黃瓜耐鎘相關(guān)基因CsNAC019的克隆及表達(dá)分析

李慧園，田春育，鄭玉瑩，武濤

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院/農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

黃瓜耐鎘相關(guān)基因CsNAC019的克隆及表達(dá)分析

李慧園，田春育，鄭玉瑩，武濤

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院/農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150030）

【目的】研究黃瓜耐鎘（Cd）分子機(jī)制，結(jié)合生物信息學(xué)分析獲得一個(gè) NAC轉(zhuǎn)錄因子家族基因CsNAC019，對(duì)其進(jìn)行克隆和表達(dá)分析，為進(jìn)一步將該基因用于黃瓜耐Cd品種的改良與選育提供試驗(yàn)基礎(chǔ)?！痉椒ā客ㄟ^PCR技術(shù)擴(kuò)增CsNAC019全長(zhǎng)；利用NCBI和DNAMAN進(jìn)行序列比對(duì)和保守結(jié)構(gòu)域分析；利用Expasy、TMHMM等在線軟件進(jìn)行氨基酸組成、穩(wěn)定系數(shù)、親水系數(shù)分析；通過 PlantCARE在線工具進(jìn)行啟動(dòng)子序列分析；采用MEGA 6.0軟件根據(jù)NJ方法，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)Cd脅迫后黃瓜CsNAC019在葉中的表達(dá)情況，并用DPS 7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件進(jìn)行方差及顯著性分析。【結(jié)果】CsNAC019含有典型的NAC保守結(jié)構(gòu)域。通過BLAST分析比對(duì)，該基因在氨基酸序列上與擬南芥NAC019存在60%的同源性，兩者在從N端到C端有A、B、C、D、E 5個(gè)氨基酸相對(duì)保守區(qū)的序列高度一致。該基因CDS序列全長(zhǎng)為960 bp，編碼319個(gè)氨基酸，編碼蛋白質(zhì)分子量為35.66 kD，理論等電點(diǎn)為8.72，不穩(wěn)定系數(shù)為68.18，平均親水系數(shù)為-0.483。啟動(dòng)子分析表明，除含有真核生物啟動(dòng)子固有的TATA和CAAT 元件外，CsNAC019的啟動(dòng)子序列還存在G-box、ABRE、W-box、P-box、TCA-element、TC-richrepeats、HSE等多種響應(yīng)逆境脅迫的順式元件。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，CsNAC019與甜瓜、桃、蘋果、柑桔、葡萄、大豆等15種植物NAC轉(zhuǎn)錄因子有64%—96%的同源性，其中與甜瓜的NAC蛋白同源性最高，為96%。通過qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，CsNAC019在Cd脅迫條件下表達(dá)量明顯上調(diào)（8.2倍）。【結(jié)論】CsNAC019為黃瓜Cd脅迫誘導(dǎo)表達(dá)基因，推測(cè)其可能通過調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)調(diào)控黃瓜對(duì)Cd脅迫的應(yīng)答。

黃瓜；Cd；CsNAC019；基因克?。槐磉_(dá)分析

0 引言

【研究意義】黃瓜（Cucumis sativus L.）是中國(guó)設(shè)施蔬菜生產(chǎn)中的主要栽培作物之一，由于溫室大棚內(nèi)化肥、農(nóng)藥等的連年使用，黃瓜易受到重金屬的毒害，其中，鎘（Cd）污染較為嚴(yán)重。近些年，Cd污染事件頻發(fā)，例如，2009年8月在湖南瀏陽以及2012 年1月在廣西龍?jiān)闯霈F(xiàn)的Cd污染事件等。Cd是生態(tài)系統(tǒng)中危害最大的重金屬之一[1]，具有分解周期長(zhǎng)、移動(dòng)性大、毒性高、難降解等特點(diǎn)，在生產(chǎn)活動(dòng)中容易被作物吸收富集，不僅嚴(yán)重影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，而且可以通過食物鏈在人體中積累危害人體健康[2]。黃瓜對(duì)重金屬敏感、運(yùn)輸效率高，是研究重金屬污染的可行材料[3]。近幾年，隨著工業(yè)進(jìn)程的快速發(fā)展，Cd進(jìn)入生態(tài)系統(tǒng)危害人類健康的現(xiàn)象日益嚴(yán)重[4]，直接危害人類的健康。就中國(guó)而言，受污染區(qū)域已多達(dá)11個(gè)省市的 25個(gè)地區(qū)[5]。因此，有效提高黃瓜的耐Cd能力、培育出耐Cd品種、減少Cd的危害對(duì)食品安全問題具有重大意義。此外，國(guó)家有關(guān)食品中 Cd限量指標(biāo)包括黃瓜在內(nèi)的蔬菜標(biāo)準(zhǔn)是 0.05 mg·kg-1（GB 2762—2005），因此，耐Cd黃瓜品種除了要在Cd污染環(huán)境下保持較好的生長(zhǎng)勢(shì)和產(chǎn)量之外，還需要保證黃瓜果實(shí)內(nèi)Cd含量低于0.05 mg·kg-1，以保證食品安全?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前關(guān)于植物耐 Cd機(jī)制的研究表明，植物可通過區(qū)域化、固定鈍化及形成金屬硫蛋白、植物螯合肽、應(yīng)急作用、排外作用等來抵抗或減弱Cd的毒害程度[6]。WEBER等[7]研究發(fā)現(xiàn)，AtPME3的過表達(dá)能夠顯著增強(qiáng)擬南芥對(duì)Zn、Cd離子的敏感性。BHUIYAN等[8]、SHIGAKI等[9]和ARAZI 等[10]研究發(fā)現(xiàn)ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因、擬南芥中的CAX、煙草中的NtCBP4等。目前已鑒定的金屬陽離子運(yùn)載蛋白家族主要有CDF家族、ZIP家族、NRAMP家族、重金屬ATPases家族、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族等[6]。此外研究表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子是至今發(fā)現(xiàn)的植物基因組中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，NAC轉(zhuǎn)錄因子不僅參與植物的多個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程如種子萌發(fā)、頂端分生組織的形成、細(xì)胞次生根的合成、次生壁的合成、開花、衰老、側(cè)根形成等，還參與植物對(duì)生物以及非生物脅迫的響應(yīng)[5,11-17]。NAC轉(zhuǎn)錄因子直接參與或通過調(diào)控參與干旱、高鹽應(yīng)答基因的表達(dá)，在植物抗干旱、高鹽等非生物逆境脅迫中起重要作用。前人研究證明，水稻SNAC1、OsNAC6/SNAC2、OsNAC5、OsNAC10、OsNAC045以及擬南芥ATAF1、ANAC019、ANAC055 和ANAC072/ RD26均能夠響應(yīng)干旱、高鹽、高溫脅迫[18-20]。NAC019在番茄中同源轉(zhuǎn)錄因子為L(zhǎng)eJA2和SlNAC019，LeJA2作為一個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞特異定位的轉(zhuǎn)錄因子，通過直接調(diào)控脫落酸（ABA）合成相關(guān)基因的表達(dá)參與番茄的抗逆反應(yīng)[21]；而SlNAC019則作用于番茄茉莉酸信號(hào)通路中，作為一個(gè)次級(jí)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控抗蟲和抗病相關(guān)基因的表達(dá)[22]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】為了研究黃瓜耐Cd脅迫分子機(jī)制，前期對(duì)擬南芥NAC轉(zhuǎn)錄因子家族耐逆基因進(jìn)行分析[23-26]，根據(jù)基因表達(dá)模式以及與黃瓜基因組同源比對(duì)結(jié)果，對(duì)潛在的黃瓜耐Cd相關(guān)基因進(jìn)行篩選，結(jié)果表明，NAC019可能參與Cd脅迫響應(yīng)。通過同源比對(duì)得知，CsNAC019與NAC019蛋白有較高的同源性，推測(cè)CsNAC019在功能上與NAC019具有一定的相似性。雖然NAC019 等NAC轉(zhuǎn)錄因子的抗逆性研究已有報(bào)道，但是NAC轉(zhuǎn)錄因子參與 Cd等重金屬脅迫響應(yīng)的相關(guān)研究的報(bào)道較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究對(duì)黃瓜CsNAC019進(jìn)行分離，獲得該基因全長(zhǎng)CDS序列，并闡述該基因的蛋白結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化情況及對(duì)啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，并研究其在 Cd脅迫下基因的表達(dá)情況，對(duì)CsNAC019參與Cd脅迫下的機(jī)理提出假說，為研究黃瓜耐Cd的分子機(jī)制和耐Cd的黃瓜新品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試材料為黃瓜 649。大腸桿菌 DH5α菌株、pEASY-T1克隆載體、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和Taq DNA Polymerase購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)（TransGen Biotech）有限公司；Trizol購(gòu)自Invitrogen公司；SYBR Green PCR Master Mix熒光定量試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)自東洋紡（TOYOBO）公司；測(cè)序由北京金唯智生物科技有限公司完成；其他生化試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

浸種催芽后，黃瓜種子于人工氣候室（晝夜溫度為26℃/18℃，光周期為16 h/8 h，平均濕度為60%—70%）中進(jìn)行播種培養(yǎng)，使用全蛭石為基質(zhì)，澆灌營(yíng)養(yǎng)液栽培。待其播種后5 d（子葉展平）時(shí)進(jìn)行水培，用含有CdCl2（300 μmol·L-1）的營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行處理，基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)液配方（1.512 mmol·L-1NaH2PO4·2H2O、0.257 mmol·L-1Na2HPO4·12H2O、1.5 mmol·L-1MgSO4·7H2O、4 mmol·L-1Ca(NO3)2·4H2O、6 mmol·L-1KNO3、8.6 μmol·L-1C10H12FeN2NaO8·3H2O、10.3 μmol·L-1MnSO4、1 μmol·L-1CuSO4·5H2O、30 μmol·L-1H3BO3、24 nmol·L-1Na6Mo7O24·4H2O和130 nmol·L-1CoCl2·6H2O）參考文獻(xiàn)[27]，用KCl和KNO3調(diào)整營(yíng)養(yǎng)液中K+和Ca2+的平衡。在播種后12 d采摘第1片真葉，取5株長(zhǎng)勢(shì)一致的黃瓜作為重復(fù)，液氮速凍后，存放于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取及cDNA第一鏈合成

采用Trizol法提取各部位總RNA，用分光光度計(jì)檢測(cè)吸光度及濃度；cDNA第一鏈的合成使用TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒，具體操作按照說明書進(jìn)行。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

以黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中序列號(hào)為Csa3M852470.1的基因CDS序列為模板，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)克隆引物和qRT-PCR引物（表1）。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 本研究所用引物Table 1 The primers used in the study

1.4 CsNAC019的克隆與序列分析

以649黃瓜葉片cDNA為模板，利用PCR技術(shù)進(jìn)行 CsNAC019的克隆，20 μL反應(yīng)體系包括10×TaqBuffer 2 μL、dNTP Mix 2 μL、CsNAC019-F（10 μmol·L-1）和CsNAC019-R（10 μmol·L-1）各0.5 μL、TaqDNA聚合酶（5 U·μL-1）0.2 μL、模板cDNA（約200 ng·μL-1）2 μL和ddH2O 12.8 μL。反應(yīng)條件為96 ℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 60 s，28個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并進(jìn)行目的條帶的回收，與pEASY-T1克隆載體連接，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，菌液鋪平板37℃培養(yǎng)過夜，挑斑，搖菌。再進(jìn)行質(zhì)粒提取，酶切鑒定后送陽性樣本測(cè)序。

利用NCBI在線Blast下載不同植物中NAC蛋白序列，進(jìn)行多重序列比對(duì)后導(dǎo)入 MEGA 6.0（http:// www.megasoftware.net/history.php），根據(jù)NJ方法（執(zhí)行參數(shù)：Bootstrap method 1000；Poissonmodel；Pairwise deletion）分析，進(jìn)而構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。利用DNAMAN、DNAStar進(jìn)行序列比對(duì)和分析。利用在線軟件Expasy、TMHMM等進(jìn)行氨基酸組成、穩(wěn)定系數(shù)、親水系數(shù)等分析。

1.5 CsNAC019的啟動(dòng)子序列分析

從黃瓜基因數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取CsNAC019的啟動(dòng)子區(qū)域，即開放閱讀框上游的1 500 bp，使用在線工具 PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/）分析啟動(dòng)子區(qū)域的順式作用元件。

1.6 Cd脅迫條件下的表達(dá)分析

以300 μmol·L-1Cd處理的植株葉cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)體系為20 μL，包括SYBR Green PCR Master Mix 10 μL、CsNAC019-qF（10 μmol·L-1）和CsNAC019-qR（10 μmol·L-1）各0.5 μL，cDNA（約150 ng·μL-1）1 μL和ddH2O 8 μL。反應(yīng)條件為96℃ 1 min；95℃ 15 s；56℃ 15 s；72℃ 45 s，45個(gè)循環(huán)，以CsEF1α作為參照基因（表1）。

采用 2-ΔΔCT相對(duì)定量分析方法計(jì)算出基因的相對(duì)表達(dá)量，并用DPS 7.05數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件進(jìn)行方差及顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 黃瓜耐Cd脅迫相關(guān)基因CsNAC019的獲得

通過對(duì)前期擬南芥NAC轉(zhuǎn)錄因子家族耐逆基因進(jìn)行分析，根據(jù)基因表達(dá)模式以及與黃瓜基因組同源比對(duì)結(jié)果，對(duì)潛在的黃瓜耐Cd相關(guān)基因進(jìn)行篩選，同時(shí)確保與重金屬相關(guān)的該基因功能沒有被報(bào)道，初步確定了擬南芥 NAC轉(zhuǎn)錄因子 NAC019作為研究對(duì)象。然后利用 DNAMAN軟件，對(duì)CsNAC019和NAC019的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，同源性為60%。NAC轉(zhuǎn)錄因子具有顯著的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，即蛋白的N端含有高度保守約150個(gè)氨基酸組成的NAC結(jié)構(gòu)域，NAC結(jié)構(gòu)域從N端到C端包含5個(gè)保守的亞結(jié)構(gòu)域A、B、C、D、E。兩者序列比對(duì)結(jié)果分析顯示A、B、C、D、E 5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域氨基酸相對(duì)保守區(qū)的序列高度一致（圖 1）。由于序列的相似性可推斷功能也具有一定的相似性，最終確定NAC019在黃瓜中的同源基因 CsNAC019作為試驗(yàn)研究對(duì)象。

2.2 黃瓜耐Cd脅迫相關(guān)基因CsNAC019的克隆

以300 μmol Cd處理的黃瓜葉片cDNA為模板，CsNAC019-F和CsNAC019-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出1條約960 bp的亮帶（圖2），回收目標(biāo)條帶，并與pEASY-T1克隆載體連接，送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，結(jié)果與黃瓜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)Csa3M852470.1基因編碼區(qū)序列完全一致。

圖1 CsNAC019與NAC019保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸比較Fig. 1 Alignments of NAC domain between CsNAC019 and NAC019

2.3 黃瓜耐Cd脅迫相關(guān)基因CsNAC019的序列分析

CsNAC019的cDNA序列及其推導(dǎo)氨基酸組成如圖3所示，共編碼319個(gè)氨基酸。利用NCBI對(duì)該基因的氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，其蛋白屬于NAM superfamily超基因家族之一（圖4）。經(jīng)過在線軟件Expasy-ProtParam（http://www.expasy.org/）分析該基因所編碼蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果表明，預(yù)測(cè)的CsNAC019蛋白的分子量為35.66 kD，理論等電點(diǎn)為8.72，不穩(wěn)定系數(shù)為 68.18，平均親水系數(shù)為-0.483，因此其屬于不穩(wěn)定型的疏水蛋白。利用 TMHMM Server v. 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)預(yù)測(cè)表明：CsNAC019蛋白不具有跨膜蛋白結(jié)構(gòu)。

圖2 CsNAC019的擴(kuò)增Fig. 2 Amplification of the CsNAC019 gene

圖3 CsNAC019的CDS序列及其氨基酸序列Fig. 3 Nucleotide and amino acid sequence of CsNAC019

圖4 CsNAC019蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig. 4 Conserved domain of CsNAC019 protein

2.4 黃瓜耐Cd脅迫相關(guān)基因CsNAC019啟動(dòng)子順式元件分析

利用Plantcare 對(duì) CsNAC019起始密碼子上游1 500 bp的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行分析（表2），結(jié)果表明，除含有真核生物啟動(dòng)子固有的TATA和CAAT元件外，還包含1個(gè)G-box光響應(yīng)元件、1個(gè)ABREABA響應(yīng)元件、2個(gè)W-box真菌誘導(dǎo)響應(yīng)元件、1個(gè)P-box赤霉素響應(yīng)元件、3個(gè)TCA-element水楊酸響應(yīng)元件、2個(gè)TC-richrepeats、2個(gè)HSE熱脅迫響應(yīng)元件等多種響應(yīng)逆境脅迫的順式元件。

表2 CsNAC019啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件分布及功能Table 2 Distribution and function of cis-acting elements in CsNAC019 promoter

2.5 黃瓜耐Cd脅迫相關(guān)基因CsNAC019系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用DNAMAN 8.0軟件翻譯獲得CsNAC019的氨基酸序列，在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該蛋白與梅花、桃、蘋果等15種植物NAC轉(zhuǎn)錄因子有64%—96%的同源性，其中與甜瓜的 NAC蛋白同源性最高，為 96%。將CsNAC019與這 15條轉(zhuǎn)錄因子序列進(jìn)行多重比較并利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。這16條蛋白序列明顯地聚類為2組，CsNAC019與甜瓜、大豆為第一類，其中，黃瓜與甜瓜同屬葫蘆科甜瓜屬作物，親緣關(guān)系最近；而梅花和桃等則為第二類（圖5）。

2.6 黃瓜耐Cd脅迫相關(guān)基因CsNAC019的表達(dá)分析

利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)CsNAC019在Cd脅迫條件下葉片中的表達(dá)情況進(jìn)行分析（圖 6）。結(jié)果表明，與對(duì)照相比，CsNAC019在Cd脅迫條件下的表達(dá)量上調(diào)明顯，提高了8.2倍。

3 討論

圖5 CsNAC019蛋白與其他植物NAC蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig. 5 Phylogentic tree of CsNAC019 and some other NAC proteins

圖6 CsNAC019在Cd脅迫誘導(dǎo)后的相對(duì)表達(dá)量Fig. 6 The relative expression of CsNAC019 under Cd stress

本研究利用生物信息學(xué)方法得到NAC019在黃瓜中的同源基因 CsNAC019。通過對(duì) Cd脅迫下黃瓜CsNAC019表達(dá)的分析，該基因的表達(dá)受Cd脅迫的誘導(dǎo)，這些耐Cd基因是植物在逆境下增強(qiáng)耐性的重要分子基礎(chǔ)。利用PCR克隆技術(shù)，成功獲得Cd相關(guān)基因CsNAC019的CDS全長(zhǎng)。通過保守結(jié)構(gòu)域分析表明，該基因編碼的蛋白是植物NAM superfamily超基因家族蛋白；在啟動(dòng)子序列分析中，發(fā)現(xiàn)多個(gè)與逆境響應(yīng)有關(guān)的重要元件，如ABRE、ARE、HSE等。ABRE、G-box都是ABA誘導(dǎo)啟動(dòng)子表達(dá)的順式作用元件[28-29]。該基因其氨基酸序列與其他植物 NAC轉(zhuǎn)錄因子編碼的氨基酸序列同源性較高，其中，與同屬葫蘆科的甜瓜同源性最高。

NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的一類轉(zhuǎn)錄因子，目前已在擬南芥、水稻、小麥等20多種植物中發(fā)現(xiàn)了NAC轉(zhuǎn)錄因子[30]，NAC轉(zhuǎn)錄因子具有顯著的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，即蛋白的N端含有高度保守的約150個(gè)氨基酸組成的NAC結(jié)構(gòu)域。同時(shí)，NAC結(jié)構(gòu)域包含5個(gè)保守的亞結(jié)構(gòu)域A、B、C、D、E，其中亞結(jié)構(gòu)域的功能可能與結(jié)合 DNA和參與發(fā)育時(shí)期調(diào)控等有關(guān)[31-32]。NAC基因家族中的很多成員在植物對(duì)非生物逆境脅迫反應(yīng)中存在差異表達(dá)特征，這種在非生物逆境脅迫反應(yīng)中的差異表達(dá)可能反映了 NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物抗非生物脅迫中具有一定的生物學(xué)功能。當(dāng)植物處于干旱、高鹽的脅迫下，植物細(xì)胞會(huì)感知外界的脅迫信號(hào)，通過一系列復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)途徑如ABA信號(hào)途徑，把信號(hào)傳遞到脅迫應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子，由各類轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)脅迫應(yīng)答反應(yīng)基因表達(dá)，從而激活植物抗逆反應(yīng)，降低或消除干旱、高鹽逆境所造成的傷害。干旱、高鹽等逆境脅迫或ABA能誘導(dǎo)NAC019編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[6]。此外，NAC蛋白還會(huì)與其他蛋白發(fā)生互作，在擬南芥中NAC019能在體外或者體內(nèi)特異地與CATGTG序列結(jié)合，并激活報(bào)告基因 GUS的轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，NAC019能與ZFHD1蛋白直接結(jié)合，這種結(jié)合是激活下游基因轉(zhuǎn)錄所必需的[33-34]。

現(xiàn)有研究表明，植物通過不同的機(jī)制，例如區(qū)域化、固定鈍化及形成金屬硫蛋白、植物螯合肽、應(yīng)急作用、排外作用等來抵抗或減弱 Cd的毒害程度[6]。目前，盡管NAC轉(zhuǎn)錄因子在不同作物中已有了較為廣泛的研究，但是關(guān)于該基因?qū)χ亟饘夙憫?yīng)的研究尚不明確。本研究對(duì)CsNAC019在Cd脅迫條件下的表達(dá)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該基因在 300 μmol·L-1Cd脅迫下表達(dá)量顯著上調(diào)，這說明該基因是響應(yīng)Cd脅迫后上調(diào)表達(dá)的基因。CsNAC019通過激活A(yù)BA通路來抵抗干旱、高鹽等逆境脅迫的機(jī)理已研究的比較清楚，也暗示 Cd脅迫可能激發(fā)了CsNAC019的上調(diào)表達(dá)，從而激活了一系列復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)途徑如ABA信號(hào)途徑，把信號(hào)傳遞到脅迫應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子，由各類轉(zhuǎn)錄因子啟動(dòng)脅迫應(yīng)答反應(yīng)基因表達(dá)，從而激活植物抗逆反應(yīng)，降低或消除Cd逆境所造成的傷害。

目前，關(guān)于黃瓜耐 Cd相關(guān)基因的報(bào)道較少。本研究通過克隆獲得CsNAC019，在Cd脅迫條件下，與對(duì)照相比，該基因表達(dá)顯著上調(diào)，這一結(jié)論將為后續(xù)研究黃瓜耐 Cd生理及分子機(jī)制提供思路和線索，也將為下一步利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育黃瓜耐 Cd新品種奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

從黃瓜Cd脅迫條件下的葉片中分離出NAC轉(zhuǎn)錄因子家族基因CsNAC019，全長(zhǎng)為960 bp，編碼319個(gè)氨基酸，編碼蛋白質(zhì)分子量為35.66 kD。該基因?yàn)橐粋€(gè)新的Cd脅迫誘導(dǎo)表達(dá)基因，推測(cè)其可能通過調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)來調(diào)控黃瓜對(duì)Cd脅迫的應(yīng)答。

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（責(zé)任編輯 李莉）

Cloning and Expression Analysis of Cadmium Tolerance Related Gene CsNAC019 in Cucumber

LI HuiYuan, TIAN ChunYu, ZHENG YuYing, WU Tao
(Horticultural and Landscape Architecture College, Northeast Agricultural University/Key Laboratory of Biology and Germplasm Creation for Horticultural Crops, Harbin 150030)

【Objective】 To understand the molecular mechanism of Cd tolerance in cucumber, a NAC transcription factor CsNAC019 was obtained by using bioinformatics analysis. CsNAC019 was cloned and its expression was analyzed under Cd stress. The results of the present study will provide an experimental foundation for breeding of cucumber cultivars with high capacity for Cd tolerance.【Method】The full length sequence of CsNAC019 was cloned by PCR. Sequence comparison and conserved domain were analyzed by NCBI and DNAMAN. Amino acid composition, stability coefficient, and hydrophilic coefficient were analyzed by online software Expasy and TMHMM. The promoter region was analyzed by online software PlantCARE. Phylogenic tree was constructed by MEGA 6.0 according to the NJ method. The real-time PCR (qRT-PCR) was used to analyze the expression pattern of CsNAC019 under Cd treatments. The variance and significance were analyzed by DPS 7.05.【Result】CsNAC019 contained a typical conserved NAC domain. BLAST analysis revealed that CsNAC019 had 60% homology with NAC019 in the amino acid sequence, and the five relatively conserved regions of its amino acid sequences, A, B, C, D and E, were highly consistent between them from the N-terminal to the C-terminal. The full-length CDS of CsNAC019 was 960 bp, which encoded 319 amino acids with a molecular weight of 35.66 kD. The theoretical isoelectric point is 8.72, the instability coefficient is 68.18, and the average hydrophilic coefficient is -0.483. Besides the eukaryotic promoter TATA and CAAT natural elements, promoter analysis showed that the promoter sequence of CsNAC019 also had cis elements in response to stress, such as G-box, ABRE, W-box, P-box, TCA-element, TC-richrepeats, and HSE, etc. Phylogenetic analysis showed that CsNAC019 had 64%-96% homology with NAC transcription factors of other 15 plants (melon, peach, apple, citrus, grape and soybean, etc). CsNAC019 had the highest homology, 96%, with the NAC sequence of melon. qRT-PCR analysis revealed that the expression of CsNAC019 was significantly increased (8.2 folds) compared with the control under Cd tolerance condition.【Conclusion】CsNAC019 is a Cd tolerance induced gene. It was speculated that CsNAC019 may regulate the cucumber to response to Cd tolerance by regulating the expression of downstream genes.

cucumber; Cd; CsNAC019; gene clone; expression analysis

2016-11-25；接受日期：2017-03-06

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（31101545）、黑龍江省普通本科高等學(xué)校青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃（UNPYSCT-201500）、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)“青年才俊”項(xiàng)目（14QC07）、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)“學(xué)術(shù)骨干”項(xiàng)目（16XG05）

聯(lián)系方式：李慧園，E-mail：tarasland@163.com。通信作者武濤Tel：0451-55190214；E-mail：wutao@neau.edu.cn