貴州省東方蜜蜂微衛(wèi)星DNA遺傳分化與遺傳多樣性分析

于瀛龍, 周姝婧, 徐新建, 朱翔杰, 楊凱杰, 陳道印, 周冰峰

(福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

貴州省東方蜜蜂微衛(wèi)星DNA遺傳分化與遺傳多樣性分析

于瀛龍, 周姝婧, 徐新建, 朱翔杰, 楊凱杰, 陳道印, 周冰峰

(福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

利用31個微衛(wèi)星位點對貴州全省的東方蜜蜂進行分析.結(jié)果表明：貴州省東方蜜蜂遺傳分化系數(shù)(FST)為0～0.03，沒有發(fā)現(xiàn)貴州省東方蜜蜂發(fā)生遺傳分化.貴州省東方蜜蜂微衛(wèi)星平均期望雜合度為0.434 5±0.055 0，平均觀察雜合度為0.419 6±0.011 4，平均等位基因數(shù)為5.56±4.34，平均有效等位基因數(shù)為2.693 0±2.113 5，平均香農(nóng)指數(shù)為0.873 5±0.797 1.貴州省東方蜜蜂微衛(wèi)星遺傳多樣性高于全國東方蜜蜂的平均水平.本文研究結(jié)果對了解我國東方蜜蜂遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳分化和遺傳多樣性水平具有重要的價值，對指導(dǎo)貴州省東方蜜蜂遺傳資源保護與利用提供理論依據(jù).

東方蜜蜂; 遺傳分化; 遺傳多樣性; 微衛(wèi)星DNA

遺傳多樣性是衡量物種適應(yīng)外界環(huán)境變化能力的重要指標，能夠反映物種的進化潛力，同時也是遺傳資源領(lǐng)域開展遺傳育種的重要基礎(chǔ)[1].遺傳分化是種群遺傳研究的重要部分，其核心內(nèi)容是種群的劃分和種群的分化規(guī)律[2].貴州地處中國西南的云貴高原東部，氣候溫暖濕潤，屬亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候區(qū)，自東向西呈現(xiàn)海拔逐漸升高的丘陵地勢，森林覆蓋面積大，全省東方蜜蜂分布廣，種群數(shù)量多，是我國重要的東方蜜蜂主產(chǎn)區(qū).

研究者對貴州省東方蜜蜂的形態(tài)指標進行了分析.與重慶、廣西東方蜜蜂相比，貴州省東方蜜蜂存在特有的形態(tài)特征，說明貴州省東方蜜蜂在遺傳資源上的特殊性[3-5].不同研究在對貴州省內(nèi)東方蜜蜂的遺傳分化結(jié)果上存在差異.楊冠煌[3]通過12個形態(tài)標記比較平均值，將貴州東部東方蜜蜂劃分為華中生態(tài)型，貴州西部劃分為云貴高原生態(tài)型；徐祖蔭等[4,5]利用7個形態(tài)標記的平均值將貴州省東方蜜蜂劃分為山地生態(tài)型與云貴高原生態(tài)型，以織金—冊亨、赫章—盤縣為界限分別分布在東西兩側(cè)；《中國畜禽遺傳資源志·蜜蜂志》將貴州省東方蜜蜂劃分為云貴高原中蜂和華中中蜂，其中華中中蜂分布于貴州省東部和東北部，云貴高原中蜂分布于貴州省西部[6]；駱群等[7]利用32個形態(tài)標記進行更為客觀的多元統(tǒng)計分析，未發(fā)現(xiàn)貴州省東方蜜蜂發(fā)生形態(tài)分化.

微衛(wèi)星分子標記屬于共顯性遺傳，遵循孟德爾遺傳規(guī)律，多態(tài)信息含量高，檢測遺傳分化較為靈敏，能夠用來解決形態(tài)標記等連續(xù)型數(shù)量標記無法解決的遺傳多樣性研究[8].已有研究利用3～21個微衛(wèi)星標記分析了海南[9,10]、浙江大門島[11]、泰國南部、北部、泰國蘇梅島東方蜜蜂的遺傳分化[12]，從分子水平描述了長白山[13]、黃土高原[14]、云南東方蜜蜂的遺傳多樣性水平[15].對于貴州省東方蜜蜂的微衛(wèi)星標記分析尚無報道.

本研究利用31個微衛(wèi)星位點對貴州全省的東方蜜蜂進行遺傳分化與遺傳多樣性分析，為該地東方蜜蜂遺傳資源提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為東方蜜蜂的保護與利用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

圖1 貴州省東方蜜蜂樣點Fig.1 Distribution of sample locations in Guizhou

根據(jù)貴州省的地形、地貌、以及東方蜜蜂的分布特點，本研究共采集9個樣點的東方蜜蜂樣本(圖1)，每個樣點樣本量在31～65群(表1)，每個樣點選取當?shù)匕胍吧鸂顟B(tài)的蜂群，以避免外來引種、商業(yè)買賣對樣本的影響.

1.2 方法

采用Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取基因組.

采用ExTaq Hot Start Version多重擴增試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]和Toptaq多重擴增試劑盒[北京全式金生物技術(shù)有限公司]對31個微衛(wèi)星位點進行多重PCR擴增[16,17](表2).ExTaq Hot Start Version多重擴增試劑盒的位點擴增程序為：95 ℃預(yù)變性15 min、95 ℃變性30 s、58 ℃退火40 s、72 ℃延伸40 s、循環(huán)次數(shù)30；72 ℃延伸10 min.Toptaq擴增試劑盒的擴增程序為：94 ℃預(yù)變性15 min、94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s、循環(huán)次數(shù)30；72 ℃延伸10 min.微衛(wèi)星擴增產(chǎn)物送至蘇州金唯智生物技術(shù)公司，利用ABI 3730xl自動測序儀(美國ABI)進行毛細管電泳，電泳內(nèi)標選擇GeneScanTMLIZ?[500]，利用GeneMapper 4.0軟件分析獲得毛細管電泳圖譜.

表1 貴州省東方蜜蜂樣本信息Table 1 Information of sample locations from Guizhou

1.3 統(tǒng)計方法

利用Mstools軟件計算期望雜合度(He)、觀察雜合度(Ho)、等位基因數(shù)(Na)，利用Popgene 1.31軟件計算有效等位基因數(shù)(Ne)與香農(nóng)指數(shù)(I)總計5個微衛(wèi)星遺傳多樣性參數(shù)[18].

利用GenAlEx 6.5軟件進行主坐標分析(PCoA)，檢測遺傳分化情況[19]；Genepop on Web在線軟件分析樣點間的FST值；通過FST與基因流Nm之間的公式FST=1/(1+4Nm)，計算基因流Nm[20]；利用Structure 2.3.4軟件檢測遺傳分化情況[21]，Markov chain Monte Carlo iterations設(shè)置為100000，burn-in設(shè)置為10000，利用clumpp 1.1.2和distruct 1.1對結(jié)果進行輸出.為驗證貴州省內(nèi)部樣本是否存在遺傳分化，在各個分析中加入明顯存在地理隔離的遼寧寬甸、海南那大樣點[9,22]作為外群分析.

表2 微衛(wèi)星位點信息1)Table 2 Microsatellite loci used in this study

續(xù)表2

1)/表示沒有報道染色體的位置.

2 結(jié)果與分析

2.1 貴州省東方蜜蜂遺傳分化

通過Structure分析、主坐標分析和遺傳分化系數(shù)、基因流的分析等4種方法，沒有發(fā)現(xiàn)貴州省東方蜜蜂發(fā)生遺傳分化，全省9個樣點的東方蜜蜂屬于同一種群.

(1)Structure分析:Structure分析中，貴州樣點與兩個外群明顯分化為3個不同的種群.貴州、遼寧、海南的樣點分別顯示為3種不同的顏色，其中貴州9個樣點均為紫紅色，遼寧樣點為藍色，海南樣點為綠色(圖2).并且不同色塊顏色完整，說明分別為獨立的3個種群.

LNKD為遼寧寬甸樣點、HNND為海南那大樣點、貴州9個樣點均為紫紅色.圖2 貴州各樣點Structure結(jié)果圖Fig.2 Structure analyses of sample locations from Guizhou

LNKD為遼寧寬甸樣點，HNND為海南那大樣點，GZ為貴州各樣點.圖3 貴州各樣點主坐標分析圖(PCoA)Fig.3 Principal coordinate analyses of sample locations from Guizhou

(2)主坐標分析:主坐標分析中，貴州樣點在散點圖中分布集中，為同一種群.兩個外群分別在主坐標1和主坐標2上，與外群明顯分離(圖3).

(3)遺傳分化系和基因流分析:貴州樣點間的遺傳分化系數(shù)小，基因流數(shù)值較大.貴州省9個樣點間的遺傳分化系數(shù)FST為0～0.03，與兩個外群的FST值均大于0.08.

貴州省內(nèi)部的基因流Nm范圍在8.43～57.89之間，與外群的基因流數(shù)值均小于2.97(表3).

2.2 貴州省東方蜜蜂遺傳多樣性

貴州各個樣點的遺傳多樣性水平較一致，平均期望雜合度為0.434 5±0.055 0，平均觀察雜合度為0.419 6±0.011 4，平均等位基因數(shù)為5.56±4.34，平均有效等位基因數(shù)為2.693 0±2.113 5，平均香農(nóng)指數(shù)為0.873 5±0.797 1(表4).遺傳多樣性最低的樣點為貴州正安，其在期望雜合度、觀察雜合度、有效等位基因數(shù)、香農(nóng)指數(shù)上均表現(xiàn)最低.

3 討論

(1)本研究通過微衛(wèi)星中性分子遺傳標記沒有發(fā)現(xiàn)貴州省東方蜜蜂發(fā)生種群遺傳分化.主要原因可能是蜜蜂分布連續(xù)，基因交流沒有阻礙.貴州各樣點間遺傳分化系數(shù)為0～0.03，按照Wright標準[23]屬于無遺傳分化的水平.基因流為8.43～57.89，參照西方蜜蜂和東方蜜蜂上的研究，基因交流頻繁[24].貴州省東方蜜蜂在全省范圍的69個市縣均有分布[25]，蜂群總數(shù)量約為14萬群[26]，東方蜜蜂在貴州省境內(nèi)能夠連續(xù)并且以大種群的形式分布，境內(nèi)沒有明顯的隔離屏障，樣點之間不存在基因流的阻礙，所以沒有發(fā)現(xiàn)種群遺傳分化.

表3 貴州各樣點間遺傳分化系數(shù)FST和基因流Nm1)Table 3 FST and Nm between sample locations from Guizhou

1)左下角為遺傳分化系數(shù)FST，右上角為基因流Nm.

表4 貴州省各樣點遺傳多樣性參數(shù)Table 4 Genetic diversity parameters of sample locations from Guizhou

(2)根據(jù)現(xiàn)有的文獻分析，貴州省東方蜜蜂遺傳多樣性高于全國平均水平.主要原因可能是東方蜜蜂在云貴高原東部分布時間長，環(huán)境資源豐富，東方蜜蜂種群數(shù)量大.與全國其它地區(qū)相同微衛(wèi)星位點的遺傳多樣性相比，貴州省東方蜜蜂的遺傳多樣性水平處于較高水平，僅略低于華東地區(qū).與海南[9]同類研究中相同的7個微衛(wèi)星比較，貴州省樣本的期望雜合度為0.648 3，高于海南的0.614 6，與云南[15]、華東[27]同類研究中相同的4個微衛(wèi)星比較，貴州省樣本期望雜合度為0.813 9，高于云南的0.785 6，略低于華東的0.8570，與長白山[13]同類研究中相同的1個微衛(wèi)星比較，貴州省樣本期望雜合度為0.8280，高于長白山的0.142 7.另外，通過與我們在全國31個微衛(wèi)星數(shù)據(jù)比較(未發(fā)表)，貴州省東方蜜蜂的遺傳多樣性水平在期望雜合度、觀察雜合度和等位基因數(shù)上高于全國的平均水平，顯示了豐富的遺傳多樣性水平.分布貴州省各個地區(qū)的樣點基因交流順暢，基因流Nm為8.43～57.89，并且貴州省東方蜜蜂蜂群數(shù)量較大，占全國東方蜜蜂群數(shù)10%左右，整個貴州省的東方蜜蜂屬于同一個大種群.

(3)貴州省正安縣東方蜜蜂活框飼養(yǎng)技術(shù)推廣早，人工育王較普遍.人工育王常因母群選擇的片面，在少量蜂群中移蟲，使蜜蜂遺傳多樣性喪失.微衛(wèi)星數(shù)據(jù)中貴州正安在SV039、BI314、AC011位點上多樣性低于其余8個樣點，在這3個位點上，以1～2種等位基因為主，所占比例為0.93、0.68和0.69，極可能是不當?shù)挠趸顒釉斐闪诉@3個位點的等位基因受到了人為選擇.

致謝：本研究樣本的獲得過程中得到了貴州省農(nóng)業(yè)廳、貴州省養(yǎng)蜂學(xué)會徐祖蔭和樊蕓的協(xié)助.本科生夏鳳枝參與本研究樣本采集工作，碩士生郭慧萍、郝璐楠、本科生王恒、夏鳳枝參與部分實驗工作.

[1] 陳靈芝,馬克平.生物多樣性科學(xué):原理與實踐[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,2001.

[2] PALUMBI S R. Genetic divergence, reproductive isolation, and marine speciation[J]. Annual Review of Ecology & Systematics, 2003,25(25):547-572.

[3] 楊冠煌.中華蜜蜂[M].北京:中國農(nóng)業(yè)科技出版社,2001:8-21.

[4] 徐祖蔭.貴州省中蜂資源調(diào)查及其開發(fā)利用研究——貴州中蜂不同生態(tài)類型的劃分、評價及開發(fā)利用意見[J].貴州畜牧獸醫(yī),1986(1):13-19.

[5] 徐祖蔭.蜂海求索——徐祖蔭養(yǎng)蜂論文集[C].貴陽:貴州科技出版社,2010:32-40.

[6] 國家畜禽遺傳資源委員會.中國畜禽遺傳資源志:蜜蜂志[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2011.

[7] 駱群,周姝婧,徐新建,等.貴州東方蜜蜂形態(tài)遺傳分析[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2015,44(3):298-302.

[8] ALLENDORF F W, HOHENLOHE P G. Genomics and the future of conservation genetics[J]. Nature Reviews Genetics, 2010,11(10):697-709.

[9] 徐新建,周姝婧,朱翔杰,等.海南島中華蜜蜂遺傳多樣性的微衛(wèi)星DNA分析[J].昆蟲學(xué)報,2013,56(5):554-560.

[10] ZHAO W, WANG M, LIU Y, et al. Phylogeography ofApiscerana, populations on Hainan island and southern mainland China revealed by microsatellite polymorphism and mitochondrial DNA[J]. Apidologie, 2016:1-12.

[11] XU X, ZHU X, ZHOU S, et al. Genetic differentiation betweenApisceranacerana, populations from Damen Island and adjacent mainland in China[J]. Acta Ecologica Sinica, 2013,33(3):122-126.

[12] SITTIPRANEED S, LAOAROON S, KLINBUNGA S, et al. Genetic differentiation of the honey bee (Apiscerana) in Thailand: evidence from microsatellite polymorphism.[J]. Journal of Apicultural Research, 2001,40(1):9-16.

[13] 于瀛龍,周姝婧,徐新建,等.長白山中華蜜蜂(Apisceranacerana)遺傳多樣性分析[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2013,42(6):643-647.

[14] 徐新建,周姝婧,朱翔杰,等.黃土高原中華蜜蜂遺傳多樣性的微衛(wèi)星DNA分析[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2013,42(6):638-642.

[15] 殷玲,吉挺,陳國宏.利用微衛(wèi)星標記分析云南省6個東方蜜蜂(Apiscerena)群體遺傳多樣性及遺傳分化[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報,2011,24(2):772-778.

[16] SOLIGNAC M, VAUTRIN D, LOISEAU A, et al. Five hundred and fifty microsatellite markers for the study of the honeybee (ApismelliferaL.) genome[J]. Molecular Ecology Notes, 2003,3(2):307-311.

[17] TAKAHASHI J, SHIMIZU S, KOYAMA S, et al. Variable microsatellite loci isolated from the Asian honeybee,Apiscerana(Hymenoptera; Apidae)[J]. Molecular Ecology Resources, 2009,9(3):819-821.

[18] PARK S. Trypanotolerance in west African cattle and the population genetic effects of selection[D]. Dublin: University of Dublin, 2001.

[19] PEAKALL R, SMOUSE P E. GenAlEx 6.5: genetic analysis in Excel. Population genetic software for teaching and research-an update[J]. Bioinformatics, 2012,28(19):2 537-2 539.

[20] ROUSSET F. genepop′007: a complete re-implementation of the genepop software for Windows and Linux.[J]. Molecular Ecology Resources, 2008,8(1):103.

[21] PRITCHARD J K, WEN X, FALUSH D. Documentation for STRUCTURE software: version 2.3[J]. Journal of Pediatric Surgery, 2010,41(10):55-63.

[22] 郭慧萍,周姝婧,朱翔杰,等.秦巴山區(qū)中華蜜蜂種群微衛(wèi)星DNA遺傳分析[J].昆蟲學(xué)報,2016,59(3):337-345.

[23] WRIGHT S. Variability within and among Natural Populations[M]. Chicago: University of Chicago Press, 1978:439-459.

[24] NIKOLOVA S, BIENKOWSKA M, GERULA D, et al. Microsatellite DNA polymorphism in selectively controlledApismelliferacarnicaandApismelliferacaucasicapopulations from Poland[J]. Archives of Biological Sciences, 2015,67(3):889-894.

[25] 徐祖蔭.貴州省蜂業(yè)區(qū)劃[J].貴州畜牧獸醫(yī),1987(3):28-32.

[26] 徐祖蔭.貴州省中蜂資源調(diào)查[C].重慶:第三屆中國畜牧科技論壇,2007:436-440.

[27] 吉挺,殷玲,劉敏,等.華東地區(qū)中華蜜蜂六地理種群的遺傳多樣性及遺傳分化[J].昆蟲學(xué)報,2009,52(4):413-419.

(責(zé)任編輯:吳顯達)

Genetic diversity and genetic differentiation ofApisceranain Guizhou Province of southwest China

YU Yinglong, ZHOU Shujing, XU Xinjian, ZHU Xiangjie, YANG Kaichieh, CHEN Daoyin, ZHOU Bingfeng

(College of Bee Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

Honeybees were analyzed using 31 microsatellite loci to assess the differentiation and diversity levels throughout Guizhou Province. Our data showed that Guizhou eastern honeybees have little divergence between honeybee sampling localities becauseFSTvalue is from 0 to 0.03. Our data showed that Guizhou eastern honeybees have a higher level of genetic diversity than honeybee elsewhere in China due to high value of expected heterozygosity (0.434 5±0.055 0), observed heterozygosity (0.419 6±0.011 4), number of alleles (5.56±4.34), number of effective alleles (2.693 0±2.113 5) and Shannon index (0.873 5±0.797 1). This study is of great value to understand the genetic structure, genetic differentiation, and genetic diversity, and to provide theoretical basis for the protection and utilization of eastern honeybee in Guizhou.

Apiscerana; genetic differentiation; genetic diversity; microsatellite DNA

2017-02-28

2017-03-21

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項資金(CARS-45-KXJ11).

于瀛龍(1989-)，男，博士研究生.研究方向：蜜蜂種群遺傳學(xué).Email:yuyinglong2012@163.com.通訊作者周冰峰(1958-)，男，教授，博士生導(dǎo)師.研究方向：蜜蜂生態(tài)學(xué)和蜜蜂種群遺傳學(xué).Email:bingfengfz@126.com.

文獻標識碼: A 文章編號:1671-5470(2017)03-0323-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.03.015