復(fù)方丹參滴丸抗急性心肌梗死代謝組學(xué)研究

蘆勤瑋+佟玲+李東翔+許風(fēng)國

摘 要 采用左冠狀動脈前降支結(jié)扎的方法，建立SD大鼠急性心肌梗死（Acute myocardial infarction， AMI）模型，使用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿/飛行時間質(zhì)譜（UPLCQTOF/MS）代謝組學(xué)研究平臺對大鼠血漿樣本進行代謝輪廓分析，研究復(fù)方丹參滴丸對AMI大鼠心肌保護作用機制。經(jīng)主成分分析和偏最小二乘法分析，篩選并鑒定出22種與AMI相關(guān)的差異代謝物，其中的8種能夠被復(fù)方丹參滴丸顯著調(diào)節(jié)，分別是硫酸對甲苯、馬尿酸、雌馬酚葡萄糖苷酸、溶血磷脂膽堿（16∶0）、膽酸、油酸酰胺、棕櫚酰胺和鞘脂（d18∶1/16∶0）。研究結(jié)果表明， 復(fù)方丹參滴丸可能是通過調(diào)節(jié)苯丙氨酸代謝、甘油磷脂代謝、脂肪酸代謝、膽汁酸代謝及鞘脂代謝通路，發(fā)揮抗AMI大鼠心肌損傷的作用。

關(guān)鍵詞 復(fù)方丹參滴丸； 急性心肌梗死； 代謝組學(xué)； 血漿

1 引 言

復(fù)方丹參滴丸（Compound danshen dripping pills， CDDP）由丹參、三七和冰片組成，由天士力醫(yī)藥集團股份有限公司自主研發(fā)，以治療氣滯血瘀所致的心絞痛、冠心病為主的中藥，廣泛應(yīng)用于心血管病和糖尿病血管并發(fā)癥的治療[1]。急性心肌梗死（Acute myocardial infarction， AMI）是一類因持久嚴重的心肌缺血導(dǎo)致冠狀動脈急性閉塞，從而引起部分心肌急性壞死的急性缺血性心血管疾病，而復(fù)方丹參滴丸可以通過降低心肌耗氧量、改善能量代謝、保護心肌細胞、改善脂質(zhì)代謝、抗血小板聚集、改善血流動力學(xué)、改善微循環(huán)障礙、抗氧化和抗炎癥等作用， 多方面治療心血管類疾病[2]。

代謝組學(xué)關(guān)注于內(nèi)源性小分子化合物（分子量小于1000）在生物體系受外界刺激（如疾病侵襲、藥物干預(yù)、環(huán)境變化等）所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物應(yīng)答變化， 目前廣泛應(yīng)用于疾病診斷、藥物毒性評價、作用機理研究和基因功能闡明[3，4]。其認識疾病的過程與中醫(yī)的整體觀、系統(tǒng)觀和辨證論治不謀而合[5]，從而給中醫(yī)藥復(fù)雜理論體系的研究提供了新的思路和方法。目前已有開展復(fù)方丹參滴丸代謝組學(xué)方面的研究報道， Xin等[6]采用左冠狀動脈前降支結(jié)扎法（LADCA）制作SD大鼠心肌梗死模型， 使用GCMS檢測到血漿和尿液樣品中128種代謝物，發(fā)現(xiàn)了20種變化較大的代謝產(chǎn)物，主要集中在氨基酸代謝和能量代謝方面。Guo等[7]采用異丙腎上腺素（ISO）法制造SD大鼠急性心肌缺血模型， 使用GCTOF/MS檢測大鼠血漿和心肌內(nèi)源性代謝物，發(fā)現(xiàn)心肌缺血后，能量代謝、糖代謝、脂代謝和氨基酸代謝發(fā)生改變，而復(fù)方丹參滴丸具有逆轉(zhuǎn)作用。本研究在動物模型制備、樣品采集和檢測手段方面進行了優(yōu)化。使用LADCA法造?？膳懦齀SO法中藥物本身對于代謝物變化的影響。另外， Xin等[6]的研究發(fā)現(xiàn)， LADCA法結(jié)扎模型中，大鼠心肌在造模3天時已可見少量纖維化，造模7天時心肌已經(jīng)明顯纖維化，心臟功能已經(jīng)改變，而復(fù)方丹參滴丸對缺血所致心臟功能改變的療效一般，與其臨床適應(yīng)癥有一定差距。本研究采集造模后24 h的血漿樣本，更接近典型AMI臨床癥狀的時期。檢測手段方面， 采用適于檢測心肌缺血造成的氨基酸類、脂類、脂肪酸類等代謝物變化[8，9]的UPLCQTOF/MS方法檢測血漿樣本。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

SAR1000小動物呼吸機和BO1800動物心電血壓監(jiān)護儀（上海玉研科學(xué)儀器有限公司）； RM2235石蠟切片機和激光掃描共聚焦顯微鏡（德國Leica公司）； DP73顯微鏡（日本Olympus公司）； DH36001B電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津泰斯特公司）； WatersAcquity超高效液相色譜儀串聯(lián)Waters SynaptTM G2 QTOF/MS 質(zhì)譜儀（美國Waters公司）； MilliQ超純水儀（美國Bedford公司）； Waters Acquity BEH C8色譜柱（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司）； VortexGenie2微型漩渦混合器（美國Scientific Industries公司）； Legend micro 17高速離心機（美國Thermo公司）。

水合氯醛（分析純，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司）； 青霉素鈉注射液（北京悅康凱悅制藥有限公司）； 二甲苯和無水乙醇（分析純，國藥集團）； 蘇木精和抗熒光淬滅劑（北京索萊寶科技有限公司）； 甲醇和乙腈（質(zhì)譜純，美國Omni Chem公司）； 甲酸（HPLC級，>95%）、Lα溶血卵磷脂（≥99.0%）、3sn溶血磷脂酰乙醇胺（≥99%）、亮氨酸腦啡肽（SigmaAldrich公司）； 三氯乙醇葡糖苷酸鉀鹽（95%）、硫酸吲哚酚鉀鹽（98%），加拿大TRC公司； 馬尿酸（98%，上海Macklin公司）； 硫酸對甲苯鉀鹽（99.8%，日本TCI公司）； 琥珀酸、膽酸（98%，中檢所）。復(fù)方丹參滴丸（天士力醫(yī)藥集團股份有限公司提供）。

2.2 實驗動物

SPF級SD雄性大鼠（體重180～220 g，動物許可證編號： SCXK（京）20160011，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供），所有大鼠在實驗前供應(yīng)水和標準飼料3天。

2.3 實驗方法

2.3.1 模型建立 LADCA法制作SD大鼠心肌梗死模型[6]，將大鼠用水合氯醛（30 mg/kg）腹腔注射麻醉， 固定于手術(shù)臺上，仰臥位。頸部去毛消毒，手術(shù)剪剪開皮膚暴露氣管，連接至呼吸機進行機械通氣，設(shè)置呼吸頻率80次/min，潮氣量6～8 mL/kg，呼吸比為2∶1， 根據(jù)具體呼吸頻率及深度適當(dāng)調(diào)整呼吸參數(shù)。左前胸去毛消毒，順肋間隙方向胸骨左側(cè)切開皮膚約1.0～1.5 cm，分離皮下組織和肌肉，入胸后推開胸腺，暴露心臟及大血管根部。剪開心包，在左心耳下緣與肺動脈間可見左冠狀動脈前降支起始部，在距離主動脈根部約3～5 mm處，以左冠狀靜脈為標志，7號絲線穿線結(jié)扎造成缺血，逐層關(guān)胸，縫合皮膚，術(shù)后肌肉注射青霉素25000 U。假手術(shù)組大鼠的手術(shù)過程與上述相同，但只穿線不結(jié)扎。心電圖顯示ST段顯著抬高時， 即表明急性心肌梗死造模成功。

2.3.2 實驗分組、給藥方案及樣本收集 實驗大鼠隨機分為3組，假手術(shù)對照組（Sham）、模型組（Model）和治療組（Treatment），每組各10只。為研究復(fù)方丹參滴丸抗急性心肌梗死作用，治療組在造模前6天和造模當(dāng)天，每天灌胃給藥，給藥劑量根據(jù)臨床用藥劑量折算，以0.8 g/（day·kg）鼠重的劑量，給予復(fù)方丹參滴丸。假手術(shù)對照組及模型組分別灌胃給予相當(dāng)劑量生理鹽水。實驗動物在造模24 h后脫頸處死，眼眶取血1.5 mL，置于涂有肝素的EP管內(nèi)，3500 r/min離心15 min，于

Symbolm@@ 80℃保存?zhèn)溆?。取血后收集心肌缺血區(qū)組織（梗死區(qū)和正常區(qū)中間），用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗去除血細胞后，在液氮中速凍，于

Symbolm@@ 80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.3 血漿樣本前處理 血漿于0℃冰水混合物中解凍，用移液槍精確量取100 μL血漿樣品，加入300 μL冰甲醇，渦旋振蕩混合均勻2 min，12000 r/min離心5 min，取上清液直接用于液相色譜質(zhì)譜分析。將所有樣品各取50 μL混合作為質(zhì)控樣品（Quality control， QC），包含所有樣品的特征，力求反映整體樣品的狀況，可用于監(jiān)控整個分析批中樣品測定的穩(wěn)定性。

2.4 樣品測定

2.4.1 色譜條件 采用Waters Acquity BEH C8色譜柱（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm），流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸乙腈溶液，流速0.4 mL/min，柱溫35℃，進樣量5 μL，梯度洗脫程序： 0～1 min，5% B； 1～5 min，5%～50% B； 5～10 min，50%～80% B； 10～11 min，80%～100% B，11～12 min，100% B，平衡時間為3 min。

2.4.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），在正負兩種模式下進行測定，數(shù)據(jù)采集模式為MSE棒狀圖（Centroid）模式，交替切換低碰撞能與高碰撞能，可同時獲得一級質(zhì)譜圖和二級質(zhì)譜圖[10]。參數(shù)如下： 毛細管電壓正模式3.0 kV，負模式2.3 kV； 錐孔電壓30 V； 離子源溫度120℃； 脫溶劑氣溫度500℃； 錐孔氣流量50 L/h； 脫溶劑氣流量800 L/h； 碰撞電壓范圍19～45 V； 采樣頻率0.1 s； 質(zhì)量數(shù)檢測范圍m/z 50～1200； 內(nèi)參校準液使用亮氨酸腦啡肽（＼[M + H＼]+ （m/z 556.2771），＼[M-H＼]-（m/z 5542615）），濃度2 ng/μL，流速10 μL/min。

2.4.3 分析順序 分析樣品前測試空白溶劑樣品，保證色譜柱及系統(tǒng)中無殘留污染物干擾。連續(xù)進樣10次QC樣品， 用于評估方法的重復(fù)性，樣品測試順序隨機，并將QC樣品穿插于分析樣品中作為評估分析批次穩(wěn)定性的依據(jù)。

2.5 數(shù)據(jù)分析

將所有的液相色譜質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入Waters 公司Markerlynx 軟件（version4.1， Waters Corp， Milford， USA）， 進行色譜峰自動識別提取和峰匹配，將數(shù)據(jù)結(jié)果矩陣以CSV格式導(dǎo)出，再將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Metaboanalyst 3.0 （http：//www.metaboanalyst.ca/faces/home.xhtml），對數(shù)據(jù)矩陣進行歸一化（Normalization）、立方根數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換（Cube root transformation）、Pareto標尺化（Scaling）等處理，以減少變量方差異性，增加數(shù)據(jù)間的可比性。通過構(gòu)建非監(jiān)督主成分分析（Principal component analysis， PCA）， 考察各組血漿樣本間整體代謝變化情況； 構(gòu)建有監(jiān)督模式的偏最小二乘判別分析（Partial least squaresdiscriminant analysis， PLSDA）模型，鑒別模型中對于區(qū)分各組間代謝輪廓差異貢獻較大的代謝物，初步篩選出具有潛在可能性的內(nèi)源性代謝物。

3 結(jié)果與討論

3.1 病理學(xué)評價

以心電圖（Electrocardiogram， ECG）ST段顯著抬高作為衡量造模成功與否的標志。如圖1所示，從ECG中對比Sham組可見， 造模后出現(xiàn)ST段顯著抬高及病理性Q波，而治療組雖然依然處于ST抬高狀態(tài)，但未見明顯病理性Q波。

為檢測CDDP對組織形態(tài)的影響，取造模后心肌組織， 用H&E染色觀察心肌組織的形態(tài)變化。典型形態(tài)如圖1所示，Sham組顯示了正常狀態(tài)下心肌組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)； Model組心肌出現(xiàn)明顯損傷，表現(xiàn)為部分心肌纖維結(jié)構(gòu)破壞、心肌細胞間質(zhì)水腫和少量炎癥細胞浸潤； 而提前給予CDDP進行干預(yù)，造模后心肌組織損傷明顯減輕，僅發(fā)生少量輕度間質(zhì)水腫。

3.2 質(zhì)控樣本分析

對建立的UPLCQTOF/MS方法進行穩(wěn)定性和重復(fù)性方法學(xué)評價。正負模式下各選擇5個不同極性的離子進行方法學(xué)評價。分別對選擇的10個離子的保留時間和峰面積進行檢測（表1）。在正模式下保留時間的相對標準偏差（RSD）<0.22%，峰面積的方法重復(fù)性及穩(wěn)定性評價RSD分別為2.43%～7.14%及1.93%～3.19%； 在負模式下， 保留時間的RSD<0.70%，峰面積的方法重復(fù)性及穩(wěn)定性評價RSD分別為1.28%～2.59%及2.20%～5.93%。以上結(jié)果表明， 本方法重復(fù)性高，穩(wěn)定性好，可以用于進行批量的代謝組學(xué)實驗。

3.3 AMI差異代謝物篩選

在正負模式下， 分別對假手術(shù)對照組和模型組的數(shù)據(jù)建立PCA模型，從得分圖（圖2）中可以發(fā)現(xiàn)兩組樣品分別聚合到一起， 并得到了明顯分離，說明在AMI造模后大鼠血漿中內(nèi)源性代謝物輪廓發(fā)生了顯著異常。 將兩組數(shù)據(jù)建立PLSDA模型，使用交叉驗證的兩個參數(shù)R2和Q2進行評價，R2表示模型的方差大小和擬合的優(yōu)良度，Q2表示模型預(yù)測值的方差大小和預(yù)測能力。正模式下，R2=0.959，Q2=0944； 負模式下，R2=0.976，Q2=0.957。表明模型具有很好的擬合性和預(yù)測能力。根據(jù)模型中代謝離子的變量投影重要性參數(shù)（Variable importance in the projection，VIP）>1初步篩選差異性變量。對所得差異性變量進行t檢驗，篩選出兩組間相對含量存在顯著性差異的變量（p<0.05）。對同時滿足VIP>1和p<0.05的變量進行鑒定。

3.4 AMI差異代謝物初步鑒定

利用差異代謝物精確m/z值在HMDB（http：//www.hmdb.ca/）、METLIN（http：//metlin.scripps.edu/）、KEGG （http：//www.genome.jp/kegg/）、PubChem （https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、LIPID MAPS（http：//www.lipidmaps.org/）等數(shù)據(jù)庫檢索，結(jié)合差異代謝物質(zhì)譜數(shù)據(jù)信息（加合離子、準確質(zhì)荷比、保留時間、MSE二級信息），尋找信息匹配的可能代謝物。查詢代謝物的描述信息及相關(guān)文獻，對物質(zhì)進行確認。通過標準品對部分物質(zhì)進行驗證，最終初步確定22種差異代謝物（表2），分別分布于甘油磷脂代謝、鞘脂代謝、三羧酸循環(huán)、細胞色素P450代謝、戊糖和葡萄糖醛酸酯互變代謝、苯丙氨酸代謝、花生四烯酸代謝、膽汁酸代謝、脂肪酸代謝等代謝通路中， 表明AMI可能對以上通路造成影響，使整體狀態(tài)失調(diào)。其中，有10種代謝物在模型組中表現(xiàn)為上調(diào)，12種代謝物在模型組中為下調(diào)。

3.5 復(fù)方丹參滴丸對AMI治療作用的代謝組學(xué)分析

本研究采用代謝組學(xué)的分析方法，對大鼠血漿中的小分子代謝產(chǎn)物進行測定，從整體水平考察復(fù)方丹參滴丸對AMI的保護作用。分別在正負模式下對3組數(shù)據(jù)建立PCA模型（圖3），從得分圖中可以看出兩種檢測模式下復(fù)方丹參滴丸治療組（藍色）大鼠的整體狀態(tài)已經(jīng)偏離模型組（綠色），且有向Sham組（紅色）狀態(tài)靠近的趨勢，盡管未與Sham組整體狀態(tài)相交， 仍可說明復(fù)方丹參滴丸的給藥對大鼠起到了預(yù)保護作用。

為進一步探討復(fù)方丹參滴丸抗AMI的作用機制，對已鑒定的差異代謝物在復(fù)方丹參滴丸給藥組的含量情況進行研究。從熱圖（圖4）中可以直觀地看出差異代謝物在每個樣本中的含量高低情況。通過獨立樣本t檢驗，比較模型組與治療組總體之間的AMI差異代謝物含量是否具有顯著性差異，保留p<0.05的代謝物。結(jié)果表明，復(fù)方丹參滴丸可以不同程度地逆轉(zhuǎn)AMI大鼠血漿差異代謝物，對其中的8種代謝物具有較顯著的調(diào)節(jié)作用，分別是硫酸對甲苯（pTolyl Sulfate）、馬尿酸（Hippuric acid）、雌馬酚葡萄糖苷酸（Equol 7Oglucuronide）、溶血磷脂膽堿（16∶0）（LysoPC（16∶0））、膽酸（Cholic acid）、油酸酰胺（Oleamide）、棕櫚酰胺（Palmitic amide）和鞘脂（d18∶1/16∶0）（SM（d18∶1/16∶0）），具體調(diào)節(jié)情況如圖5所示。

以上差異代謝物位于苯丙氨酸代謝、甘油磷脂代謝、鞘脂代謝、膽汁酸代謝和脂肪酸代謝等代謝通路中，說明復(fù)方丹參滴丸可能通過調(diào)節(jié)這些通路起到保護心肌的作用。

硫酸對甲苯、馬尿酸、雌馬酚葡萄糖苷酸均屬于與尿毒癥相關(guān)的代謝物[11]，由胃腸道微生物代謝產(chǎn)生，是典型的難解離蛋白結(jié)合毒素，這些物質(zhì)含量的改變體現(xiàn)出胃腸微生物菌群的失調(diào)，與心血管疾病和氧化損傷有密切的關(guān)系[12]。 本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)AMI造模后， 這些物質(zhì)含量失衡，而在復(fù)方丹參滴丸治療組中該情況被逆轉(zhuǎn)，體現(xiàn)出復(fù)方丹參滴丸對菌群失調(diào)的平衡作用。

溶血磷脂膽堿（Lysophosphatidylcholine， LysoPC）是磷酸卵磷酯（Phosphatidylcholine，PC）經(jīng)磷脂酶A2（PLA2）作用的裂解產(chǎn)物，PLA2能催化磷酸卵磷酯裂解產(chǎn)生游離脂肪酸，而脂肪酸是內(nèi)皮細胞和心肌細胞膜的重要成分，是心臟能量來源的主要物質(zhì)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)心肌梗死引起磷脂分解代謝紊亂，推測為AMI影響了PLA2的活性。相比Sham組，所測到的疾病狀態(tài)下含不同長度脂肪酸鏈LysoPC的變化趨勢并不統(tǒng)一，具體原因尚不明確，但在復(fù)方丹參滴丸組中均體現(xiàn)出回調(diào)趨勢，其中以LysoPC（16∶0）最為顯著。

膽酸是一種在肝臟中分泌合成的重要膽汁酸，屬于類固醇物質(zhì)。是一種強乳化劑，能促進小腸及肝臟中脂類的吸收代謝與排泄，并可以回到肝臟中被重新利用， 它與膽固醇平衡相關(guān)的關(guān)鍵酶調(diào)節(jié)密切相關(guān)。本研究中膽酸水平在治療組基本被調(diào)節(jié)至正常水平，證明復(fù)方丹參滴丸可能具有改善AMI帶來的膽汁酸代謝異常的功能。

油酸酰胺、棕櫚酰胺均屬于長鏈不飽和脂肪酰胺，是由機體自然產(chǎn)生內(nèi)源性物質(zhì)， 與情緒與睡眠障礙密切相關(guān)，屬于中樞神經(jīng)內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)，可與多個神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)相互作用[14]，受體激活可活化血小板、刺激血小板聚集， 并與多種心血管危險因子密切相關(guān)[15]，但分子作用機制尚不明確。在治療組中， 兩物質(zhì)含量水平下調(diào)，說明復(fù)方丹參滴丸的預(yù)給藥可以起到調(diào)節(jié)這類物質(zhì)代謝平衡的作用。

SM（d18∶1/16∶0）為鞘磷脂類物質(zhì)，來源于細胞膜周圍的一些神經(jīng)細胞軸突髓鞘，由磷酰膽堿及神經(jīng)酰胺經(jīng)鞘磷脂合成酶催化產(chǎn)生，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。其與AMI的相關(guān)作用機制還需要進一步研究。本研究結(jié)果表明， 治療組降低了AMI帶來的SM（d18∶1/16∶0）含量升高的狀況。

4 結(jié) 論

疾病的病理學(xué)變化常會導(dǎo)致機體的基礎(chǔ)代謝產(chǎn)生相應(yīng)改變，從而引起小分子代謝物的種類、濃度、比例等發(fā)生變化，最終造成個體間代謝輪廓的差異。代謝組學(xué)通過分析生物樣本中可以反映機體狀況的小分子內(nèi)源性代謝物，對藥物進行整體評價，適合于中藥復(fù)方多通路、多途徑的作用特點。

本研究采用LADCA法制作大鼠AMI模型，采用UPLCQTOF/MS方法對大鼠血漿樣本進行測定，以代謝組學(xué)為分析手段，研究在復(fù)方丹參滴丸給藥干預(yù)的情況下，AMI大鼠血漿中內(nèi)源性代謝物變化。結(jié)果表明，復(fù)方丹參滴丸可以對篩選到的22種AMI差異代謝物中的8種有明顯的回調(diào)作用，其通路涉及苯丙氨酸代謝、甘油磷脂代謝、鞘脂代謝、膽汁酸代謝及脂肪酸代謝， 表明復(fù)方丹參滴丸可以通過多通路、多途徑對AMI起到預(yù)保護的作用。

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Abstract An acute myocardial infarction rat model was established by ligation of the left ventricular coronary artery. Plasma samples of rats were collected and analyzed by ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole timeofflight mass spectrometry （UPLCQTOF/MS） to study the myocardial protection mechanism of compound Danshen dropping pill （CDDP）. After principal component analysis （PCA） and partial least squares discriminant analysis （PLSDA）， 22 metabolites were identified as potential biomarker of AMI. Furthermore， CDDP had remarkable effect on AMI rats. pTolyl sulfate， hippuric acid， equol 7Oglucuronide， lysoPC（16∶0）， cholic acid， oleamide， palmitic amide and SM（d18∶1/16∶0） were significantly changed in treatment group. The results showed that CDDP had a very good myocardial protection effect on AMI rats， and might influence the pathways of phenylalanine metabolism， glycerophospholipid metabolism， fatty acid metabolism， primary bile acid biosynthesis and Sphingolipid metabolism.

Keywords Compound Danshen dripping pills； Acute myocardial infarction； Metabolomics； Plasma

（Received 13 January 2017； accepted 11 April 2017）