Bud explants were cultured in B5 medium for 30 days. At the beginning, three kinds of anti-browning agents were added separately to the B5 medium. The browning rates were calculated and analyzed. Then the effects of the three inhibitors on anti-browning were compared on the basis of the browning rates. In addition, the content variations of caffeic acid, chlorogenic acid, and p-coumaric acid in the bud explants were measured with HPLC using samples regularly selected during tissue culturing. [Result] The results showed that the contents of caffeic acid and chlorogenic acid decreased sharply while the content of p-coumaric acid experienced a slight decrease, proving that caffeic acid and chlorogenic acid were more likely to be oxidized than p-coumaric acid. Moreover, the effects of the three inhibitors on anti-browning were sorted in a decreasing order of VC, PVP, and CA. Although PVP was inferior to CA with respect to controlling phenolic acid oxidation, its anti-browning effect was more efficient than CA. This result was explained by their different mechanisms for anti-browning. Lastly, the optimal concentration for VC was 500 mg·L-1, and a higher concentration would result in a greater browning rate of the bud explants. Respective optimal concentrations for PVP and CA were 1 000～1 500 mg·L-1and 300 mg·L-1. [Conclusion] The browning substrates in bud explants of M. sieboldii are caffeic acid and chlorogenic acid rather than p-coumaric acid. VC, PVP, and CA have distinguishable anti-browning mechanisms and the anti-browning effects of them will decrease gradually.

Magnoliasieboldii, explant, browning inhibitor, phenolic acid oxidation

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.03.023

2016-08-31

吉林省科技廳項目(20140101016JC);吉林省教育廳項目(吉教合字2014第172號)。

高紅兵(1962—)，教授，主要研究方向：植物組織培養(yǎng)與逆境生理。電話：18604498160，郵箱：gao-hongbing@163.com.

S763.7

A

1001-1498(2017)03-0525-08