三倍體無籽西瓜子葉節(jié)再生體系建立與嫁接育苗技術(shù)探究

閔子揚(yáng)，阮萬輝，張屹，朱菲瑩，肖姬玲，李基光，劉建雄，梁志懷

（湖南省西瓜甜瓜研究所長沙410125）

三倍體無籽西瓜子葉節(jié)再生體系建立與嫁接育苗技術(shù)探究

閔子揚(yáng)，阮萬輝，張屹，朱菲瑩，肖姬玲，李基光，劉建雄，梁志懷

（湖南省西瓜甜瓜研究所長沙410125）

以三倍體無籽西瓜品種‘超庭三號(hào)’子葉節(jié)為外植體，對(duì)影響子葉節(jié)離體再生及嫁接育苗技術(shù)的關(guān)鍵因子進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，3%的次氯酸鈉溶液消毒18 min是三倍體無籽西瓜種胚消毒的最佳方式；2.5 mg·L-16-BA+ 0.1 mg·L-1NAA是誘導(dǎo)三倍體無籽西瓜子葉節(jié)產(chǎn)生不定芽的最佳激素組合，不定芽分化系數(shù)最高達(dá)6.11；0.2 mg·L-1KT能有效誘導(dǎo)不定芽伸長；將長度為2.5 cm的接穗嫁接到子葉剛展平的南瓜砧木上，成活率高達(dá)84.40%。試驗(yàn)成功建立了三倍體無籽西瓜子葉節(jié)再生及嫁接育苗技術(shù)體系。

無籽西瓜；三倍體；子葉節(jié)；再生體系；嫁接

中國是世界上西瓜（Citrullus lanatus）生產(chǎn)與消費(fèi)第一大國[1]，市場潛力巨大，其中三倍體無籽西瓜具有比普通二倍體西瓜糖度更高、食用更加方便、宜于機(jī)械化采收、區(qū)域流動(dòng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[2]，更加契合我國西瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的需求，因此逐年受到人們的重視。但是，三倍體無籽西瓜生產(chǎn)中存在采種量低、發(fā)芽率低、成苗率低的“三低”問題，導(dǎo)致三倍體無籽西瓜種子價(jià)格昂貴、育苗技術(shù)性強(qiáng)，嚴(yán)重制約我國無籽西瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。組織培養(yǎng)技術(shù)的快速發(fā)展為打破三倍體無籽西瓜“三低”問題帶來了曙光，利用該技術(shù)可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量優(yōu)質(zhì)無籽西瓜試管苗，大大簡化三倍體無籽西瓜繁瑣的育苗程序，降低生產(chǎn)成本，帶來顯著的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

前人關(guān)于三倍體無籽西瓜子葉節(jié)再生及嫁接育苗的研究已有報(bào)道，研究內(nèi)容主要集中在外植體的選擇、誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選等方面，但建立的再生體系并不完善，存在誘導(dǎo)出芽率低、受外植體基因型影響大、再生植株移栽成活困難等問題[3-5]。筆者在建立高效不定芽誘導(dǎo)體系的基礎(chǔ)上，對(duì)所得不定芽不進(jìn)行生根誘導(dǎo)而是直接進(jìn)行嫁接，目的是建立一套穩(wěn)定、高效的三倍體無籽西瓜子葉節(jié)再生及嫁接育苗技術(shù)體系，以期在降低三倍體無籽西瓜生產(chǎn)用種量、簡化育苗程序、工廠化生產(chǎn)嫁接苗、提高品種純度等方面奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為西瓜基因工程相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試三倍體無籽西瓜品種為‘超庭三號(hào)’，購于新疆科世達(dá)種業(yè)有限公司，該品種生長勢強(qiáng)健，瓤黃色，品質(zhì)優(yōu)良，單瓜質(zhì)量7～11 kg；砧木為西瓜嫁接專用品種‘白籽南瓜’。試驗(yàn)于2015年9月在湖南省西瓜甜瓜研究所組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，嫁接后植株置于嫁接愈合室直至植株成活。

1.2 方法

1.2.1 消毒時(shí)間對(duì)種胚污染率和發(fā)芽率的影響選取質(zhì)量較好的‘超庭三號(hào)’無籽西瓜種子，小心剝?nèi)シN殼并盡量不傷及種胚，首先在25℃的恒溫水中浸種4～6 h，然后將其在超凈工作臺(tái)上用75%的酒精表面消毒30 s、無菌水沖洗3次，再置于3%的次氯酸鈉溶液中分別消毒12、15、18、21 min，以觀察不同消毒時(shí)間對(duì)種胚污染率和發(fā)芽率的影響。消毒期間不斷攪拌以加強(qiáng)消毒效果，無菌水沖洗5～6次后用無菌濾紙吸干種胚表面水分，接種到不添加任何激素的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行暗培養(yǎng)4 d，待種胚發(fā)芽后轉(zhuǎn)入光下培養(yǎng)，光周期為16 h光照/8 h黑暗，光強(qiáng)2 500 lx，整個(gè)培養(yǎng)期間一直處于（25±1）℃的溫度條件下。以上各項(xiàng)每處理均接種30粒種胚，3次重復(fù)。

1.2.2 不同激素組合對(duì)三倍體無籽西瓜不定芽誘導(dǎo)及伸長的影響以光培養(yǎng)2 d的三倍體無籽西瓜種胚為材料，整體切取其子葉節(jié)部分為外植體[6]，將其接種于不同質(zhì)量濃度6-BA（2.00、2.50、3.00 mg·L-1）和NAA（0.05、0.10、0.15 mg·L-1）組成的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，探究誘導(dǎo)不定芽增殖的最佳激素組合；將誘導(dǎo)出的不定芽切割成單芽，接種于含不同質(zhì)量濃度的NAA（0.10、0.20、0.30 mg·L-1）或KT（0.10、0.20、0.30 mg·L-1）的培養(yǎng)基中，探究適宜于不定芽伸長的最佳培養(yǎng)基。不定芽誘導(dǎo)及伸長過程中，均以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，pH值5.8，添加30 g·L-1的蔗糖、7 g·L-1的瓊脂粉，整個(gè)培養(yǎng)期間均置于光照16 h·d-1，光強(qiáng)2 500 lx，溫度（25±1）℃的環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率，不定芽轉(zhuǎn)接14 d后記錄不定芽伸長效果。以上各項(xiàng)每處理均接種20個(gè)外植體，3次重復(fù)。

1.2.3 影響嫁接成活因素的探究采用頂插接的方法，將經(jīng)過適應(yīng)性鍛煉后、長度不同（2.0、2.5、3.0 cm）的單個(gè)不定芽嫁接到子葉剛展平的南瓜砧木上，以探究試管苗大小對(duì)嫁接成活率的影響。將嫁接苗置于嫁接愈合室中，前3 d嚴(yán)格蓋膜以保持濕度100%，白天溫度（27±1）℃，夜間溫度（25±1）℃，5～6 d后逐漸通風(fēng)降溫，其他同嫁接苗常規(guī)管理，長出新葉后視為嫁接成活。以上各項(xiàng)每處理取嫁接苗30株，3次重復(fù)，14 d后統(tǒng)計(jì)不同處理間嫁接成活率。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析以上試驗(yàn)取得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)按下列公式計(jì)算污染率等指標(biāo)。

污染率/%=（污染外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)）× 100；

不定芽誘導(dǎo)率/%=（出芽外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100；

不定芽分化系數(shù)/%=（形成不定芽總個(gè)數(shù)/出芽外植體總數(shù)）×100；

建設(shè)智慧校園旨在推動(dòng)下一代數(shù)字技術(shù)在智慧校園建設(shè)中的創(chuàng)新應(yīng)用，改造和優(yōu)化現(xiàn)行校園網(wǎng)絡(luò)環(huán)境，構(gòu)建高速泛在、智能靈活、開放共享、安全可靠的校園信息環(huán)境。2015年以來，學(xué)校啟動(dòng)了智慧校園建設(shè)，并將智慧校園建設(shè)列入學(xué)?！笆濉币?guī)劃重點(diǎn)項(xiàng)目，設(shè)立智慧校園建設(shè)專職系統(tǒng)集成、軟件研發(fā)和推廣團(tuán)隊(duì)，保障智慧校園試點(diǎn)項(xiàng)目順利實(shí)施。

嫁接成活率/%=（嫁接成活植株數(shù)/總嫁接植株數(shù)）×100；

采用SPSS 17.0軟件對(duì)以上各數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和Duncan’s多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒時(shí)間對(duì)三倍體無籽西瓜種胚污染率及發(fā)芽率的影響

外植體用75%的酒精消毒30 s后，再用不同時(shí)間的3%次氯酸鈉溶液消毒，以探究最佳消毒方式。從表1中可以看出，當(dāng)消毒時(shí)間為12 min時(shí)，污染率高達(dá)63.33%，與其他處理之間存在顯著差異；雖然剩余未污染外植體萌芽率較高，但由于大部分外植體已經(jīng)污染，其總體萌芽率處于所有處理的最低值，為31.13%，顯著低于其他處理。隨著消毒時(shí)間延長，外植體的污染率逐漸降低，當(dāng)消毒時(shí)間達(dá)到21 min時(shí)，污染率降為0，但是此時(shí)次氯酸鈉溶液對(duì)種胚的毒害作用同樣加強(qiáng)，導(dǎo)致種胚的萌芽率只有64.40%，顯著低于消毒18 min時(shí)。消毒時(shí)間為18 min時(shí)，外植體污染率僅為2.22%，與消毒21 min時(shí)差異不顯著，消毒效果較好，并且此時(shí)種胚萌芽率在所有處理中達(dá)到最高值，為82.21%，顯著高于其他處理。綜上分析認(rèn)為，在3%的次氯酸鈉溶液中消毒18 min，是三倍體無籽西瓜種胚消毒的最佳方式。

表1 不同消毒時(shí)間對(duì)三倍體無籽西瓜種胚污染率及發(fā)芽率的影響

2.2 不同激素組合對(duì)不定芽增殖的影響

外源激素是誘導(dǎo)西瓜子葉節(jié)產(chǎn)生不定芽的必要物質(zhì)，其種類及配比對(duì)不定芽誘導(dǎo)率和分化系數(shù)起決定性作用。

由表2可知，NAA質(zhì)量濃度一定時(shí)，隨著6-BA質(zhì)量濃度的增加，不定芽誘導(dǎo)率和分化系數(shù)均逐漸升高，當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為3.0 mg·L-1時(shí)，不定芽誘導(dǎo)率最高，達(dá)85.02%，分化系數(shù)6.03，但其與6-BA質(zhì)量濃度為2.5 mg·L-1時(shí)的不定芽誘導(dǎo)率和分化系數(shù)之間差異不顯著，均處于較高水平，但6-BA質(zhì)量濃度3.0 mg·L-1時(shí)誘導(dǎo)出的芽大部分為葉叢芽，沒有莖的產(chǎn)生，不利于后期單芽的伸長及嫁接，故6-BA質(zhì)量濃度為2.5 mg·L-1時(shí)較適宜不定芽的誘導(dǎo)。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度一定時(shí)，隨著NAA質(zhì)量濃度的增加，不定芽誘導(dǎo)率呈先增后降的趨勢，說明低質(zhì)量濃度的NAA有利于不定芽的生長，但質(zhì)量濃度過高時(shí)則抑制其生長。在與6-BA組合使用過程中發(fā)現(xiàn)，NAA質(zhì)量濃度為0.1 mg·L-1時(shí)不定芽誘導(dǎo)率均呈現(xiàn)出明顯優(yōu)勢，因此NAA質(zhì)量濃度0.1 mg·L-1較適宜西瓜不定芽的誘導(dǎo)。綜上分析，2.5 mg·L-16-BA+ 0.1 mg·L-1NAA是誘導(dǎo)三倍體無籽西瓜子葉節(jié)產(chǎn)生不定芽的最佳激素組合（圖1-A）。

表2 不同激素組合對(duì)誘導(dǎo)分化不定芽的影響

2.3 不同激素對(duì)不定芽伸長的影響

分別使用3種不同質(zhì)量濃度的NAA或KT進(jìn)行不定芽伸長誘導(dǎo)試驗(yàn)，結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度的NAA或KT均能誘導(dǎo)不定芽的伸長，但是以NAA進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)不定芽生長速度緩慢，基部出現(xiàn)愈傷化不定根并隨著NAA質(zhì)量濃度的增加愈傷化程度逐漸加重（圖1-B），不利于后期嫁接；以KT進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，不定芽生長迅速、莖稈健壯且基部無愈傷組織形成（圖1-C），后期嫁接成活率高，其質(zhì)量濃度以0.2 mg·L-1較為適宜，過高時(shí)不定芽生長瘦弱，不利于成活。

2.4 接穗長度對(duì)嫁接成活率的影響

由表3可知，接穗長度為2.5 cm時(shí)，嫁接成活率最高，達(dá)84.40%，與其他2種接穗長度之間存在顯著差異。接穗長度為2.0 cm左右時(shí)生長勢較弱，木質(zhì)化程度低，維管束發(fā)育不完全，不能很好的跟砧木貼合，導(dǎo)致嫁接成活率較低。接穗長度為3.0 cm左右時(shí)，不定芽生長時(shí)間較長且莖稈較粗，不易插入砧木，同樣影響成活率。本試驗(yàn)沒有進(jìn)行砧木大小對(duì)嫁接成活率影響的研究，主要因?yàn)槟瞎险枘镜南屡咻S很容易出現(xiàn)中空現(xiàn)象，砧木苗齡過大時(shí)嫁接成活率急劇降低。綜上認(rèn)為，接穗長度為2.5 cm時(shí)嫁接到子葉剛展平的南瓜砧木上是三倍體無籽西瓜組培苗適宜的嫁接條件（圖1-D）。

圖1 子葉節(jié)誘導(dǎo)出芽及嫁接成活過程

表3 不同接穗長度對(duì)嫁接成活率的影響

3 討論與結(jié)論

在三倍體無籽西瓜再生體系建立的過程中，可使用的外植體種類很多，目前已報(bào)道的有莖尖、芽、下胚軸、子葉等，但是普遍存在誘導(dǎo)率較低的問題。筆者以三倍體無籽西瓜的子葉節(jié)為外植體，不定芽誘導(dǎo)率高達(dá)83.32%、分化系數(shù)達(dá)6.11，說明子葉節(jié)是適宜建立三倍體無籽西瓜再生體系的外植體類型，這與張慧君等[7]在甜瓜上的研究結(jié)論是一致的。

6-BA是三倍體無籽西瓜再生體系建立過程中必不可少的激素，其濃度對(duì)誘導(dǎo)率的高低及芽的質(zhì)量起決定性作用，濃度較低時(shí)不定芽誘導(dǎo)率低，過高時(shí)則容易形成葉叢芽，不利于后期成苗。適宜質(zhì)量濃度的NAA或KT均能誘導(dǎo)不定芽的伸長，但以0.2 mg·L-1的KT進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，不定芽生長健壯、基部無愈傷組織形成，有利于后期嫁接成活，這與肖守華等[8]的結(jié)論一致。

接穗長度是影響嫁接苗成活率的關(guān)鍵因子[9]，筆者將經(jīng)過適應(yīng)性鍛煉后、長度2.5 cm左右的不定芽嫁接到子葉剛展平的南瓜砧木上，嫁接成活率高達(dá)84.4%，并且此方法省去了試管苗誘導(dǎo)生根、煉苗移栽、馴化成活等步驟，提高了生產(chǎn)效率，能有效應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。試驗(yàn)過程中也發(fā)現(xiàn)一些問題，如部分試管苗莖稈較實(shí)生苗粗壯，作為接穗時(shí)不能緊密的插入砧木，造成試管苗嫁接利用率低；試管苗生產(chǎn)周期長、嫁接后緩苗時(shí)間長等問題有時(shí)會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)出的嫁接苗趕不上農(nóng)時(shí)，制約了該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用。提高接穗可利用率、簡化嫁接程序及加強(qiáng)嫁接后管理需進(jìn)一步深入探究。

本研究結(jié)果表明，以三倍體無籽西瓜子葉節(jié)為外植體可建立高效的再生體系，其最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為2.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA，不定芽分化系數(shù)最高可達(dá)6.11。誘導(dǎo)獲得的不定芽在MS+ 0.2 mg·L-1KT的培養(yǎng)基中生長迅速且狀態(tài)好，有利于后期的嫁接。將長度為2.5 cm的接穗嫁接到子葉剛展平的南瓜砧木上，成活率高達(dá)84.40%。本試驗(yàn)成功建立了三倍體無籽西瓜子葉節(jié)再生及嫁接育苗技術(shù)體系，在降低三倍體無籽西瓜生產(chǎn)用種量、簡化育苗程序、工廠化生產(chǎn)嫁接苗、提高品種純度等方面奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也可為西瓜基因工程相關(guān)研究提供參考。

[1] 劉文革，何楠，趙勝杰，等．我國三倍體無籽西瓜的周年生產(chǎn)與栽培[J]．長江蔬菜，2014（14）：1-6．

[2] 趙姜．中國西瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的經(jīng)濟(jì)學(xué)分析[D]．北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2013．

[3] 王闖，李中勇，劉敏，等．無籽西瓜莖段組織培養(yǎng)與嫁接育苗技術(shù)研究[J]．中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2010，26（5）：189-192．

[4] 湯月豐，周泉，馬陸平．無籽西瓜組織培養(yǎng)與嫁接育苗技術(shù)研究[J]．湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006（5）：43-44．

[5] 許念芳，劉少軍，藏傳江，等．無籽西瓜的組培快繁技術(shù)研究[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，45（7）：12-14．

[6] 閻志紅，劉文革，趙勝杰，等．四倍體西瓜子葉植株再生試驗(yàn)[J].中國果樹，2007（6）：28-31．

[7] 張慧君，高鵬，欒非時(shí)．甜瓜自交系離體子葉節(jié)再生體系的建立[J]．江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（3）：50-52．

[8] 肖守華，李國生，焦自高，等．西瓜高效再生體系的建立[J]．中國瓜菜，2010，23（3）：11-14．

[9] 李建欣，龐淑敏，李建吾，等．黃瓜組織培養(yǎng)與組培苗嫁接研究[J]．農(nóng)業(yè)科技通訊，2012（2）：60-63．

·書訊·

《甜瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所主持編寫，并得到了全國甜瓜科研、教學(xué)和生產(chǎn)單位的大力支持。甜瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的制定是國家農(nóng)作物種質(zhì)資源平臺(tái)建設(shè)的重要內(nèi)容，共分三大部分，其中甜瓜種質(zhì)資源描述規(guī)范規(guī)定了甜瓜種質(zhì)資源的描述符及其分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，以便對(duì)甜瓜種質(zhì)資源進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化整理和數(shù)字化表達(dá)。甜瓜種質(zhì)資源數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了甜瓜種質(zhì)資源各描述符的字段名稱、類型、長度、小數(shù)位、代碼等，以便建立統(tǒng)一的、規(guī)范的甜瓜種質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫。甜瓜種質(zhì)資源數(shù)據(jù)質(zhì)量控制規(guī)范規(guī)定了甜瓜種質(zhì)資源數(shù)據(jù)采集全過程中的質(zhì)量控制內(nèi)容和質(zhì)量控制方法，以保證數(shù)據(jù)的系統(tǒng)性、可比性和可靠性。

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Establishment of the cotyledon node regeneration system and vitrografting technology in triploid seedless watermelon

MIN Ziyang，RUAN Wanhui，ZHANG Yi，ZHU Feiying，XIAO Jiling，LI Jiguang，LIU Jianxiong，LIANG Zhihuai
（Hunan Watermelon and Muskmelon Institute，Changsha 410125，Hunan，China）

In this paper，we used seedless watermelon‘Chaoting No.3’cotyledonary node as explants for the establish?ment of seedless watermelon cotyledon node regeneration and grafting breeding technology system to investigate the key fac?tors affecting cotyledon node regeneration in vitro and the grafting seedling techniques.The result showed that 3%of sodium hypochlorite solution of 18 min was the best disinfection technique to seedless embryo.2.5 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA had the best adventitious bud induction in seedless watermelon，the differentiation coefficient of adventitious bud was as high as 6.11.0.2 mg·L-1KT could effectively induce adventitious bud to elongate.Scions with 2.5 cm in length which were grated to pumpkin root stocks with flatted cotyledon had the the highest survival rate(84.4%).In the experiment，we suc?cessfully established the system of cotyledon node regeneration and vitro-grafting technology in triploid seedless watermelon.

Seedless watermelon；Triploid；Cotyledon node；Regeneration system；Grafting

2016-05-21；

2016-10-17

湖南省科技廳重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2015NK3047）;湖南省科技廳重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2016NK2193）;國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201503110-03）

閔子揚(yáng)，男，研究實(shí)習(xí)員。主要從事葫蘆科蔬菜倍性育種相關(guān)研究。E-mail：minziyang1220@163.com

梁志懷，男，研究員。主要從事植物病理學(xué)相關(guān)研究。E-mail：1178640839@qq.com