體外法研究竹葉黃酮對奶牛乳腺上皮細胞抗氧化及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路中關(guān)鍵基因表達的影響

王宇彤 沈義媛* 霍相羽 牛 慧 韓思雨 童津津** 熊本海 蔣林樹**

(1.北京農(nóng)學院動物科學技術(shù)學院，奶牛營養(yǎng)學北京市重點實驗室，北京 102206；2.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

牛乳是由乳腺產(chǎn)生的一種具有膠體特性的生物學液體，成分包括脂肪、蛋白質(zhì)、乳糖、礦物質(zhì)、維生素和水[1]。其中乳蛋白是牛乳的重要營養(yǎng)成分，因此在奶牛乳產(chǎn)業(yè)中，提高牛乳中乳蛋白含量被越來越多的研究者所關(guān)注。目前，奶牛養(yǎng)殖場可以通過改善飼糧營養(yǎng)水平、加強管理、提高遺傳育種技術(shù)等方面提高牛乳中乳蛋白的含量[2]。植物提取物來源于天然植物，因其具有低毒性、低殘留、綠色環(huán)保、不易產(chǎn)生耐藥性等特征，逐漸成為畜禽飼料行業(yè)的研究熱點并取得了一定的研究進展[3-4]。竹葉中提取的竹葉黃酮(bamboo leaf flavonoids,BLF)，因其天然活性成分在機體內(nèi)殘留少、不產(chǎn)生耐藥性，并且具有抗炎、抗氧化、提高機體免疫力等多種生物學功能，在畜禽生產(chǎn)中具有廣闊的應用潛能[5]。

現(xiàn)有研究表明，竹葉中含有的化學成分包括黃酮、苷類、活性多糖類、特種氨基酸、肽類、芳香成分以及錳、鋅、硒等多種對人體有益的微量元素[6-8]。其中，BLF是從竹葉中提取出的一種活性物質(zhì)，可作為一種健康無毒害的飼料添加劑，并被國家衛(wèi)生部批準認定為天然食品添加劑。據(jù)報道，BLF具有清除氧自由基和增強免疫力的功能，并具有抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化等多種生物活性[5,9-16]。本團隊前期研究[17]結(jié)果表明，飼糧中添加0、30.0、60.0和90.0 g/d的竹葉提取物(BLF含量為40%)飼喂奶?？娠@著提高乳汁中乳糖和乳蛋白的含量，其中30.0 g/d組奶牛血清中免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)含量顯著增加，以及竹葉提取物可顯著提高奶牛血漿中過氧化氫酶(CAT)活性，顯著降低血漿中丙二醛(MDA)含量。侯昆等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛全混合日糧(TMR)中添加BLF(黃酮含量為40%)與青蒿提取物(青蒿素含量為39%)，可以在一定程度上提高奶牛的產(chǎn)奶量，顯著提高乳蛋白率并且降低奶牛乳中體細胞數(shù)。上述研究表明，BLF可以提高奶牛乳蛋白的含量，改善奶牛泌乳性能。然而，BLF如何調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細胞(bovine mammary epithelial cells,BMECs)乳蛋白的合成及其作用機制尚未明確。因此，本研究旨在通過添加BLF與BMECs共培養(yǎng)，以期闡明BLF對奶牛乳腺抗氧化及乳蛋白合成的影響及其作用機制，為BLF在奶牛生產(chǎn)方面的應用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

BMECs由東北農(nóng)業(yè)大學動物生物化學與分子生物學實驗室惠贈；竹葉選購自陜西某天然制品有限公司，BLF參照張英[19]的方法由本實驗室采用熱回流法自行提取，提取效率1%～3%，總黃酮含量為20%～26%；DMEM/F12培養(yǎng)基(11995065,11765054)、澳洲胎牛血清(FBS,10099141)、青霉素/鏈霉素溶液(Pen Strep,15140-122)、Hank’s平衡鹽溶液(HBSS,14175095)、0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)(25200056)購自美國Gibco公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)購自北京沃比森科技有限公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)活力檢測試劑盒(Lot.GB707)購自日本同仁化學研究所；活性氧(ROS)檢測試劑盒(S0033S)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；乳酸脫氫酶(LDH)活性定量測定試劑盒(E1020)購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒(ZP327-1)購自北京友誼中聯(lián)生物科技有限公司；總超氧化物歧化酶(T-SOD)試劑盒(A001-1-2)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(A005-1-2)、MDA試劑盒(A003-1-2)購自南京建成生物工程研究所；線粒體膜電位(MMP)水平測定采用Thermo公司的MitoProbeTMJC-1 Assay Kit(M34652)試劑盒；總RNA提取試劑盒(12183018A)購自賽默飛公司；cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR GreenTMPremix Ex Taq Ⅱ購自日本TaKaRa公司。

1.2 試驗設計

本試驗采用單因素試驗設計，將BMECs置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞密度達到80%～90%，進行細胞傳代，傳至3～5代，然后分別更換為添加了不同濃度(0、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、60.0、100.0 μg/mL)BLF的DMEM/F-12(含有10% FBS)培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，3、6、12、24和48 h后收集細胞，每次試驗平行復孔6個，重復試驗3次。通過CCK-8檢測細胞活性，LDH法檢測BMECs的毒性；采用對應試劑盒分析BMECs細胞凋亡、ROS含量、MMP水平、T-SOD與GSH-Px活性和MDA含量；并采用實時熒光定量 PCR(qRT-PCR)法檢測凋亡相關(guān)基因和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路中相關(guān)基因表達量的變化。

1.3 試驗方法

1.3.1 BMECs的傳代培養(yǎng)

用適量0.25%胰蛋白酶-EDTA消化BMECs，待細胞消化完全時，用含有血清的培養(yǎng)基進行終止消化，離心(500×g，10 min)、去上清后，將收集的細胞用DMEM/F-12(含有10% FBS)重懸，并于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)BMECs，傳至3～5代后用于后續(xù)試驗。

1.3.2 不同濃度BLF溶液的配制

稱取10 mg BLF用二甲基亞砜(DMSO)溶解，然后將溶解的BLF溶液(初始儲存濃度為100.0 μg/mL)加入到細胞完全培養(yǎng)液中，通過倍比稀釋調(diào)整BLF濃度分別為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、60.0和100.0 μg/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 BLF對BMECs活性影響

將BMECs以每孔100 μL接種于96孔板中，37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞密度達到80%時，分別更換為含有不同濃度(0、0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、60.0、100.0 μg/mL)BLF的150 μL DMEM/F-12(含有10% FBS，1%青-鏈霉素)培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3、6、12、24和48 h。每次試驗平行復孔6個，重復試驗3次。然后按照CCK-8活力檢測試劑盒說明書每孔加入15 μL的CCK-8檢測液，在細胞培養(yǎng)中繼續(xù)孵育2 h，用酶標儀在450 nm處測定吸光度值(OD450 nm)。

細胞相對增殖率(%)=100×試驗組OD450 nm/對照組OD450 nm。

1.3.4 BLF對BMECs毒性的影響

將BMECs接種于6孔板中，37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞密度達到80%時，用PBS進行清洗并每孔加入2 mL含有不同濃度(0、1.0、5.0、10.0 μg/mL)BLF的細胞培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。然后按照LDH試劑盒說明使用酶標儀在440 nm處測定吸光度值(OD440 nm)，計算酶活力單位。細胞LDH釋放率計算公式如下：

細胞LDH釋放率(%)=細胞培養(yǎng)基中測定的酶活力單位/(細胞裂解液測定的酶活力單位+細胞培養(yǎng)基測定的酶活力單位)×100。

1.3.5 BLF對BMECs凋亡的影響

將BMECs接種于6孔板中，37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞密度達到80%時，用PBS進行清洗并添加2 mL含有不同濃度(0、1.0、5.0、10.0 μg/mL)BLF的DMEM/F-12(含有10% FBS，1%青-鏈霉素)培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。按照Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒說明書，在200 μL含有5 μL Annexin V-FITC的結(jié)合緩沖液中室溫和黑暗條件下染色20 min，在4 ℃的黑暗中再染色15 min，然后加入10 μL PI，用流式細胞儀進行檢測。

1.3.6 BLF對BMECs ROS含量的影響

按照1.3.5的步驟將BMECs進行培養(yǎng)和處理。隨后，加入二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)，在37 ℃孵育30 min后，用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。然后用流式細胞儀檢測20 000個細胞的2′,7′-二氯熒光素(DCF)熒光分布，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。

1.3.7 BLF對BMECs MMP水平的影響

按照1.3.5的步驟將BMECs進行培養(yǎng)和處理。隨后，加入JC-1染料工作液，37 ℃孵育30 min，之后在37 ℃下用10 μmol/L的細胞凋亡誘導劑(CCCP)處理細胞30 min，再用JC-1染料工作液于37 ℃孵育30 min后，用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的JC-1染料，使用流式細胞儀在530 nm處測量MMP水平。

1.3.8 BLF對BMECs抗氧化酶活性的影響

按照1.3.5的步驟將BMECs進行培養(yǎng)和處理。隨后，按照試劑盒說明使用酶標儀分別在532、550和412 nm的吸收波長下測定MDA、T-SOD和GSH-Px的吸光度，并計算MDA含量及T-SOD和GSH-Px活性。

1.3.9 BLF對BMECs凋亡及mTOR通路相關(guān)基因相對表達量的影響

按照1.3.5的步驟將BMECs進行培養(yǎng)和處理。然后，按照總RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，之后采用cDNA合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應條件為：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。然后，以三磷酸-甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參，采用實時熒光定量PCR方法檢測凋亡及mTOR通路相關(guān)基因相對表達量。實時熒光定量PCR采用兩步法進行，反應條件：95 ℃預變性30 s，1個循環(huán)；60 ℃退火30 s，60 ℃延伸5 s，40個循環(huán)。引物序列及參數(shù)見表1。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。

表1 引物序列及參數(shù)Table 1 Primer sequences and parameters

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗結(jié)果用平均值±標準誤表示。首先，采用Excel 2019進行試驗數(shù)據(jù)的初步整理，并應用統(tǒng)計軟件GraphPad Prism 7.0進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，P<0.05代表差異顯著，P<0.01代表差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 BLF對BMECs活性的影響

如圖1所示，與對照組相比，只有添加100.0 μg/mL的BLF組細胞存活率逐漸降低且低于對照組，添加0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、60.0 μg/mL的BLF均可提高細胞存活率，且不同濃度BLF與BMECs共培養(yǎng)12 h后，細胞存活率最高。因此,12 h是BLF作用的最適時間；其中，添加1.0、5.0、10.0 μg/mL的BLF與BMECs共培養(yǎng)12 h后，細胞存活率為128.60%～141.51%，效果較好。因此選擇添加BLF的濃度為1.0、5.0和10.0 μg/mL進行后續(xù)的試驗。

圖1 BLF對BMECs活性的影響Fig.1 Effects of BLF on BMECs viability

2.2 BLF對BMECs毒性的影響

如圖2所示，BLF對BMECs無毒性作用。在37 ℃條件下添加5.0和10.0 μg/mL的BLF均可顯著降低LDH的釋放率(P<0.05)，其中5.0 μg/mL BLF效果最好。

2.3 BLF對BMECs凋亡的影響

Annexin V和PI雙重染色將細胞分為3類：Annexin V和PI均為陰性的活細胞；Annexin V為陽性，PI為陰性的早期凋亡細胞；Annexin V和PI均為陽性的晚期凋亡/壞死細胞(圖3-A)。如圖3-B所示，與對照組相比，在37 ℃條件下添加5.0、10.0 μg/mL BLF與BMECs共培養(yǎng)，極顯著降低細胞早期凋亡率和晩期凋亡/壞死率(P<0.01)。添加1.0、5.0和10.0 μg/mL的BLF極顯著降低總凋亡率(P<0.01)。

與對照組比較，“*”為差異顯著(P<0.05)，“**”為差異極顯著(P<0.01)。下圖同。Compared with control group, “*” mean significant difference (P<0.05)， and with “**” mean extremely significant difference (P<0.01). The same as below.圖2 BLF對BMECs毒性的影響Fig.2 Effects of BLF on BMECs cytotoxicity

2.4 BLF對BMECs ROS含量的影響

如圖4所示，與對照組相比，添加5.0 μg/mL BLF與BMECs共培養(yǎng)，可以極顯著減少細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生(P<0.01)。

2.5 BLF對BMECs MMP水平的影響

如圖5所示，與對照組相比，添加5.0 μg/mL BLF與BMECs共培養(yǎng)，可以極顯著降低細胞內(nèi)MMP水平(P<0.01)。

2.6 BLF對BMECs抗氧化指標的影響

如圖6所示，與對照組相比，添加1.0、5.0、10.0 μg/mL BLF與BMECs共培養(yǎng)，可以極顯著升高T-SOD、GSH-Px的活性(P<0.01)，極顯著降低MDA含量(P<0.01)。

圖6 BLF對BMECs中T-SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響Fig.6 Effects of BLF on T-SOD and GSH-Px activities and MDA content in BMECs

2.7 BLF對BMECs凋亡相關(guān)基因相對表達量的影響

如圖7所示，添加5.0 μg/mL的BLF可顯著降低B細胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白(Bax)基因相對表達量(P<0.05)；1.0、5.0和10.0 μg/mL的BLF均可極顯著提高B淋巴細胞瘤/白血病-2(Bcl-2)基因的相對表達量(P<0.01)，極顯著降低Bax/Bcl-2的比值(P<0.01)；添加5.0和10.0 μg/mL的BLF顯著降低環(huán)氧合酶-2(COX-2)的基因相對表達量(P<0.05)，極顯著降低半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)的基因相對表達量(P<0.01)。由此說明，添加BLF可降低奶牛BMECs凋亡相關(guān)基因相對表達量。

圖7 BLF對BMECs凋亡相關(guān)基因相對表達量的影響Fig.7 Effects of BLF on relative expression levels of apoptosis related genes in BMECs

2.8 BLF對BMECs中mTOR信號通路中相關(guān)基因相對表達量的影響

如圖8所示，添加1.0、5.0和10.0 μg/mL的BLF能極顯著上調(diào)mTOR、細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、核糖體蛋白S6激酶1(S6K1)和β-酪蛋白(β-casein)的基因相對表達量(P<0.01)；添加5.0和10.0 μg/mL的BLF極顯著升高真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(EIF-4EBP1)的基因相對表達量(P<0.01)。由此說明，添加BLF可通過mTOR信號通路調(diào)控關(guān)鍵基因的表達，從而影響B(tài)MECs中乳蛋白合成。

圖8 BLF對BMECs中mTOR信號通路關(guān)鍵調(diào)控基因相對表達量的影響Fig.8 Effects of BLF on relative expression levels of key regulatory genes in mTOR signaling pathway

3 討 論

BLF作為一種天然植物提取物，已被證實具有清除氧自由基、提高機體免疫力以及抗氧化等生物學功能[20-21]，但對其對BMECs抗氧化及乳蛋白的合成及其作用機制尚未明確。為進一步揭示BLF對BMECs的抗氧化及乳蛋白合成的影響，本研究展開了對細胞活性和毒性、細胞凋亡、ROS含量、MMP水平以及抗氧化能力的檢測，并通過實時熒光定量PCR的方法檢測了凋亡相關(guān)基因和mTOR信號通路相關(guān)基因相對表達量的變化。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加1.0、5.0、10.0 μg/mL的BLF與BMECs共培養(yǎng)12 h后，可顯著提高細胞增殖能力及其活性，無毒性作用，且5.0 μg/mL效果最好。這與張師[22]研究結(jié)果相一致，BLF可以顯著提高四氯化碳(CCl4)所致小鼠肝損傷的細胞存活率。此外，于馮[23]的研究結(jié)果表明，0.1～10.0 μg/mL的BLF能夠促進小鼠胚胎成纖維細胞增殖。因此，BLF可提高細胞存活率，對細胞增殖具有促進作用。

A圖為流式細胞儀檢測Annexin V/PI雙染結(jié)果；B圖為BLF對細胞凋亡率的影響。Figure A showed the results of Annexin V/PI double staining by flow cytometry; figure B showed the effects of BLF on apoptosis rate of cells.圖3 BLF對BMECs凋亡的影響Fig.3 Effects of BLF on BMECs apoptosis

泌乳期奶牛BMECs對能量的需求增加，細胞代謝速度提高，導致ROS生成量增多[24]。當機體生成和清除ROS的動態(tài)平衡被打破時，將引起氧化應激的發(fā)生，過量的ROS會使BMECs損傷，甚至導致細胞凋亡[25]。同時，過量的ROS會攻擊細胞膜上多不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化，從而產(chǎn)生MDA[26]。此外，動物體內(nèi)存在抗氧化酶系統(tǒng)，包括SOD、CAT以及GSH-Px[27]，清除過量的ROS，使細胞免受氧化損傷[28]。因此，有效降低氧化應激的損傷，提高BMECs的抗氧化能力，對提高奶牛的泌乳性能具有重要的作用。本研究結(jié)果顯示，BLF可以極顯著降低BMECs內(nèi)ROS的生成，并極顯著升高T-SOD、GSH-Px活性及降低MDA的含量，從而減輕BMECs細胞凋亡和線粒體損傷，提高抗氧化能力。張守麗等[29]研究表明，BLF可以顯著降低人肝癌HepG2細胞的MDA和ROS含量，從而緩解油酸誘導的氧化應激。王丹丹[11]發(fā)現(xiàn)一定濃度的BLF可以提高被過氧化氫(H2O2)氧化損傷的細胞SOD、CAT和GSH-Px活性，降低細胞MDA含量。張碩[30]研究表明，BLF可以顯著提高仙居雞血清SOD、CAT和GSH-Px活性，降低MDA含量，與本研究結(jié)果一致。MMP是指線粒體內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子分布不對稱而形成的電化學梯度，細胞凋亡早期MMP水平就會發(fā)生改變，出現(xiàn)下降現(xiàn)象[31]。王丹丹[11]研究表明，200.0 μg/mL的BLF可以提高被H2O2氧化損傷的大鼠嗜鉻瘤細胞系PC12細胞的MMP水平。Yu等[32]發(fā)現(xiàn)，BLF可以顯著降低HepG2細胞的MMP水平。與本研究結(jié)果BLF可以極顯著降低BMECs內(nèi)MMP水平相一致。因此，BLF可減少BMECs內(nèi)ROS積累和MMP水平，提高抗氧化能力，從而減輕BMECs凋亡和線粒體損傷。

A圖為流式細胞儀檢測ROS結(jié)果；B圖為BLF對ROS含量的影響。Figure A showed the results of ROS detected by flow cytometry; Figure B showed the effects of BLF on ROS content.圖4 BLF對BMECs ROS含量的影響Fig.4 Effects of BLF on ROS content in BMECs

在細胞生長發(fā)育過程中正常的細胞凋亡發(fā)揮了維持細胞數(shù)量穩(wěn)定的作用[33]。BMECs的數(shù)量和活力，決定了奶牛的泌乳性能。因此，抑制細胞凋亡，促進細胞的增殖對提高BMECs的泌乳能力具有重要的意義?，F(xiàn)有研究表明，細胞凋亡的信號調(diào)控有3個關(guān)鍵的調(diào)控節(jié)點：Bcl-2家族、Caspase家族和線粒體途徑。

A圖為流式細胞儀檢測MMP 的結(jié)果(FITC-A，綠色熒光；PE-A，紅色熒光)；B圖為BLF對細胞內(nèi)MMP水平的影響。Figure A showed the results of MMP by flow cytometry (FITC-A, green fluorescence; PE-A, red fluorescence); Figure B showed the effects of BLF on intracellular MMP level.圖5 BLF對BMECs MMP水平的影響Fig.5 Effects of BLF on MMP level in BMECs

Bax是Bcl-2家族中的促凋亡成員[34-36]，Bcl-2可阻斷Bax的促凋亡作用以及阻止細胞色素c的釋放，從而抑制細胞凋亡[37]。通過抑制促凋亡因子的釋放，Bcl-2蛋白家族可抑制Caspase蛋白的活性，發(fā)揮抗凋亡的作用[35]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加BLF可顯著降低Bax和Caspase-3基因相對表達量，并且可極顯著提高Bcl-2的基因相對表達量，證明BLF對細胞凋亡具有顯著的抑制作用。而且研究表明，Bax/Bcl-2的比值較高可能會誘導Caspase-3的水平升高[38]。本試驗結(jié)果也表明，BLF顯著降低了Bax/Bcl-2的比值，抑制了Caspase-3基因相對表達量。此外，COX-2是前列腺素合成途徑中的一種關(guān)鍵酶，在正常細胞內(nèi)活性較低[39]。但在細胞受到炎性反應等刺激時，會誘導COX-2表達量提高[40]。龐磊[41]研究發(fā)現(xiàn)，缺氧/復氧后COX-2表達量上升，引發(fā)細胞凋亡，而使用COX-2活性抑制劑后，可降低缺氧/復氧介導的H9C2心肌纖維細胞凋亡。本研究中添加BLF可顯著降低COX-2基因相對表達量，從而提高了細胞的存活率。因此，BLF可顯著抑制凋亡相關(guān)基因的表達，對細胞的凋亡具有抑制作用。

據(jù)報道，mTOR信號通路與BMECs的細胞增殖和乳蛋白合成密切相關(guān)[42]。乳蛋白主要包括酪蛋白和乳清蛋白，其中β-酪蛋白含量一般較高。乳蛋白合成通路主要有3條[43]，分別是Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK-STAT)信號通路、mTOR信號通路以及阻遏蛋白激酶2/真核翻譯起始因子2α(GCN2-eIF2a)信號通路。值得注意的是，mTOR信號通路主要在調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯中起作用[43-44]，mTOR廣泛存在于機體細胞中，可參與基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯、核糖體合成、凋亡等多種生命活動[44]。目前研究發(fā)現(xiàn)，mTOR包括2種復合物，分別是mTORC1和mTORC2[45]，其中mTORC1主要調(diào)控蛋白質(zhì)合成和細胞增殖。現(xiàn)有研究表明，mTOR上游信號通路是磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K-AKT)，PI3K被激活后，進一步作用于蛋白激酶B(AKT)，而活化的AKT基因可以直接作用于mTOR，使下游的EIF-4EBP1及S6K1磷酸化，從而促進乳蛋白的合成[43,46]。本研究結(jié)果表明，在體外培養(yǎng)條件下，添加1.0、5.0、10.0 μg/mL的BLF可極顯著提高BMECs中mTOR信號通路關(guān)鍵調(diào)控基因mTOR和S6K1的基因相對表達量，添加5.0、10.0 μg/mL的BLF可極顯著提高BMECs中mTOR信號通路關(guān)鍵調(diào)控基因EIF-4EBP1基因相對表達量，添加1.0、5.0、10.0 μg/mL的BLF可極顯著提高β-酪蛋白基因相對表達量，由此可見，BLF可通過mTOR信號通路中關(guān)鍵基因的調(diào)節(jié)，從而影響B(tài)MECs合成乳蛋白的能力。

賈若愚[47]研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛飼糧中添加30.0和60.0 g/d的BLF可以分別提高0.03和0.06 kg/d的乳蛋白產(chǎn)量。然而，BLF如何通過mTOR信號通路的關(guān)鍵因子影響乳蛋白的合成有待進一步的驗證。特別是，隨著質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展，高通量蛋白組學鑒定和蛋白質(zhì)翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學，為更好地揭示生命現(xiàn)象的本質(zhì)與規(guī)律，提供了全新的研究思路和技術(shù)手段。因此，本研究為進一步應用組學方法研究BLF影響B(tài)MECs合成乳蛋白的相關(guān)研究奠定了基礎。綜上所述，添加BLF可顯著上調(diào)BMECs中mTOR信號通路轉(zhuǎn)導，提高該信號通路關(guān)鍵基因相對表達量，但具體的作用機制還有待進一步的深入研究。

4 結(jié) 論

在體外培養(yǎng)的條件下，添加BLF可顯著提高BMECs的活性；同時，BLF可以通過降低BMECs內(nèi)ROS的生成、MMP水平，降低凋亡相關(guān)基因的表達，達到減少細胞凋亡和線粒體損傷的作用；此外，BLF可以通過mTOR信號通路，影響乳的合成，其中添加5.0 μg/mL的BLF效果最為顯著。